远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

摘要

本文介绍了一种通过荧光流式细胞术定量检测化疗药物在细胞培养或小鼠肿瘤模型中诱导的衰老癌细胞的实验方案。可选步骤包括共免疫染色、样本固定以方便大批量或多个时间点的分析，以及通过流式细胞分选富集存活的衰老细胞。

摘要

细胞衰老是一种由生物损伤诱导的增殖停滞状态，通常在衰老细胞中随着年龄增长历经数年逐渐积累，但也可能在肿瘤细胞中迅速出现，作为对多种癌症治疗所诱导损伤的应答。肿瘤细胞的衰老通常被认为是一种不利现象，因为衰老细胞会获得抗凋亡特性，阻碍肿瘤缓解，并加剧肿瘤的恶性程度和治疗耐药性。因此，识别衰老的肿瘤细胞一直是癌症研究领域关注的重点。目前已存在多种衰老检测方法，其中许多基于一种广为人知的衰老标志物——衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性。

通常，SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测使用显色底物（X-Gal）在固定细胞上进行，通过光学显微镜对“蓝色”的衰老细胞进行缓慢且主观的计数。近年来，已开发出改进的检测方法，采用细胞通透性荧光SA-β-Gal底物，如C₁₂-FDG（绿色）和DDAO-半乳糖苷（DDAOG；远红光），可实现对活细胞的分析，并适用于包括流式细胞仪在内的高通量荧光分析平台。C₁₂-FDG是SA-β-Gal的一种已有充分文献记录的探针，但其绿色荧光发射光谱与细胞固有的自发荧光（AF）重叠，而这种自发荧光在衰老过程中会因脂褐素聚集体的积累而增强。通过使用远红光SA-β-Gal探针DDAOG，可将绿色自发荧光作为第二个参数用于确认细胞衰老状态，从而提高检测的可靠性。其余的荧光通道可用于细胞活力染色或可选的荧光免疫标记。

利用流式细胞术，我们展示了使用 DDAOG 和脂褐素自发荧光作为双参数检测方法来鉴定衰老的肿瘤细胞。可对存活衰老细胞的百分比进行定量分析。根据需要，可选择性加入免疫标记步骤，以检测特定的细胞表面抗原。鉴定出的衰老细胞还可通过流式细胞术进行分选和收集，用于后续分析。收集到的衰老细胞可立即裂解（例如用于免疫检测或组学分析），也可进一步培养。

引言

衰老细胞通常在正常生物衰老过程中随着时间推移在生物体内逐渐积累，但也可能在肿瘤细胞中因放疗和化疗等癌症治疗所诱导的损伤而迅速形成。尽管治疗诱导的衰老（TIS）肿瘤细胞已失去增殖能力，但仍可能促进治疗耐药性并导致肿瘤复发^1,2,3。TIS细胞分泌的因子可通过促进免疫逃逸或转移来加剧肿瘤的恶性程度^4,5。TIS细胞会发展出复杂的、依赖于微环境的表型，代谢谱发生改变，并产生独特的免疫应答^6,7,8。因此，识别和表征由不同癌症治疗手段诱导的TIS肿瘤细胞，一直是癌症研究领域持续关注的课题。

为了检测TIS肿瘤细胞，常规的衰老检测方法被广泛应用，其主要原理是检测衰老标志酶——溶酶体β-半乳糖苷酶GLB1活性的升高⁹。在接近中性（而非酸性）的溶酶体pH条件下进行检测，可特异性地识别与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）

方案

所有所述动物实验均已获得芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 储备液的配制与保存

注意：如果细胞需要进行流式分选，所有溶液均应采用无菌技术配制，并通过0.22 µm滤器过滤。

1. 在DMSO中配制5 mg/mL的DDAO-半乳糖苷储备液。按每管50 µL（或所需体积）分装。避光保存于−20 °C，可保存长达1年。
2. 在DMSO中配制1 mM的Bafilomycin A1储备液。按每管50 µL（或所需体积）分装。于−20 °C保存，可稳定长达6个月。
3. 配制1 mM Calcein Violet 450 AM的DMSO储备液。按每管50 µL（或所需体积）分装。避光保存于−20 °C，可稳定保存长达1年。
4. 用于培养细胞的处理 体外，用适当的溶剂配制10 mM的衰老诱导剂浓储备液，并使用0.2 µm针式滤器灭菌。于−20 °C保存，或根据制造商说明进行保存。
   注意：用于递送诱导衰老的化疗药物 体内 （对已形成肿瘤的小鼠），试剂应为USP级，并在注射前将浓缩储备液用生理盐水稀释。
5. 配制所用细胞系的完全培养基。
   注意：例如，为 B16-F10 或 A549 细胞制备培养基时，使用 DMEM 1x + 10% FBS + 1x....

结果

进行了多项实验以比较DDAOG与X-Gal及C₁₂-FDG在SA-β-Gal检测衰老中的可比性。首先，使用X-Gal对经ETO诱导的衰老B16-F10黑色素瘤细胞进行染色（图2A）。在部分经ETO处理的细胞中出现了强烈的蓝色，而其他细胞则呈现较弱的蓝色染色。大多数经ETO处理的细胞形态增大。使用荧光SA-β-Gal底物C₁₂-FDG（绿色）或DDAOG（远红）对经ETO处理的细胞进行染色，结果显示其染色模式和强度变化与X-Gal相当（图2B）。然而，绿色C₁₂-FDG的发射光与细胞自发荧光（AF）重叠（图2C），而自发荧光已知会在衰老细胞中积累¹⁷。相比之下，DDAOG的远红发射波段中自发荧光几乎可忽略不计。

与使用荧光显微镜对衰老细胞进行计分和计数相比，利用流式细胞仪的高通量能力在短时间内（.......

讨论

近十年来，由于肿瘤免疫学的兴起、流式细胞仪成本降低以及高校研究机构共享仪器设施的不断完善，流式细胞术已成为癌症研究中更为常见的检测平台。目前，多色检测已成为常规，因为大多数新型仪器均配备了紫光、蓝绿光以及红光至远红光的光学阵列。因此，本DDAOG方案可能适用于多种流式细胞仪。当然，任何流式细胞仪都应由用户自行评估。在向DDAOG检测中添加额外的荧光染料（例如荧光标记的偶联抗体）时需格外谨慎。应使用单染对照样本，在所有其他相关检测通道中观察荧光信号，以评估通道间的荧光串扰。若发现信号重叠，可按照常规方法进行光谱补偿²⁰以校正。

本文所示的研究结果主要旨在证明，DDAOG流式细胞术检测可用于快速、定量且易于解读化疗药物在细胞或肿瘤中诱导的治疗诱导性衰老（TIS）效应。本研究中使用的试剂，包括ETO^23,24、DOX^7,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
巴佛洛霉素 A1	Research Products International	B40500
博来霉素硫酸盐	Cayman	13877
牛血清白蛋白 (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM 活性染料	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 抗体，PE 偶联物	Biolegend	137803	克隆 H194-112
细胞系：A549 人肺腺癌细胞	美国模式培养物集存库	CCL-185
细胞系：B16-F10 小鼠黑色素瘤细胞	美国模式培养物集存库	CRL-6475
细胞刮刀	Corning	3008
细胞筛网，100 µm	Falcon	352360
DDAO-半乳糖苷	Life Technologies	D6488
DMEM 培养基 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNase I	Sigma	DN25
多柔比星盐酸盐注射液 (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
聚乙二醇化脂质体多柔比星 (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
依托泊苷	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc 受体阻断试剂	Biolegend	101320	抗小鼠 CD16/32
流式细胞仪（细胞分析仪）	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
流式细胞仪（细胞分选仪）	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710
青霉素/链霉素 100x	Life Technologies	15140122
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS（不含钙和镁）
Rainbow 校准微粒，超套装	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm，2E6/mL
RPMI-1640 培养基 1x	Life Technologies	11875-119
氯化钠 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
流式细胞仪数据采集软件，"FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	联系 BD 获取许可证
流式细胞仪数据分析软件，"FlowJo"	TreeStar	n/a	联系 TreeStar 获取许可证
胰蛋白酶-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114