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方法文章

三维培养中磷脂介质诱导的转化

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DOI：

10.3791/64146

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2022年7月27日

 ,  ,  , 
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research, 2Department of Biology, Center for Genomics and Systems Biology, New York University, 3Enveda Therapeutics India Pvt Ltd.

本文内容

摘要

本实验方案描述了3D培养体系的建立方法 '在非转化型乳腺上皮细胞系 MCF10A 的上层培养物中，该细胞系经改造用于研究血小板活化因子（Platelet Activating Factor, PAF）诱导的转化。采用免疫荧光技术评估转化情况，并对此进行详细讨论。

摘要

已开发出多种癌症研究模型，例如啮齿类动物模型和永生化细胞系。利用这些模型开展的研究为致癌机制提供了宝贵的见解。细胞系有助于阐明与乳腺肿瘤发生相关的分子信号通路失调机制，而啮齿类动物模型则被广泛用于研究乳腺癌的细胞与分子特征 体内 建立乳腺上皮细胞和癌细胞的三维培养体系有助于弥合传统二维培养与体内真实生理环境之间的差距 体内 和 体外 通过模拟模型 体内 条件 体外该模型可用于理解乳腺癌发生过程中复杂的分子信号事件失调以及细胞特征的变化。本研究改进了一种三维培养系统，用于研究磷脂类介质（血小板活化因子，PAF）诱导的转化过程。免疫调节因子及其他分泌分子在乳腺肿瘤的发生与进展中发挥重要作用。在本研究中，乳腺上皮细胞的三维腺泡培养物经PAF处理后，表现出极性丧失和细胞特征改变等转化特征。该三维培养系统将有助于揭示肿瘤微环境中多种小分子实体所诱导的遗传性和/或表观遗传性扰动。此外，该系统还可为发现参与转化过程的新基因及已知基因提供研究平台。

引言

有多种模型可用于研究癌症的进展，每种模型均具有独特性，代表了这种复杂疾病的某一亚型。每种模型均可为癌症生物学提供独特而重要的见解，并改进了模拟实际疾病状态的方法。以单层形式培养的已建立细胞系已为诸多关键生物学过程提供了重要认识 体外 例如增殖、侵袭性、迁移和凋亡1尽管二维（2D）细胞培养一直是研究哺乳动物细胞对多种环境扰动反应的传统工具，但将这些发现外推以预测组织水平的反应似乎缺乏足够的说服力。二维培养的主要局限在于其所构建的微环境与乳腺组织本身的微环境存在显著差异。2二维培养缺乏细胞与细胞外基质之间的相互作用，而这种相互作用对任何组织的生长都至关重要。此外，单层培养中的细胞所承受的张力会阻碍细胞的极性，从而改变细胞信号传导和行为。3,4,5三维（3D）培养系统因其能够模拟肿瘤微环境，在癌症研究领域开辟了新的途径 体内 条件 体外 在二维细胞培养中丢失的许多关键微环境信号可通过富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）三维培养重新建立6.

多项研究已证实肿瘤微环境在致癌过程中的重要性7,8。与炎症相关的因子是微环境的重要组成部分。血小板活化因子（Platelet Activating Factor, PAF）是一种由多种免疫细胞分泌的磷脂类介质，可介导多种免疫反应9,10。不同的乳腺癌细胞系均可分泌高水平的PAF，并与细胞增殖增强相关11。本实验室的研究表明，在腺泡培养体系中长期存在PAF可导致乳腺上皮细胞发生转化12。PAF通过激活其受体（PAFR），进而激活PI3K/Akt信号通路13。已有报道指出，PAFR还与上皮-间质转化（EMT）、侵袭和转移相关14。

本方案展示了一种用于研究PAF诱导转化的模型系统，采用乳腺上皮细胞的3D培养，如Chakravarty等人先前所述。12在细胞外基质上生长的乳腺上皮细胞（三维培养）倾向于形成极化且生长停滞的球状结构，这些结构被称为腺泡，与乳腺组织中的腺泡高度相似，后者是乳腺的最小功能单位。 体内15. 这些球状体（图1A，B由紧密排列的极化上皮细胞单层构成，围绕一个中空腔并与基底膜相连（图1C）。这一形态发生过程在文献中已有详尽描述16当接种于lrECM上时，细胞会进行分裂和分化，形成细胞簇，并从第4天开始发生极化。到第8天，腺泡结构由一层与细胞外基质直接接触的极化细胞以及被外层极化细胞包裹在内的非极化细胞簇组成，后者不与基质接触。这些非极化细胞在培养至第12天时会发生凋亡，从而形成中空的管腔。到第16天，形成生长停滞的结构。16.

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图1：用核染料染色的腺泡细胞核。（A）腺泡的三维结构。（B） MCF10A 腺泡在 Matrigel 上培养 20 天后的相差图像。（C）最中心的切面显示存在中空的腔。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

与二维培养不同，腺泡培养可通过明显的形态学变化来区分正常细胞与转化细胞。未转化的乳腺上皮细胞会形成具有中空腔的腺泡结构，模拟正常人体乳腺腺泡。这些球状结构在发生转化后，表现出形态紊乱的特征，包括极性显著丧失（癌症的标志性特征之一）、腔隙缺失或中空腔隙的破坏（由于逃避凋亡所致），这些变化可能由多种基因的失调所引发17,18,19,20。这些转化过程可通过免疫荧光等常用技术进行研究。因此，三维细胞培养模型可作为研究乳腺腺泡形态发生及乳腺癌发生过程的简便方法。建立三维培养系统以理解磷脂介质PAF的作用，将有助于高通量的临床前药物筛选。

本研究采用了3D“顶部”培养方案16,21，用于研究PAF诱导的转化过程22。通过免疫荧光技术，观察了腺泡暴露于磷脂介质后所引发的表型变化。研究中使用了多种极性及上皮-间质转化（EMT）标志物12,16。表1列出了这些标志物在正常情况下的定位及其在发生转化后的预期表型。

抗体标记正常定位转化表型
α6-Integrin基底外侧基底侧着色，侧膜着色较弱强侧膜/顶膜着色
β-Catenin细胞间连接基底外侧异常定位 / 核内或胞质内定位
VimentinEMT缺失 / 微弱表达上调

表1：本研究中使用的标记物。 在有无PAF处理条件下，不同标记物的定位情况。

该方法可最优用于研究或筛选针对多种乳腺癌亚型的潜在药物和靶基因，从而提供更接近真实的药物反应数据 体内 该系统有助于加速并提高药物研发的可靠性，还可用于研究与药物反应及药物耐药性相关的分子信号通路。

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方案

1. 在lrECM中接种MCF10A细胞

  1. 在培养基中培养 MCF10A 细胞（贴壁型乳腺上皮细胞），每 4 天传代一次。
    注意：培养基成分：高糖 DMEM（不含丙酮酸钠），添加马血清（5%）、胰岛素（10 µg/mL）、氢化可的松（0.5 µg/mL）、表皮生长因子 EGF（20 ng/mL）、霍乱毒素（100 ng/mL）以及青霉素-链霉素（100 单位/mL）（参见 材料表）。
  2. 实验开始前 20 分钟将 lrECM（参见 材料表）置于冰上解冻。通常将细胞接种当天记为第 0 天。
  3. 消化细胞时，吸除培养基，用 2 mL PBS 洗涤一次，加入 900 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育约 15 分钟，或直至细胞完全消化脱落。
  4. 在八孔腔载玻片（参见 材料表）的八个孔中制备 lrECM 基质层。
    1. 在细胞消化过程中，每孔加入 60 µL lrECM 进行包被，并置于 37 °C CO2 培养箱中孵育，时间不超过 15 分钟。
  5. 按以下步骤制备细胞悬液。
    1. 待细胞完全脱落之后，加入 5 mL 重悬培养基以终止胰蛋白酶活性，于 25 °C、112 × g 离心 10 分钟。
      注意：重悬培养基成分：高糖 DMEM（不含丙酮酸钠），添加马血清（20%）和青霉素-链霉素（100 单位/mL）。
    2. 吸除上清液，将细胞重悬于 2 mL 检测培养基中，充分混匀以确保形成单细胞悬液。
      注意：检测培养基成分：高糖 DMEM（不含丙酮酸钠），添加马血清（2%）、氢化可的松（0.5 µg/mL）、霍乱毒素（100 ng/mL）、胰岛素（10 µg/mL）以及青霉素-链霉素（100 单位/mL）。
    3. 使用血细胞计数板对细胞计数，并计算每孔接种 6 × 103 个细胞所需的细胞悬液体积。
      注意：通常建议在计算时额外多计一孔，以补偿可能的移液误差。
    4. 根据所需孔数，用覆盖培养基稀释细胞悬液。
      注意：单孔覆盖培养基的组成为：400 µL 检测培养基、8 µL lrECM（终浓度 2%）和 0.02 µL 100 µg/mL EGF（终浓度 5 ng/mL）。
  6. 进行细胞接种。
    1. 将 400 µL 稀释后的细胞悬液加入已制备好的 lrECM 基质层（步骤 1.4）中，注意避免扰动 lrECM 层。置于 37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中孵育。

2. PAF 处理

  1. 在细胞接种后3小时加入PAF。用PBS配制100 µM的PAF储备液，每孔加入0.2 µL（相当于终浓度为200 nM）。
  2. 每次更换培养基时均加入相同浓度的PAF。

3. 用新鲜培养基重新喂养

  1. 每4天更换一次新鲜培养基（即第4天、第8天、第12天和第16天）。

4. 免疫荧光研究以检测长期PAF暴露诱导的表型变化

  1. 培养 20 天后，小心地用移液器吸出每孔中的培养基，并用 400 µL 预热的 PBS 洗涤各孔。
  2. 通过向每孔加入 400 µL 4% 多聚甲醛（用 1× PBS 稀释 16% 多聚甲醛新鲜配制）并在室温下孵育 20 分钟，固定腺泡结构。
  3. 用冰冷的 PBS 洗涤孔板一次，然后在 4 °C 下用含 0.5% Triton X-100 的 PBS 透化处理 10 分钟。
  4. 10 分钟后，立即但小心地吸出 Triton X-100 溶液，并用 400 µL PBS-甘氨酸（在 1× PBS 中加入少量甘氨酸新鲜配制）冲洗。重复此步骤三次，每次 15 分钟。
  5. 加入 400 µL 主要封闭液（含 10% 山羊血清（见材料表）的免疫荧光（IF）缓冲液），在室温下孵育 60 分钟。
    注：IF 缓冲液的组成：0.05% 叠氮化钠、0.1% BSA、0.2% Triton X-100 和 0.05% Tween-20（溶于 1× PBS）。
  6. 移除主要封闭液，加入 200 µL 用主要封闭液配制的 2% 二抗封闭液（山羊抗小鼠抗原的 F(ab')2 抗体片段，见材料表），在室温下孵育 45–60 分钟。
  7. 将一抗（见材料表）用 2% 二抗封闭液按 1:100 稀释。吸除二抗封闭液后，加入新鲜配制的一抗溶液，在 4 °C 下过夜孵育。
  8. 上一步可能导致基底膜液化。在继续实验前，需等待载玻片恢复至室温。小心吸出一抗溶液，并用 400 µL IF 缓冲液洗涤三次。
  9. 在最后一次 IF 缓冲液洗涤过程中，将荧光标记的二抗（见材料表）用主要封闭液按 1:200 稀释。将载玻片置于二抗溶液中，在室温下孵育 40–60 分钟。
  10. 用 400 µL IF 缓冲液冲洗载玻片 20 分钟，随后用 PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
  11. 在室温下用含 0.5 ng/mL 核染料（见材料表）的 PBS 对细胞核进行复染 5–6 分钟。用 400 µL PBS 洗涤三次，以去除多余的染料。
  12. 小心吸净全部 PBS，确保彻底去除残留液体。向每孔中加入一滴封片试剂（见材料表），并在室温下静置过夜。
  13. 将载玻片在室温下保存，并尽快进行成像。
  14. 在共聚焦显微镜（见材料表）下以 40× 或 63× 放大倍数进行成像，设置光学 Z 轴步长为 0.6 mm（NA = 1.4）。
  15. 使用图像处理软件（见材料表）打开获取的图像，并通过三维投影展示形态学差异。
    注：最中心的光学 Z 切片最适合展示极性标志物定位的差异。可通过手动定量分析，表示呈现特定染色模式的球状体所占百分比。
  16. 为说明蛋白表达水平的差异，可进行半定量分析，测量平均灰度值或计算校正总细胞荧光强度（CTCF）23。数据以小提琴图或点图形式呈现。

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结果

MCF10A 细胞在暴露于 PAF 处理后，会形成具有非常显著表型的腺泡结构。α6-整合素出现错位定位，表现为更多的顶端染色，部分腺泡还显示出不连续的染色模式（图 2A）。这两种表型均表明基底极性的丧失，这在文献中已有证据支持24,25。早期研究报道了α6-整合素在癌症转移中的作用存在争议。α6-整合素以二聚体形式存在，可与β1-或β4-整合素结合。其中，α6β4亚单位被发现对上皮细胞中半桥粒的形成具有重要作用26。该整合素的下调已在前列腺癌及某些乳腺癌病例中被发现，特别是在乳腺导管癌（III级）中观察到α6β4-整合素的缺失。这种缺失表型出现在向实质组织和胸膜腔转移的细胞中27,28,29。GM130 是一种定位于顺式高尔基体的...

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讨论

基于已建立的细胞系的模型被广泛用于研究癌变过程。细胞的单层培养仍为揭示介导癌细胞特征性变化的各种分子信号通路提供了重要见解。32关于Ras、Myc和突变型p53等著名癌基因作用的研究，最初是采用单层培养作为模型系统进行报道的33,34,35,36然而，二维培养模型缺乏许多存在于三维环境中的重要结构和功能参数 体内 二维培养中的药物筛选研究常在较低浓度下即表现出显著反应（如细胞死亡或靶点抑制），而在小鼠体内给药时却未能显示出显著效果37造成这一现象的主要原因是二维单层培养中药物的可获得性和摄取存在差异。 与3D 培养38.

在过去十年中，三维培养技术已成...

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披露

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

感谢印度科学教育与研究所浦那分校显微镜设施中心提供设备、基础设施以及对实验的支持。本研究获得了印度生物技术部（DBT）资助（BT/PR8699/MED/30/1018/2013）、印度政府科学与工程研究委员会（SERB）资助（EMR/2016/001974）以及印度科学教育与研究所浦那分校核心经费的部分支持。A. K. 获得印度科学与工业研究理事会（CSIR）高级研究学者奖学金资助，L. A. 获得印度科学技术部（DST）INSPIRE 奖学金资助，V. C. 获得生物技术部（DBT）资助（BT/PR8699/MED/30/1018/2013）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶 EDTAInvitrogen25300062
16% 多聚甲醛Alfa AesarAA433689M
抗小鼠 Alexa Flour 488InvitrogenA11029
抗兔 Alexa Flour 488InvitrogenA-11008
BSASigmaA7030
腔室载玻片Nunc155409
霍乱毒素SigmaC8052-1MG1 mg/mL 溶于 dH2O
共聚焦显微镜LeicaLeica SP8
DMEMGibco11965126
EDTASigmaE6758
EGFSigmaE9644-0.2MG100 mg/mL 溶于 dH2O
山羊来源的抗小鼠抗原抗体的 F(ab’)2 片段Jackson Immunoresearch115-006-006
GM130 抗体Abcamab52649
山羊血清Abcamab7481
HoechstInvitrogen33258
马血清Gibco16050122
氢化可的松SigmaH08881 mg/mL 溶于乙醇
图像处理软件ImageJ
胰岛素SigmaI188210 mg/mL 储存液，溶于 dH2O
lrECM（Matrigel）Corning356231
封片剂（Slow fade Gold 抗荧光淬灭剂）InvitrogenS36937
核染色剂 （Hoechst）Invitrogen33258
PAFCayman Chemicals91575-58-5甲基氨基甲酰 PAF C-16，以 10 mg/mL 溶于乙醇的形式购得
青霉素-链霉素Lonza17-602E
叠氮化钠SigmaS2002
Tris 碱SigmaB9754
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
波形蛋白抗体Abcamab92547
α6-整合素抗体MilliporeMAB1378

参考文献

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