三维培养中磷脂介质诱导的转化

摘要

本实验方案描述了3D培养体系的建立方法 '在非转化型乳腺上皮细胞系 MCF10A 的上层培养物中，该细胞系经改造用于研究血小板活化因子（Platelet Activating Factor, PAF）诱导的转化。采用免疫荧光技术评估转化情况，并对此进行详细讨论。

摘要

已开发出多种癌症研究模型，例如啮齿类动物模型和永生化细胞系。利用这些模型开展的研究为致癌机制提供了宝贵的见解。细胞系有助于阐明与乳腺肿瘤发生相关的分子信号通路失调机制，而啮齿类动物模型则被广泛用于研究乳腺癌的细胞与分子特征 体内 建立乳腺上皮细胞和癌细胞的三维培养体系有助于弥合传统二维培养与体内真实生理环境之间的差距 体内 和 体外 通过模拟模型 体内 条件 体外该模型可用于理解乳腺癌发生过程中复杂的分子信号事件失调以及细胞特征的变化。本研究改进了一种三维培养系统，用于研究磷脂类介质（血小板活化因子，PAF）诱导的转化过程。免疫调节因子及其他分泌分子在乳腺肿瘤的发生与进展中发挥重要作用。在本研究中，乳腺上皮细胞的三维腺泡培养物经PAF处理后，表现出极性丧失和细胞特征改变等转化特征。该三维培养系统将有助于揭示肿瘤微环境中多种小分子实体所诱导的遗传性和/或表观遗传性扰动。此外，该系统还可为发现参与转化过程的新基因及已知基因提供研究平台。

引言

有多种模型可用于研究癌症的进展，每种模型均具有独特性，代表了这种复杂疾病的某一亚型。每种模型均可为癌症生物学提供独特而有价值的信息，并改进了模拟实际疾病状态的方法。以单层形式培养的已建立细胞系，已为诸多关键生物学过程提供了重要见解 体外 例如增殖、侵袭性、迁移和凋亡¹尽管二维（2D）细胞培养一直是研究哺乳动物细胞对多种环境扰动反应的传统工具，但将这些研究结果外推以预测组织水平的反应似乎缺乏足够的说服力。二维培养的主要局限在于其所构建的微环境与乳腺组织本身的微环境存在显著差异。²二维培养缺乏细胞与细胞外基质之间的相互作用，而这种相互作用对任何组织的生长都至关重要。此外，单层培养中的细胞所经历的张力会阻碍细胞的极性，从而改变细胞信号传导和行为。^3,4,5三维（3D）培养系统因其能够模拟肿瘤微环境，在癌症研究领域开辟了新的途径 体内 条件 体外 在二维细胞培养中丢失的许多关键微环境信号可通过富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）三维培养重新建立⁶.

多项研究已证实肿瘤微环境在致癌过程中的重要性

方案

1. 在lrECM中接种MCF10A细胞

1. 在培养基中培养 MCF10A 细胞（贴壁型乳腺上皮细胞），每 4 天传代一次。
   注意：培养基成分：高糖 DMEM（不含丙酮酸钠），添加马血清（5%）、胰岛素（10 µg/mL）、氢化可的松（0.5 µg/mL）、表皮生长因子 EGF（20 ng/mL）、霍乱毒素（100 ng/mL）以及青霉素-链霉素（100 单位/mL）（参见 材料表）。
2. 实验开始前 20 分钟将 lrECM（参见 材料表）置于冰上解冻。通常将细胞接种当天记为第 0 天。
3. 消化细胞时，吸除培养基，用 2 mL PBS 洗涤一次，加入 900 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育约 15 分钟，或直至细胞完全消化脱落。
4. 在八孔腔载玻片（参见 材料表）的八个孔中制备 lrECM 基质层。
   1. 在细胞消化过程中，每孔加入 60 µL lrECM 进行包被，并置于 37 °C CO₂ 培养箱中孵育，时间不超过 15 分钟。
5. 按以下步骤制备细胞悬液。
   1. 待细胞完全脱落之后，加入 5 mL 重悬培养基以终止胰蛋白酶活性，于 25 °C、112 × g 离....

结果

MCF10A 细胞在暴露于 PAF 处理后，会形成具有显著不同表型的腺泡结构。α6-整合素出现错位定位，顶端染色增强。少数腺泡还表现出不连续的染色模式（图 2A）。这两种表型均表明基底极性的丧失，这在文献中已有证据支持^24,25。先前的研究报道了 α6-整合素在癌症转移中的作用存在争议。α6-整合素以二聚体形式存在，可与 β1- 或 β4-整合素结合。其中 α6β4 亚基被发现对上皮细胞中半桥粒的形成具有重要作用²⁶。该整合素的下调已在前列腺癌及某些乳腺癌病例中发现，特别是在乳腺导管癌（III 级）中观察到 α6β4-整合素的缺失。这种缺失表型出现在向实质组织和胸膜腔转移的细胞中^27,28,29。GM130 是一种定位于顺面高尔基.......

讨论

基于已建立的细胞系的模型被广泛用于研究癌变过程。细胞的单层培养仍为揭示介导癌细胞特征性变化的各种分子信号通路提供了重要见解。³²关于Ras、Myc和突变型p53等著名癌基因作用的研究，最初是采用单层培养作为模型系统进行报道的^33,34,35,36然而，二维培养模型缺乏许多存在于三维环境中的重要结构和功能参数 体内 二维培养中的药物筛选研究常在较低浓度下即表现出显著反应（如细胞死亡或靶点抑制），而在小鼠体内给药时却未能显示出显著效果³⁷造成这一现象的主要原因是二维单层培养中药物的可获得性和摄取存在差异。 与3D 培养³⁸.

在过去十年中，三维培养技术已成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 EDTA	Invitrogen	25300062
16% 多聚甲醛	Alfa Aesar	AA433689M
抗小鼠 Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
抗兔 Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
腔室载玻片	Nunc	155409
霍乱毒素	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL 溶于 dH2O
共聚焦显微镜	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL 溶于 dH2O
山羊来源的抗小鼠抗原抗体的 F(ab’)2 片段	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 抗体	Abcam	ab52649
山羊血清	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
马血清	Gibco	16050122
氢化可的松	Sigma	H0888	1 mg/mL 溶于乙醇
图像处理软件	ImageJ
胰岛素	Sigma	I1882	10 mg/mL 储存液，溶于 dH2O
lrECM（Matrigel）	Corning	356231
封片剂（Slow fade Gold 抗荧光淬灭剂）	Invitrogen	S36937
核染色剂 （Hoechst）	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	甲基氨基甲酰 PAF C-16，以 10 mg/mL 溶于乙醇的形式购得
青霉素-链霉素	Lonza	17-602E
叠氮化钠	Sigma	S2002
Tris 碱	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
波形蛋白抗体	Abcam	ab92547
α6-整合素抗体	Millipore	MAB1378