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方法文章

远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

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DOI：

10.3791/64176

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2022年9月13日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过荧光流式细胞术定量检测化疗药物在细胞培养或小鼠肿瘤模型中诱导的衰老癌细胞的实验方案。可选步骤包括共免疫染色、样本固定以方便大批量或多个时间点的分析，以及通过流式细胞分选富集存活的衰老细胞。

摘要

细胞衰老是一种由生物损伤诱导的增殖停滞状态，通常在衰老细胞中随着年龄增长历经数年逐渐积累，但也可能在肿瘤细胞中迅速出现，作为对多种癌症治疗所诱导损伤的应答。肿瘤细胞的衰老通常被认为是一种不利现象，因为衰老细胞会获得抗凋亡特性，阻碍肿瘤缓解，并加剧肿瘤的恶性程度和治疗耐药性。因此，识别衰老的肿瘤细胞一直是癌症研究领域关注的重点。目前已存在多种衰老检测方法，其中许多基于一种广为人知的衰老标志物——衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性。

通常，SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测使用显色底物（X-Gal）在固定细胞上进行，通过光学显微镜对“蓝色”的衰老细胞进行缓慢且主观的计数。近年来，已开发出改进的检测方法，采用细胞通透性荧光SA-β-Gal底物，如C12-FDG（绿色）和DDAO-半乳糖苷（DDAOG；远红光），可实现对活细胞的分析，并适用于包括流式细胞仪在内的高通量荧光分析平台。C12-FDG是SA-β-Gal的一种已有充分文献记录的探针，但其绿色荧光发射光谱与细胞固有的自发荧光（AF）重叠，而这种自发荧光在衰老过程中会因脂褐素聚集体的积累而增强。通过使用远红光SA-β-Gal探针DDAOG，可将绿色自发荧光作为第二个参数用于确认细胞衰老状态，从而提高检测的可靠性。其余的荧光通道可用于细胞活力染色或可选的荧光免疫标记。

利用流式细胞术，我们展示了使用 DDAOG 和脂褐素自发荧光作为双参数检测方法来鉴定衰老的肿瘤细胞。可对存活衰老细胞的百分比进行定量分析。根据需要，可选择性加入免疫标记步骤，以检测特定的细胞表面抗原。鉴定出的衰老细胞还可通过流式细胞术进行分选和收集，用于后续分析。收集到的衰老细胞可立即裂解（例如用于免疫检测或组学分析），也可进一步培养。

引言

衰老细胞通常在正常生物衰老过程中随着时间推移在生物体内逐渐积累，但也可能在肿瘤细胞中因放疗和化疗等癌症治疗所诱导的损伤而迅速形成。尽管治疗诱导的衰老（TIS）肿瘤细胞已失去增殖能力，但仍可能促进治疗耐药性并导致肿瘤复发1,2,3。TIS细胞分泌的因子可通过促进免疫逃逸或转移来加剧肿瘤的恶性程度4,5。TIS细胞会发展出复杂的、依赖于微环境的表型，代谢谱发生改变，并产生独特的免疫应答6,7,8。因此，识别和表征由不同癌症治疗手段诱导的TIS肿瘤细胞，一直是癌症研究领域持续关注的课题。

为了检测TIS肿瘤细胞，常规的衰老检测方法被广泛应用，其主要原理是检测衰老标志酶——溶酶体β-半乳糖苷酶GLB1活性的升高9。在接近中性（而非酸性）的溶酶体pH条件下进行检测，可特异性地识别与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）10。一种已使用数十年的标准SA-β-Gal检测方法采用X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）作为显色性β-半乳糖苷酶底物，通过光学显微镜在固定细胞中检测SA-β-Gal的存在11。X-Gal检测法利用常规试剂和实验室设备，可对TIS进行定性的视觉确认。评估蓝色显色产物仅需一台基本的透射光显微镜。然而，X-Gal染色法的灵敏度可能不足，有时需要超过24小时才能显色。染色后需在光学显微镜下对表现出不同程度蓝色显色的单个衰老细胞进行低通量、主观的计数评分。由于X-Gal不能穿透细胞膜，该方法需要使用溶剂固定的细胞，因而无法回收细胞用于后续分析。在处理来自动物或患者的有限样本时，这可能是一个重大缺陷。

已有文献报道了使用细胞渗透性荧光酶底物改进的SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测方法，包括C12-FDG（5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-半乳吡喃糖苷，绿色）和DDAOG（9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基) β-D-半乳吡喃糖苷，远红光）12,13,14,15。DDAOG的化学探针结构及其光学特性见补充图S1。这些细胞渗透性探针可用于活细胞（而非固定细胞）的分析，且荧光探针相较于显色探针更便于利用快速高通量的荧光分析平台，如高内涵筛选仪器和流式细胞仪。分选型流式细胞仪能够从细胞培养物或肿瘤组织中分离富集的活体衰老细胞群体，用于后续分析（例如蛋白质印迹、ELISA或组学分析）。荧光分析还可提供定量信号，从而更准确地确定特定样本中衰老细胞所占的比例。此外，还可方便地加入其他荧光探针，如细胞活性探针和荧光标记抗体，以实现对SA-β-Gal以外靶标的多重分析。

与DDAOG类似，C12-FDG也是一种用于检测SA-β-Gal的荧光探针，但其绿色荧光发射会与细胞内在的自发荧光（AF）重叠，这种自发荧光在细胞衰老过程中由于脂褐素聚集体在细胞内的积累而产生16。通过使用远红光DDAOG探针，绿色细胞自发荧光可作为第二个参数来确认细胞衰老状态17。这种方法通过引入第二个标志物，提高了检测的可靠性，因为单独使用SA-β-Gal作为衰老标志物时常存在不可靠性18。由于检测衰老细胞中内源性自发荧光是一种无需标记的方法，因此可快速、简便地扩展基于DDAOG的检测方法的特异性。

在此方案中，我们展示了使用 DDAOG 和 AF 作为快速、双参数流式细胞术检测方法，用于从 TIS 肿瘤细胞中鉴定活细胞 体外 培养物或从小鼠体内经药物处理的肿瘤中分离图1）。该方案所使用的荧光染料适用于多种市售的标准流式细胞仪分析仪和分选仪（表1). 可通过标准流式细胞术分析对存活衰老细胞的百分比进行定量。根据需要，可选择进行免疫标记步骤，以同时检测细胞表面感兴趣的抗原与衰老状态。已鉴定的衰老细胞还可利用标准的荧光激活细胞分选（FACS）方法进行富集。

药物处理流程图；体外/体内；流式细胞术；TIS起始；实验设置。
图1：实验流程图。 该示意图总结了DDAOG检测的关键步骤。(A) 将诱导治疗性衰老（TIS）的药物加入哺乳动物细胞培养体系，或给予荷瘤小鼠。随后给予足够时间以启动TIS：对于细胞，在给药后培养4天；对于小鼠，共22天，每5天给药一次，共三次，之后恢复7天。收集细胞或将肿瘤组织解离成单细胞悬液。(B) 样品先用Baf处理30分钟，以调节溶酶体pH，便于检测SA-β-Gal；然后加入DDAOG探针孵育60分钟，用于检测SA-β-Gal。样品用PBS洗涤两次，再短暂加入活细胞染料（15分钟）。可选步骤：可在可用的荧光通道中使用荧光标记抗体进行染色，和/或固定样品以备后续分析。(C) 使用标准流式细胞仪分析样品。在点图中显示活细胞的红色DDAOG信号（代表SA-β-Gal）与绿色自发荧光信号（脂褐素）。根据未处理的对照样品（未显示）设定门控，以确定TIS细胞的百分比。若使用分选型流式细胞仪（FACS），可收集TIS细胞并重新接种培养，用于进一步的in vitro实验，或裂解后进行分子生物学检测。缩写：DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)；DDAOG = DDAO-半乳糖苷；TIS = 治疗诱导性衰老；FL-Ab = 荧光素偶联抗体；Baf = 巴佛洛霉素A1；SA-β-Gal = 衰老相关β-半乳糖苷酶；PBS = 磷酸盐缓冲液；FACS = 荧光激活细胞分选。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光染料检测目标激发/发射波长 (nm)流式细胞仪激光器 (nm)流式细胞仪检测器 / 带通滤光片 (nm)
DDAOGSA-β-Gal645/6601640670 / 30
AF脂褐素< 600488525 / 50
CV450细胞活性408/450405450 / 50
PE抗体/表面标志物565/578561582 / 15

表1：荧光染料与流式细胞仪的光学参数。 本方案中使用的流式细胞仪参数针对配备4个激光器和15个发射检测器的仪器列出。在645/660 nm处检测到的DDAOG为SA-β-Gal1酶切后的探针形式。未切割的DDAOG可能在460/610 nm处产生微弱荧光，但可通过本方案中的洗涤步骤去除。缩写：DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)；DDAOG = DDAO-半乳糖苷；AF = 自发荧光；PE = 藻红蛋白；SA-β-Gal = 衰老相关β-半乳糖苷酶。

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方案

所有所述动物实验均已获得芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 储备液的配制与保存

注意：如果细胞需要进行流式分选，所有溶液均应采用无菌技术配制，并通过0.22 µm滤器过滤。

  1. 在DMSO中配制5 mg/mL的DDAO-半乳糖苷储备液。按每管50 µL（或所需体积）分装。避光保存于−20 °C，可保存长达1年。
  2. 在DMSO中配制1 mM的Bafilomycin A1储备液。按每管50 µL（或所需体积）分装。于−20 °C保存，可稳定长达6个月。
  3. 配制1 mM Calcein Violet 450 AM的DMSO储备液。按每管50 µL（或所需体积）分装。避光保存于−20 °C，可稳定保存长达1年。
  4. 用于培养细胞的处理 体外，用适当的溶剂配制10 mM的衰老诱导剂浓储备液，并使用0.2 µm针式滤器灭菌。于−20 °C保存，或根据制造商说明进行保存。
    注意：用于递送诱导衰老的化疗药物 体内 （对已形成肿瘤的小鼠），试剂应为USP级，并在注射前将浓缩储备液用生理盐水稀释。
  5. 配制所用细胞系的完全培养基。
    注意：例如，为 B16-F10 或 A549 细胞制备培养基时，使用 DMEM 1x + 10% FBS + 1x 谷氨酰胺替代物 + 1x 青霉素/链霉素。培养基必须保持无菌。也可使用其他细胞系特异性的培养基配方。某些成分（如谷胱甘肽）在某些情况下可能会干扰衰老的启动。如果衰老的启动程度低于预期，或在对照化疗药物处理下未观察到衰老现象，应针对不同培养基配方进行实证测试。
  6. 配制染色和洗涤缓冲液。
    1. 在1×PBS中配制1%牛血清白蛋白（BSA）溶液，用于染色步骤。将2 g BSA溶解于200 mL PBS中，在室温下搅拌10分钟，或直至完全溶解。
    2. 用1×PBS配制0.5% BSA作为洗涤缓冲液。将1.6.1步骤中配制的1% BSA溶液100 mL加入100 mL的1×PBS中，稀释得到0.5% BSA溶液。
    3. 缓冲液可于 4 °C 保存长达 1 个月。
  7. 配制4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液。为方便和稳定起见，可使用市售密封的多聚甲醛安瓿瓶（例如16% v/v）：取2.5 mL的16% PFA与7.5 mL的1×PBS混合，得到10 mL的4% PFA溶液。根据每次实验所需总体积调整配制量。
    注意：仅按需制备用于细胞固定的溶液；每次均需新鲜配制。
  8. 配制FACS分选缓冲液：1x PBS，1 mM EDTA，25 mM HEPES，1% BSA（pH 7.2）。使用0.22 µm滤器无菌过滤，4 °C保存，可保存至1个月。
    注意：仅根据需要为流式细胞分选（FACS）制备。不同FACS仪器的流式分选缓冲液配方可能有所不同。上述配方适用于本研究中使用的仪器（见 材料表）。请参考制造商的使用指南。
  9. 制备肿瘤解离液：在 RPMI-1640 培养基（不含 FBS 或其他添加剂）中加入 20 µg/mL Liberase TL 和 100 µg/mL DNAse I。建议常备储存以下储备液：Liberase TL（按生产商说明配制和保存）和 DNAse I（100 mg/mL 溶于双蒸水 [ddH₂O] 中）。2O]，-20 °C 保存。
    ​注意：若仅使用肿瘤组织，请按需制备；每次均需新鲜配制。

2. 通过化疗药物在培养的癌细胞中诱导衰老

注意：本节中的所有细胞操作步骤均应在生物安全柜中进行，并采用无菌操作技术。本节内容适用于贴壁细胞类型。悬浮细胞可在进行适当调整后使用，具体说明见文中注释。

  1. 根据提供特定癌细胞系的供应商或实验室的标准操作规程培养癌细胞系。
    注意：低传代细胞（p < 10）通常更优选，因为未处理的细胞样本中复制性衰老水平较低，即背景信号较低。
  2. 在药物诱导衰老前一天，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（或按推荐浓度）消化收集细胞。加入等体积的完全培养基中和胰蛋白酶，将细胞悬液转移至无菌锥形管中。
    注意：悬浮细胞无需执行此步骤。
  3. 使用标准血细胞计数板法计数细胞，并记录细胞浓度（个/mL）。将细胞以1 × 10⁶个/mL的密度接种3-10 × 103 细胞/厘米²2 在标准的6孔塑料培养皿中。
    注意：最佳接种密度取决于细胞的增殖速率，需由使用者自行确定。处理时（即接种后培养18–24小时）细胞应处于对数生长期，汇合度约为10%–20%。悬浮细胞的起始密度（细胞数/mL）应由使用者自行确定。六孔板每孔通常可获得足够数量的衰老细胞，用于一次标准的流式细胞术分析。若需进行流式分选，应使用更大的培养表面积（例如多个P150培养皿），以确保获得足够数量的衰老细胞用于后续实验（≥1 × 10⁶）。6).
  4. 将接种的细胞在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜（18–24 h）2 以及一个湿度盘。
  5. 用诱导衰老的化疗药物处理已接种的细胞。每种药物至少设置一个阳性对照，例如依托泊苷（ETO）或博来霉素（BLM）。每种药物处理设置复孔。另设一组仅使用溶剂处理作为对照。
    注意：用户应针对每种实验试剂进行剂量曲线测试，以确定在所用细胞系中诱导衰老的最佳浓度。
  6. 在37 °C、5% CO₂培养箱中培养细胞4天2 并使用湿度盘以促进衰老的开始。每天在光学显微镜下观察预期的形态学变化。
    注意：根据衰老启动的速度，3至5天的孵育时间可能是可接受的。可根据需要更换培养基并重新添加（或不添加）处理剂，以在获得足够比例的衰老细胞的同时，维持良好的生长条件。
  7. 细胞进入衰老期后，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育5分钟以收获细胞。待细胞解离成悬液后，加入等体积的完全培养基中和胰蛋白酶。
    注意：悬浮培养的细胞无需执行此步骤。若需进行表面标志物染色，应避免使用胰蛋白酶-EDTA，因其可能暂时破坏细胞表面抗原。建议使用无菌塑料细胞刮棒（或专为保护表面抗原设计的其他解离试剂）轻柔解离单层细胞。
  8. 使用血细胞计数板对每个样本的细胞进行计数。计算每个样本的细胞浓度（个/mL）。
    注意：此时可加入台盼蓝以评估死细胞百分比（例如，由于药物处理所致），但在 DDAOG 染色流程中，还将使用荧光活力染料测定细胞死亡情况。
  9. 分装 ≥0.5 × 106 每份样品加入细胞至1.7 mL微量离心管中。
    注意：每个样本的细胞数量应在所有样本间保持一致。
  10. 将试管在1,000 × g条件下离心5分钟 g 在4 °C下微量离心。弃去上清液。
    注意：若无冷藏微量离心机，对于某些耐受性较强的细胞类型，可在室温下进行离心操作。
  11. 进入第4节进行DDAOG染色。

3. 通过化疗药物诱导小鼠体内建立的肿瘤发生衰老

注意：如果肿瘤细胞需要进行流式细胞分选（FACS），则每一步操作都应在生物安全柜中进行，并使用无菌仪器、无菌操作程序和无菌试剂，以确保无菌性。

  1. 根据标准方法（例如 Appelbe 等19），通过皮下注射癌细胞建立小鼠肿瘤模型。
    注意：每种实验方案应优化注射的癌细胞数量、注射部位和合适的小鼠品系。本实验中，将 B16-F10 细胞以 0.1 mL 生理盐水（1 × 107 细胞/mL）悬浮，皮下注射 1 × 106 个细胞。
    1. 在进行注射前，使用台盼蓝检测确认细胞活力>90%。用异氟烷麻醉小鼠。
    2. 使用 3% 异氟烷与空气的混合气体对 6–7 周龄雌性 C57/BL6 小鼠进行麻醉，并将其置于生物安全柜内的诱导室中维持麻醉状态。通过轻捏小鼠足部确认麻醉效果。在两只眼睛上涂抹无菌兽用眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。手术期间使用加热灯维持小鼠体温。
    3. 在无菌生物安全柜内操作，将小鼠从诱导室中取出，并使其接触提供 3% 异氟烷气流的鼻罩。使用干净的电动剃刀剃除注射部位的 flank 区毛发。注射前，轻轻倒置混匀细胞悬液，然后使用装有无菌 27 G 针头的 0.5 mL 无菌注射器将细胞悬液皮下注射至剃毛的 flank 区。注射完成后将小鼠移出生物安全柜，转入恢复笼中。
    4. 在恢复笼中持续监测小鼠生命体征，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位、表现出翻正反射，并能安全地在笼内活动。在完全恢复前，不得让小鼠无人看管，也不得将其与其它动物合笼。每天监测所有接种小鼠的体重减轻、活动/移动能力下降及神经系统症状；对出现任一类严重症状的小鼠实施安乐死。对于接种后出现疼痛症状的小鼠，皮下注射一次丁丙诺啡（0.1–0.2 mg/kg）。
      注意：若丁丙诺啡给药后仍持续出现疼痛症状，应实施安乐死。
  2. 在癌细胞接种后第 5–7 天开始，每隔 2–3 天使用游标卡尺测量肿瘤生长情况。当肿瘤体积达到 50 mm3 ± 10 mm3 时，开始促衰老治疗。
    注意：本研究中，使用 USP 级盐酸多柔比星（DOX）或聚乙二醇化脂质体多柔比星（PLD），剂量为 10 mg/kg，溶于 0.9% 氯化钠注射液（USP）中。当肿瘤体积达到 50 mm3 ± 10 mm3 时开始，每 5 天腹腔注射一次，共给药 3 次。末次治疗后让小鼠恢复 7 天，以允许肿瘤内发生治疗诱导的衰老（TIS）。其他治疗方法和/或肿瘤模型的衰老诱导剂量和条件应另行优化。
  3. 在末次药物处理 7 天后，按照实验室动物操作指南，采用 CO2 过量麻醉联合颈椎脱位或其他批准方法处死小鼠。切除肿瘤，并将其收集至无菌管或装有无菌 RPMI 培养基的 6 孔板中（以在处理过程中保持细胞活性）。
    注意：若需进行组织学检查（如 X-Gal 染色或免疫组织化学），可在此处将肿瘤组织一分为二，其中一半迅速置于 O.C.T. 包埋剂中冷冻，随后按照标准冷冻组织切片程序进行冰冻切片。剩余的一半肿瘤组织可用于解离并进行 DDAOG 染色，通常可提供充足的材料。
  4. 将一个肿瘤转移至含有 5 mL RPMI 培养基的 P100 塑料培养皿中。使用手术刀将肿瘤切成小块。
  5. 将含有悬浮细胞和碎片的肿瘤组织悬液 5 mL 转移至 15 mL 圆锥形离心管中。若存在较大碎片，可使用 25 mL 移液管的宽口端进行转移。用额外体积的无菌 RPMI 冲洗培养皿以回收残留材料。盖紧管盖，并将离心管置于冰上。
  6. 对剩余肿瘤重复步骤 3.45–3.5。每个肿瘤使用独立的培养皿和手术刀以避免交叉污染，或在处理不同肿瘤之间用 PBS 充分冲洗。每个肿瘤使用 5 mL 新鲜培养基进行剪切。
  7. 配制肿瘤解离液：在 RPMI-1640 培养基（不含 FBS）中加入 20 µg/mL Liberase TL 和 100 µg/mL DNAse I。
    注意：存在多种有效的肿瘤解离液配方，可包含来自不同厂家的多种酶和其他组分。不同肿瘤类型的各组分最佳浓度差异较大。若肿瘤中红细胞含量较高，可额外进行红细胞裂解；若死细胞较多，可使用死细胞去除试剂盒。强烈建议使用者独立确定最佳的肿瘤解离条件，以获得高细胞活力，并尽量减少污染细胞、结缔组织和碎片的存在。
  8. 将所有肿瘤样品在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  9. 根据肿瘤组织体积，向每个肿瘤样品中加入 1–5 mL 肿瘤解离液。确保管中液体体积比肿瘤组织沉淀多出 1–2 mL。以中等速度涡旋混匀。
  10. 将样品置于 37 °C 摇床中快速振荡孵育 45 分钟。每 15 分钟短暂涡旋一次。
  11. 将每个样品通过 100 µm 细胞筛过滤至 50 mL 圆锥形离心管中。若样品过于黏稠难以过滤，可加入 10 mL RPMI-1640 培养基稀释。用 RPMI 培养基冲洗滤网以回收残留细胞。
  12. 使用血细胞计数板测定各样品的细胞浓度（细胞数/mL）。
  13. 每份肿瘤样品分装两份或多份，每份含 5 × 106 个细胞。
  14. 在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  15. （可选）如需后续进行 DDAOG 染色，可将肿瘤样品冷冻保存。
    1. 将解离后的肿瘤细胞沉淀重悬于冷冻保存液中：50% FBS、40% RPMI-1640、10% DMSO，在无菌条件下配制，细胞浓度为 5 × 106 细胞/mL。
    2. 将 1 mL 细胞悬液分装至每个冻存管中。
    3. 将冻存管置于异丙醇冻存盒中，在 −80 °C 冷冻 24 小时；随后转移至液氮中进行长期保存（>1 周）。
    4. 如需染色，将冻存管置于冰上解冻，并进入第 4 节进行 DDAOG 染色。
      注意：某些肿瘤可能无法耐受冷冻保存过程，使用者应针对感兴趣的肿瘤模型评估其对此过程的耐受性。
  16. 进入第 4 节进行 DDAOG 染色。

4. 细胞或肿瘤样本中SA-β-Gal的DDAOG染色

  1. 将1 mM Bafilomycin A1储存液按1:1,000比例稀释至DMEM培养基（不含FBS）中，终浓度为1 µM。
  2. 向细胞沉淀样品（来自步骤2.11或步骤3.16）中加入配制好的Baf-DMEM溶液，使细胞浓度为1 × 106 个细胞/mL。
    注：例如，若每份样品使用0.5 × 106 个细胞，则加入0.5 mL Baf-DMEM溶液。对于肿瘤组织，可在5 mL Baf-DMEM溶液中染色5 × 106 个细胞。
  3. 在37 °C条件下，以低速旋转/振荡孵育30分钟（不使用CO2环境）。
    注：染色过程中应避免使用CO2培养箱，因其可能导致溶液酸化，从而干扰Baf和DDAOG的染色效果。
  4. 无需洗涤，直接向每份样品中加入DDAOG储存液（5 mg/mL），按1:500稀释（终浓度为10 µg/mL）。用移液器吹打混匀，然后置于37 °C旋转/振荡器上孵育60分钟（不使用CO2环境）。避光操作。
  5. 在4 °C条件下，以1,000 × g 离心5分钟，弃去上清液。
  6. 每管加入1 mL预冷的含0.5% BSA的PBS溶液，吹打混匀。在4 °C条件下，以1,000 × g 离心5分钟，弃去上清液。重复此洗涤步骤两次，以彻底清洗细胞。弃去上清液后继续后续操作。
    注：执行步骤4.6中的洗涤步骤至关重要，以去除未被切割的DDAOG，否则可能产生非特异性荧光发射（460/610 nm）。
    注：若需进行细胞表面标志物免疫染色，请继续进行下文第5节操作。
  7. （可选）DDAOG染色细胞的固定与保存，用于后续分析
    1. 向每份洗涤后的样品中逐滴加入0.5 mL预冷的4%多聚甲醛溶液，吹打混匀。
    2. 室温孵育10分钟。
    3. 用1 mL PBS洗涤细胞两次。
    4. 样品可在4 °C保存最多1周，之后进行流式细胞术分析。
      注：对于已固定的样品，跳过步骤4.8。
  8. 将Calcein Violet 450 AM储存液（1 mM）按1:1,000比例稀释至1% BSA-PBS溶液中（终浓度为1 µM）。向步骤4.6所得洗涤后细胞沉淀中加入300 µL（培养细胞样品）或1,000 µL（肿瘤样品）。冰上避光孵育15分钟。
  9. 继续进行流式细胞术检测设置（第6节）。

5. （可选）细胞表面标志物的免疫染色与 DDAOG 联合使用

注意：与任何流式细胞术实验一样，应制备仅含 DDAOG 的单染对照样本和仅含荧光抗体的单染对照样本，以确定各荧光通道间是否存在串扰。若观察到串扰，应进行标准的流式细胞术补偿20。

  1. 将步骤 4.6 中获得的细胞沉淀用 100 µL 染色缓冲液（1% BSA 溶于 1× PBS）重悬。
  2. 加入适用于细胞物种（小鼠或人）的 Fc 受体阻断试剂，用量为制造商推荐的滴定浓度。在 24 °C 下孵育 10 分钟。
  3. 加入荧光素标记的抗体，用量为制造商推荐或用户确定的滴定浓度。在冰上避光孵育 20 分钟。
  4. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  5. 每管加入 1 mL 冰冷洗涤缓冲液（0.5% BSA-PBS），用移液器吹打混匀。在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤 2 次，以充分洗涤细胞。
  6. 将 1 mM Calcein Violet 450 AM 用 1% BSA-PBS 按 1:1,000 稀释，每管加入 300 µL 至步骤 5.5 中洗涤后的细胞沉淀。在冰上避光孵育 15 分钟。
  7. 进行流式细胞术分析（第 6–7 节）。

6. 流式细胞仪设置与数据采集

  1. 将细胞样品转移至适用于流式细胞仪的试管中。将试管置于冰上，并避免光照。
    注意：如果在细胞悬液中观察到聚集体，分析前需通过70–100 µm细胞筛过滤。请勿使用40 µm的滤网，因其可能排除部分较大的衰老细胞。
  2. 在所引用的软件中（参见材料表），打开以下图谱：1）FSC-A 与 SSC-A 点图，2）紫光通道直方图，3）远红光通道（例如 APC-A）与绿光通道（例如 FITC-A）点图。
    注意：双联体排除图和单通道直方图也可使用，但并非必需。
  3. 启动流式细胞仪的数据采集。
    1. 将仅含载体并用DDAOG染色的对照样品置于进样口。以低进样速度开始采集样品数据。
    2. 调节FSC和SSC电压，使>90%的事件位于图谱范围内。若细胞在图谱中分布不佳，可将面积缩放设置调低至0.33–0.5单位。
    3. 移除仅含载体的样品，无需记录数据。
    4. （可选）向含1 mL PBS的流式管中加入一滴彩虹校准微球。将该管置于仪器进样口，开始采集样品数据。
    5. 调节紫光、绿光和远红光通道的电压，使彩虹微球的最高峰在各通道中的相对荧光强度处于104–105单位范围内，并确保各通道中所有峰均清晰分离。记录10,000个事件后移除试管。
  4. 将用DDAOG染色的阳性对照样品（例如BLM、ETO）置于进样口。以低速采集样品数据。观察FSC、SSC、紫光、绿光和远红光通道中的事件，确保超过90%的事件位于所有图谱范围内。注意AF和DDAOG信号相较于仅含载体的对照是否增强。
  5. 若使用分选型流式细胞仪，此时启动分选程序。
    1. 为便于记录，对对照样品及每个分选样品均采集10,000个细胞的数据。
    2. 将所需数量的细胞（通常≥1 × 106较为合适）分选至含有3–5 mL培养基的适配收集管中。
    3. 分选完成后，进行后续培养或分析。
    4. 跳转至第7节，进行分选样品的常规分析。
  6. 若使用荧光标记抗体，利用第5节中制备的未染色、单染色和双染色样品在此处优化各通道电压。
    注意：对于本研究中使用的已校准流式细胞仪，最佳通道电压通常介于250–600（中等范围），但不同仪器的最佳电压及电压范围会有所差异。应避免使用过低或过高的电压，以免抑制信号或放大噪声。
  7. 完成步骤6.1–6.5并对细胞仪设置进行必要调整后，记录所有样品的数据。确保所有样品记录过程中设置保持一致。每个培养细胞样品至少记录≥10,000个事件，每个肿瘤细胞样品至少记录≥100,000个事件。
    注意：尽管可在数据采集软件（例如FACSDiva）中进行设门和分析，但下文第7节将描述使用独立分析软件（FlowJo）在采集后完成完整设门与分析流程的方法。推荐采用采集后分析，以减少在流式细胞仪工作站的操作时间，并充分利用专用分析软件中的附加功能。
  8. 将样品数据保存为.fcs文件格式。将文件导出至配备流式细胞术分析软件（例如FlowJo）的工作站计算机。进入第7节。

7. 流式细胞术数据分析

注意：本工作流程使用 FlowJo 软件。如果遵循本节所述的关键步骤，也可使用其他流式细胞术数据分析软件。

  1. 使用 FlowJo 软件打开步骤 6.7 中的 .fcs 数据文件。
  2. 打开布局窗口。
  3. 将所有样本拖放到布局窗口中。
  4. 圈选活细胞。
    1. 首先双击仅载体对照样本的数据，以打开其数据窗口。
    2. 将数据以紫光通道直方图形式显示。根据 CV450 染色后活细胞的荧光强度高于死细胞，识别出活细胞。
    3. 使用单门直方图工具绘制门控区域，仅包含活细胞。将该门命名为“viable”（活细胞）。
    4. 然后，从样本布局窗口中，将“viable”门拖动到其他细胞样本上，以统一应用该门控。
    5. 在布局窗口中，将所有样本以紫光通道（活力）直方图形式显示。在继续操作前，确认各样本的活细胞门控是否合适；若不合适，则根据需要进行调整。
      注意：活力染色在不同处理或肿瘤之间可能存在差异。
  5. 圈选衰老细胞。
    1. 双击仅载体对照样本中已圈选的活细胞数据，以打开其数据窗口。
    2. 将数据以远红通道（DDAOG）对绿通道（AF）的散点图形式显示。
    3. 使用矩形门控工具绘制门控区域，包含 <5% 的 DDAOG+ 和 AF+ 细胞（右上象限）。将该门命名为“senescent”（衰老细胞）。
    4. 然后，从样本布局窗口中，将“senescent”门拖动到其他细胞样本的活细胞亚群上，以统一应用该门控。
    5. 将第 7.4 节中已圈选的所有活细胞亚群拖放到布局窗口中。将所有活细胞样本以远红通道（例如 APC-A）对绿通道（例如 FITC-A）的散点图形式显示。
    6. 确保第 7.5.3 步绘制的衰老细胞门在所有图中均可见，并且仅载体对照样本的衰老细胞比例不超过 5%–10%。
  6. 在使用上述步骤确定衰老细胞百分比后，使用 FlowJo 图表展示结果数据，并以数据表格形式汇总，和/或使用标准软件进行统计分析。

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结果

进行了多项实验以比较DDAOG与X-Gal及C12-FDG在SA-β-Gal检测衰老中的可比性。首先，使用X-Gal对经ETO诱导的衰老B16-F10黑色素瘤细胞进行染色（图2A）。在部分经ETO处理的细胞中出现了强烈的蓝色，而其他细胞则呈现较弱的蓝色染色。大多数经ETO处理的细胞形态增大。使用荧光SA-β-Gal底物C12-FDG（绿色）或DDAOG（远红）对经ETO处理的细胞进行染色，结果显示其染色模式和强度变化与X-Gal相当（图2B）。然而，绿色C12-FDG的发射光与细胞自发荧光（AF）重叠（图2C），而自发荧光已知会在衰老细胞中积累17。相比之下，DDAOG的远红发射波段中自发荧光几乎可忽略不计。

与使用荧光显微镜对衰老细胞进行计分和计数相比，利用流式细胞仪的高通量能力在短时间内（...

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讨论

近十年来，由于肿瘤免疫学的兴起、流式细胞仪成本降低以及高校研究机构共享仪器设施的不断完善，流式细胞术已成为癌症研究中更为常见的检测平台。目前，多色检测已成为常规，因为大多数新型仪器均配备了紫光、蓝绿光以及红光至远红光的光学阵列。因此，本DDAOG方案可能适用于多种流式细胞仪。当然，任何流式细胞仪都应由用户自行评估。在向DDAOG检测中添加额外的荧光染料（例如荧光标记的偶联抗体）时需格外谨慎。应使用单染对照样本，在所有其他相关检测通道中观察荧光信号，以评估通道间的荧光串扰。若发现信号重叠，可按照常规方法进行光谱补偿20以校正。

本文所示的研究结果主要旨在证明，DDAOG流式细胞术检测可用于快速、定量且易于解读化疗药物在细胞或肿瘤中诱导的治疗诱导性衰老（TIS）效应。本研究中使用的试剂，包括ETO23,24、DOX7,...

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披露

作者声明本研究无任何利益冲突。

致谢

感谢芝加哥大学细胞计量学与抗体核心设施在流式细胞仪设备方面提供的支持。芝加哥大学动物研究中心提供了动物饲养服务。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
巴佛洛霉素 A1Research Products InternationalB40500
博来霉素硫酸盐 Cayman13877
牛血清白蛋白 (BSA)US BiologicalA1380
Calcein Violet 450 AM 活性染料ThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4 抗体，PE 偶联物Biolegend137803克隆 H194-112
细胞系：A549 人肺腺癌细胞美国模式培养物集存库CCL-185
细胞系：B16-F10 小鼠黑色素瘤细胞美国模式培养物集存库CRL-6475
细胞刮刀Corning3008
细胞筛网，100 µmFalcon352360
DDAO-半乳糖苷Life TechnologiesD6488
DMEM 培养基 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNase ISigmaDN25
多柔比星盐酸盐注射液 (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
聚乙二醇化脂质体多柔比星 (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0.5 MLife Technologies15575-038
依托泊苷 Cayman12092
FBSOmega FB-11
Fc 受体阻断试剂Biolegend101320抗小鼠 CD16/32
流式细胞仪（细胞分析仪）Becton Dickinson (BD)VariousLSRFortessa
流式细胞仪（细胞分选仪）Becton Dickinson (BD)VariousFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710
青霉素/链霉素 100xLife Technologies15140122
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1xCorningMT21031CVDulbecco's PBS（不含钙和镁）
Rainbow 校准微粒，超套装SpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 µm，2E6/mL
RPMI-1640 培养基 1xLife Technologies11875-119
氯化钠 0.9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
流式细胞仪数据采集软件，"FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/a联系 BD 获取许可证
流式细胞仪数据分析软件，"FlowJo"TreeStarn/a联系 TreeStar 获取许可证
胰蛋白酶-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114

参考文献

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远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞
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