体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测

摘要

在本实验方案中，通过向测试动物模型的面静脉注射不同分子量的荧光示踪剂，评估下颌下腺（SMG）的内皮屏障功能。 体内 在双光子激光扫描显微镜下。

摘要

唾液在口腔及整体健康中发挥着重要作用。血管完整的内皮屏障功能能够促进唾液分泌，而内皮屏障功能障碍则与多种唾液腺分泌疾病相关。本方案描述了一种 体内 用于评估小鼠下颌下腺（SMG）内皮紧密连接（TJs）功能的旁细胞通透性检测方法。首先，将不同分子量的荧光标记葡聚糖（4 kDa、40 kDa 或 70 kDa）注射至小鼠眶静脉。随后，取单侧 SMG 组织，置于定制夹持装置中，在双光子激光扫描显微镜下进行固定，并采集血管、腺泡及导管的图像。利用该方法，可实时动态监测不同大小示踪剂从血管泄漏至腺泡基底侧，甚至穿过腺泡上皮进入导管的过程，从而评估生理或病理生理条件下内皮屏障功能的变化。

引言

多种唾液腺可分泌唾液，唾液主要作为抵御感染的第一道防线，并有助于消化，因此在口腔及整体健康中发挥着至关重要的作用¹。血液供应对唾液腺分泌至关重要，因为它持续提供水分、电解质以及形成初级唾液的分子。由紧密连接（tight junction, TJ）复合体调控的内皮屏障功能严格而精细地限制了毛细血管的通透性，而毛细血管通常对水、溶质、蛋白质甚至从循环血管进入唾液腺组织的细胞具有高度通透性^2,3。我们先前发现，胆碱能刺激可导致内皮TJ开放，从而促进唾液分泌；而在干燥综合征中，内皮屏障功能受损则与下颌下腺（submandibular glands, SMGs）的分泌减少和淋巴细胞浸润密切相关⁴。这些数据表明，在多种唾液腺疾病的研究中，应充分重视内皮屏障功能的作用。

双光子激光扫描显微镜是观察完整组织中细胞动态的有力工具 体内该技术的优点之一是，当使用近红外光（NIR）激发样本时，近红外光比可见光或紫外光具有更深的组织穿透能力，并且在适当条件下不会对组织造成明显的光损伤。^5,6事实上，唾液腺是一种高度均质且位置表浅的组织，其表面的腺泡细胞距离....

方案

所有实验程序均经北京大学医学部动物研究伦理委员会批准，并符合《实验动物护理与使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）。本研究采用 8 至 10 周龄的雄性野生型（WT）小鼠。实验动物均得到妥善处理，以尽量减少其疼痛与不适。

1. 动物实验操作

1. 准备并施用麻醉剂和示踪剂。
   1. 在整个研究过程中保持无菌条件，并通过高压灭菌对器械进行消毒。将小鼠分为两组。
      注意：对照组不做任何处理，另一组则进行单侧颌下腺导管结扎1天，作为实验组。分组时应选择体重和年龄相近的小鼠，以减少体重和年龄对血管通透性的影响。
   2. 选择合适的示踪剂，例如异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（分子量：4 kDa；FD4）和罗丹明B标记的葡聚糖（分子量：70 kDa；RD70）（见材料表），其激发/发射光谱不同，以便在通透性检测中最小化荧光信号之间的干扰（分别使用FITC或罗丹明B滤光片）。
      注意：FD4和RD70的激发波长分别为488 nm和594 nm，所选发射波长分别为511–564 nm和617–669 nm。
   3. 将示踪剂用无菌磷酸盐缓冲液（1× PBS）稀释成100 mg/mL的储备液，并将分装样品避光保存于−20 °C。
      注意：分子量为4 kDa的葡聚糖即使在无病理状态下....

结果

按照实验方案，将单侧下颌下腺固定于自制的支架上，并尽可能使腺体远离小鼠身体，以防止呼吸运动引起成像伪影。在显微镜下可观察到血管中红细胞（黑色点状）的快速流动。在通过目镜找到组织视野后，需切换至显微镜软件进行操作。在对照组中，两种示踪剂均存在于小鼠下颌下腺的血管内。特别是由于FD4分子量较小，能够从血管渗出至腺泡和导管的基底侧，从而清晰地勾勒出腺泡和导管的形态（如A和D在图2A中所示）。相比之下，分子量较高的葡聚糖（如40 kDa和70 kDa）则无法清晰区分下颌下腺的形态结构。实际上，RD70主要分布在大血管和微血管中。在导管结扎组中，FD4和RD70均渗出至腺泡的基底侧，表明导管结扎可破坏血管内皮屏障功能，从而增加对大分子物质的通透性。半定量的FD4和RD70荧光强度结果也证实了上述现象（图2B）。此外，血管直径增大，表明结扎导管1天即可诱导血管扩张。进一步地，三维图像显示结扎组血管周围FD4和RD70的荧光信号更加弥散模糊（

讨论

内皮屏障功能的维持与调控对血管稳态至关重要。内皮细胞及其细胞间连接在维持和调控血管完整性方面发挥着关键作用¹²。血流的剪切力、生长因子以及炎症因子均可引起血管通透性的改变，从而参与高血压、糖尿病和自身免疫性疾病等全身性疾病的發生与发展^13,14,15。唾液腺的血管分布和血流量在所有器官和组织中位居前列，但针对唾液腺血管系统的研究尚未广泛开展。对唾液腺血管、特别是内皮屏障功能进行更深入和全面的研究，将为揭示唾液分泌机制提供新的线索，并推动血管生物学的发展。

这 体内 双光子激光扫描显微技术可通过静脉注射荧光染料，在不牺牲动物的情况下定量评估血管通透性。使用不同分子量或尺寸的荧光标记葡聚糖与微球，可更准确地评估内皮损伤程度。同时，通过活体血管通透性评价系统可实时测定血管通透性的动态动力学变化。另一优势在于能够清晰区分不同类型血管，如微动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双光子显微镜（TCS-SP8 DIVE）	Leica, Germany
4 kDa FITC标记的葡聚糖	Sigma Aldrich	46944
70 kDa 罗丹明B标记的葡聚糖	Sigma Aldrich	R9379
钝性组织分离镊（镍制）	北京华博公司	NZW28
脱毛膏	Veet
一次性无菌注射器	志玉公司		1 mL
Image J 软件	美国国立卫生研究院
胰岛素注射器	Becton, Dickinson and Company	0253316	1 mL
Leica Application Suite X 软件	Leica Microsystems
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
1×磷酸盐缓冲液	Servicebio	G4207-500
组织剪刀	北京华博公司	M286-05
三溴乙醇	JITIAN Bio	JT0781