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在猪心肌梗死模型中递送心脏活性治疗药物

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DOI：

10.3791/64177

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2023年2月10日

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1Centre for Heart Research, The Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 2Department of Cardiology, Westmead Hospital, 3Sydney Imaging, Core Research Facility, The University of Sydney, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Liverpool Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了在猪模型中给予心脏活性治疗药物的三种方法。雌性长白猪通过以下任一途径接受治疗：（1）开胸经心外膜注射，（2）导管介导的经心内膜注射，或（3）静脉输注 通过 颈静脉渗透压微型泵

摘要

心肌梗死是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，迫切需要开发新的心脏保护或再生治疗策略。在药物研发过程中，确定新型治疗手段的给药方式至关重要。生理学上具有相关性的大型动物模型对于评估各种治疗递送策略的可行性和有效性具有关键意义。由于猪在心血管生理、冠状血管解剖结构以及心脏重量与体重比方面与人类高度相似，因此成为心肌梗死新疗法临床前评价的首选物种之一。本实验方案描述了在猪模型中给予心脏活性治疗药物的三种方法。在经皮诱导心肌梗死后，长白母猪通过以下方式接受新型治疗药物：（1）开胸经心外膜注射；（2）基于导管的经心内膜注射；（3）静脉输注 通过 颈静脉渗透压微型泵。每种技术所采用的操作步骤均具有可重复性，可实现可靠的 cardioactive 药物递送。这些模型可轻松适应不同的研究设计需求，且每种递送技术均可用于探索多种可能的干预手段。因此，这些方法为致力于心肌梗死后心脏修复新型生物学策略的转化科学研究人员提供了有力的工具。

引言

冠状动脉疾病（CAD）及其相关的ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是全球范围内最主要的死亡原因。在过去二十年中，随着经皮冠状动脉介入治疗、溶栓疗法以及标准化治疗方案的出现，STEMI患者的院内死亡率已显著降低，这些进展确保了患者能够及时实现再灌注1,2,3。尽管如此，STEMI相关发病率仍然构成重大医疗负担，因此迫切需要开发新型的心脏保护和再生疗法2,3。治疗手段开发的一个关键环节是确定新型疗法的给药方式4。每种给药方法的安全性、有效性和可行性都必须与疗法本身的特性相匹配。

生理学上具有相关性的大型动物模型在评估各种治疗递送策略的这些特性时至关重要5。由于猪在心血管生理、冠状血管解剖结构以及心脏重量与体重比方面与人类具有高度相似性，因此猪是用于心肌梗死新疗法临床前评估的首选物种之一6。我们此前曾利用猪的ST段抬高型心肌梗死（STEMI）模型，证明了一种重组蛋白治疗的修复能力7，并持续利用该模型研究新型的药理学、细胞及基因治疗策略。本文描述了在猪模型中建立心肌梗死后常用的三种治疗给药技术：开胸经心外膜注射、经皮经心内膜注射以及颈静脉植入渗透性微型泵。前两种方法可实现局部组织给药，从而减少所需剂量、脱靶效应以及肝脏首过代谢8,9,10。而渗透性微型泵则可实现对半衰期较短药物的持续递送，避免依赖输液泵和通畅的静脉留置导管，这两者在大型动物模型中均难以长期维持。

通过描述这些技术，希望本文能够帮助转化医学研究人员在大型动物模型中研究心肌梗死后具有潜在心脏保护或再生作用的新药。

方案

所有实验均遵循《澳大利亚科学用途动物护理与使用规范》，并经西悉尼地方卫生区动物伦理委员会批准。本研究采用体重为18-20 kg的未成年大白猪与长白猪杂交母猪。

1. 动物饲养

  1. 根据当地动物伦理委员会的规定饲养动物。
    ​注意：本方案中涉及的动物均单独饲养，以避免打斗和受伤，并确保食物无竞争。然而，所有动物均能看见、听见并嗅到同种动物。 其圈舍采用混凝土地面，便于清洁，并设有室内和室外的遮蔽区域。室内区域为猪提供稻草垫料，室外区域提供环境丰富化的“玩具”。

2. 镇静与全身麻醉

  1. 镇静
    1. 确保动物在开始深度镇静或全身麻醉前至少禁食12小时。
    2. 如果动物尚未建立中心静脉导管等血管通路，应采用肌内注射镇静方案。
    3. 肌内镇静方案包括每公斤体重8 mg的氯胺酮、每公斤体重0.3 mg的咪达唑仑、每公斤体重0.2 mg的美沙酮以及每公斤体重10 µg的美托咪定（参见 材料表）。使用21 G针头将此混合物注射至动物的轴上肌内。通常情况下，动物需要5-10分钟进入深度镇静状态。
      注意：处于应激状态的猪对镇静更不敏感；应确保由镇定且自信的操作人员进行镇静操作，并避免动物遭受过度应激。若动物出现应激反应，最好将其单独静置5-10分钟后再尝试。
    4. 若中心静脉导管已置入且通畅，可进行静脉镇静。静脉镇静方案包括氯胺酮 2 mg/kg、咪达唑仑 0.2 mg/kg、美沙酮 0.2 mg/kg 和美托咪定 2 µg/kg。
    5. 先用0.9%氯化钠溶液冲洗静脉管路，以确保通畅。然后缓慢推注混合注射器中一半的药液，再用0.9%氯化钠溶液冲洗管路。
    6. 观察动物，其必须在20-30秒内达到深度镇静状态。若动物尚未镇静，按照步骤2.1.5所述，注入剩余半管注射器内容物。
  2. 血管通路
    1. 在适当麻醉后，将猪转运至手术室。
    2. 使用面罩和5 L/min的氧气流速对猪进行预充氧。将脉搏血氧仪连接至猪的尾部、耳朵或舌头，以全程监测动物状态。
    3. 使用22或24 G套管针穿刺左右耳缘静脉，并用胶带固定。
  3. 全身麻醉
    1. 将猪置于胸卧位。
    2. 给予 1-3 mg/kg 的丙泊酚（参见 材料表) 通过静脉缓慢推注给药，根据效果调整剂量。让助手打开动物的口腔（此时下颌应处于松弛状态），并伸展其颈部。
    3. 使用喉镜（参见 材料表) 下压舌根和会厌，以暴露喉部的杓状软骨。
    4. 插入一支已润滑的气管插管（型号 5.5 或 6.0；参见 材料表通过杓状软骨，将带导丝的气管插管插入气管。在通过喉部时，有时会遇到阻力；可通过轻柔旋转气管插管来克服。若动物抵抗插管，可静脉追加丙泊酚。
    5. 取出气管插管内的导丝。向气管插管套囊充气，直至确认插管周围无漏气现象。通常需要4–6 mL空气，但具体体积可能因导管尺寸和动物个体差异而有所不同。
    6. 将气管插管固定在动物耳后。
    7. 将动物连接至带有重复呼吸麻醉回路且具备容量控制通气功能的呼吸机。连接动物时，应使呼吸机处于“关闭”状态。
      注意：务必始终确保可调节压力限制（APL）阀（即“泄压阀”）处于打开状态。若未保持该阀门开启，可能导致动物发生致命的气压性创伤。
    8. 将麻醉回路的氧气流速降低至 2 L/min。
    9. 将正压呼吸机设置为“容量控制”模式。潮气量设为10 mL/kg，呼吸频率设为20次/分钟。确保吸气:呼气比为1:2。
    10. 在整个操作过程中，调节呼吸频率以确保呼气末二氧化碳分压维持在35-50 mmHg之间。
      注意：吸气压不得超过 20 cmH₂O。2O. 吸气压升高时，应检查管路是否存在扭曲或阻塞。对于与管路无关的压力升高，可通过将吸气：呼气比降至1:1.5并降低潮气量来缓解。
    11. 若动物血流动力学稳定，使用吸入麻醉维持；若动物血流动力学不稳定，则按照步骤2.3.14所述，使用全静脉麻醉维持。
      1. 若需对动物施用吸入麻醉，应在首次连接麻醉回路时即开始使用2.5%异氟烷。
      2. 在接下来的30分钟内，逐步将动物的吸入异氟烷浓度降至1.5%。在整个操作过程中，维持动物处于1.5%异氟烷麻醉状态。
      3. 每10分钟通过检查眼睑反射和测试下颌张力评估一次麻醉深度。根据需要调整异氟烷浓度以维持适当的麻醉深度。
    12. 若动物血流动力学不稳定，应采用全静脉麻醉维持，以便更精确地控制麻醉深度，同时避免吸入性麻醉剂可能引起的心血管并发症。
      1. 准备丙泊酚、芬太尼和咪达唑仑的注射泵或标准输液泵，并将其连接至动物 通过 一条常见直线
        注意：丙泊酚的输注速率可为 0.1–0.6 mg/kg/min，芬太尼可为 1–5 µg/kg/h，咪达唑仑可为 0.05–0.2 mg/kg/h。
      2. 与吸入麻醉类似，在麻醉过程中应根据效果滴定这些药物，以维持适当的麻醉深度。
    13. 使用0.9%氯化钠溶液或哈特曼氏液提供静脉液体支持（参见 材料表以5 mL/kg/h的速率。
    14. 通过血压测量、二氧化碳监测、麻醉气体监测、体温、脉搏血氧饱和度和心电图监测动物。
    15. 在整个操作过程中，于预用药后每4小时静脉注射0.2 mg/kg的美沙酮作为补充镇痛。
      ​注意：如果动物在麻醉期间表现出疼痛迹象（如心动过速、麻醉深度变浅但维持用药未作调整），可缩短镇痛给药间隔时间。

3. 中心静脉置管

  1. 将猪置于仰卧位，后肢伸直，左前肢伸直，右前肢屈曲并用绑带固定。
  2. 无菌准备猪的颈部，并覆盖手术巾。
  3. 使用带无菌护套的线性超声探头（见材料表），探头方向垂直于气管，从喉部开始缓慢向外侧移动，以定位右侧颈静脉。
  4. 启用彩色多普勒模式以帮助识别颈静脉。通过观察其可压缩性以及连续、非搏动性血流，可将颈静脉与颈动脉区分开来。
  5. 在超声引导下使用18 G Cook针（见材料表）穿刺静脉。成功进入后，将0.035英寸J型头导丝（见材料表）经针芯送入血管，然后撤出穿刺针。
  6. 沿导丝置入预先冲洗过的中心静脉导管，并推进至静脉内。确保导丝始终可见从导管远端穿出。
    ​注：对于需要1至4周静脉通路的实验对象，使用5 Fr双腔中心静脉导管（见材料表）。
  7. 若导管经皮肤推进困难，可用11号手术刀片做2–4 mm的小切口，以利于导管沿导丝通过。对每条外置导管先施加负压，再进行冲洗，以确认通畅性，随后夹闭各导管。
  8. 将配套的固定锚连接至外置导管，并使用2-0或3-0不可吸收缝线（见材料表）固定。额外缝合固定外置导管于背部，防止动物啃咬。
  9. 将已冲洗的延长管连接至外置导管端口，随后夹闭。
  10. 为动物穿上商用猪用背心（见材料表），并将导管妥善固定于其中。若在同一麻醉过程中还需进行其他操作，则应在动物恢复意识前再穿上背心。

4. 心肌梗死

注意：本模型所用动物的心肌梗死通过既往已发表的方法建立7。

  1. 在进行心外膜和心内膜注射操作前2周实施心肌梗死模型制备8,9,10。在冠状动脉再灌注后立即于同一手术过程中植入渗透压微型泵。

5. 药物或细胞给药

  1. 开胸术与心外膜细胞注射
    1. 以每公斤体重22 mg的剂量静脉注射头孢唑林作为预防性抗生素（参见 材料表每90分钟重复一次，贯穿整个实验过程。
    2. 将动物置于右侧卧位。
    3. 应用100 µg/h芬太尼透皮贴剂（参见 材料表) 至猪耳后方的平坦平面，覆盖粘性敷料或使用2-0缝线缝合。
      注意：该贴剂在贴敷12小时后视为“起效”，可提供72小时的镇痛作用。
    4. 根据产品说明书设置电生理解剖标测系统的线缆和贴片（参见 材料表).
    5. 用蜡笔或手术标记笔在动物第4和第5肋骨之间标记一条10 cm的水平线。
    6. 用一支带有25 G针头的注射器，配制利多卡因（2 mg/kg）和布比卡因（1 mg/kg）的混合溶液。
    7. 无菌条件下准备手术区域并覆盖动物。 在标记的切口位置进行皮内线状阻滞：以浅角度将针头刺入皮肤，稍回抽注射器活塞以确认无血液回流，随后在缓慢退出针头的同时逐渐注入药液。沿切口线移动，重复此操作。
      注意：每次更换注射部位时，必须对注射器施加负压，以确保布比卡因未注入血管内。布比卡因若进入血管，可迅速导致死亡。
    8. 使用22号手术刀，沿标记线做一条10 cm的皮肤切口。
    9. 使用单极电刀（参见 材料表），切开下方的肌肉层，直至暴露肋间肌。
    10. 准备一支无菌注射器，内含每公斤体重0.5 mg的布比卡因和每公斤体重1 mg的利多卡因，并连接一支25 G针头。
    11. 在第四肋骨尾侧边缘以较小角度插入针头。向针筒活塞施加负压，以确保针头未穿透肋间静脉或动脉。保持针头静止，缓慢注入四分之一针筒体积的液体。
    12. 在第四肋骨尾侧边缘沿其走向间隔3-5 cm的另外三个位置，重复步骤5.1.12。
    13. 使用梅岑鲍姆剪刀（参见 材料表在与麻醉师确认后，小心切开肋间肌，然后切开胸膜。
    14. 当切开胸膜时，关闭呼吸机以使肺组织远离胸膜。完成切口后，重新打开呼吸机，并将呼气末正压调整至 4 cmH₂O。2O.
    15. 在肋骨之间放置自持式肋骨牵开器，并缓慢打开以暴露心脏。使用组织镊轻轻夹住心包膜，用梅岑鲍姆剪刀进行切开，使心脏得以显露。
      注意：在此步骤及后续几个步骤中，心律失常较为常见。需密切监测心电图，若动物出现血流动力学不稳定（平均动脉压低于55 mmHg），必须暂时停止所有心脏操作。根据需要静脉推注间羟胺（0.25 mg）以改善血压。
    16. 在心包切口的两端及两侧放置临时的2-0缝线，将心包固定于胸壁，以形成心包腔。确保心包侧缘得到支撑，使心包腔尽可能浅。
    17. 使用湿润的棉签或剖腹手术纱布填塞心脏周围区域，以帮助保持心脏稳定，并防止暴露的组织干燥。
    18. 用食指置于左心室后方，将心尖从心包腔内托出。注意尽量减少对左心室的压迫。
      注意：健康的心脏可以舒适地跳动，心尖垂直指向下方，基底得到轻柔支撑但无受压。操作过程中可能伴随血压的初始下降，但在无心室外部受压的情况下，血压必须恢复至可接受水平。
      1. 如果在15秒内无恢复或恢复极为迟缓，应立即将心脏回纳至心包腔，并在进一步移位前采取必要措施改善血流动力学参数。
        注意：如果心室可以脱位，可通过在心包内放置大小合适的纱布垫以支撑心室，从而维持心尖在心包外的位置。同样，可将一根细长且湿润的棉拭子置于心脏基底部下方，起到“吊带”的作用，引导心尖向上朝向切口方向移动。图1A).
    19. 使用电生理标测导管创建左心室心外膜表面的电解剖电压图图1B）。通过标准电压阈值确定瘢痕区、边缘区和远端区。
      注意：瘢痕区和远端区通过双极性阈值进行定义 <0.5 mV 或 >1.5 mV，以及单极导联的截止值 <3 mV 或 >8.3 mV11,12.
    20. 将27 G治疗给药注射器的针头弯曲至大约80–90°角。
    21. 以浅角度将针头推进至目标组织，并推动注射器活塞施加压力，注入总体积的1/4至1/3。必须观察到组织变白（图1C）。使用电生理标测导管在生成的心外膜电压图上标注注射位点位置（图1D).
      注：视频方案中出于演示目的，使用细胞培养基（RPMI 1640）作为溶剂对照注射。
    22. 部分撤出针头，并在心肌内调整针头方向。再注入注射器容积的1/4至1/3。重复此操作直至注射器排空。
    23. 重复步骤 5.1.20 至 5.1.24，直至递送完所需剂量。
    24. 移除心脏周围的棉签包装，并轻轻取出心脏下方的“吊带”，使心脏恢复至中立位置。此步骤中常出现心律失常，须按照步骤 5.1.17 中所述谨慎操作。
    25. 移除心包上的2-0固定缝线。松开牵开器并将其从胸腔中取出。
    26. 使用带钝头圆针的1号聚对二氧环己酮缝线（PDS），穿过第3与第4肋骨之间以及第5与第6肋骨之间的间隙，缝合胸腔。
      注意：采用细窄的8字缝合可产生滑轮效应，以实现肋骨的对合。根据动物体型大小，需使用两到三根此类缝线。
    27. 在收紧并打结肋骨对合缝线之前，将一段较短的硅胶管插入切口的腹侧边缘。
    28. 将管路的自由端放入盛有无菌生理盐水的容器中，以实现胸膜腔的水封式引流。
    29. 用2-0可吸收缝线以单纯连续缝合方式闭合深层肌肉层。皮肤采用单纯连续或福特锁边缝合方式闭合。13 使用2-0或3-0不可吸收缝线。
    30. 伤口关闭完成后，通过正压通气作用将胸腔内的游离空气排出。
      1. 将呼吸机调至“自由呼吸”模式。使用循环回路中的储气囊为气道提供持续的正压（维持在20-30 cmH₂O）。2O)
      2. 持续施加压力，直至生理盐水碗中不再观察到气泡，表明胸腔内无游离空气。
      3. 移除硅胶管。
    31. 在手术部位贴上粘性敷料，并分散放置间断缝合缝线以帮助固定敷料。
    32. 恢复期间，皮下注射0.3 mg/kg的美沙酮和0.2–0.5 mg/kg的昂丹司琼（参见 材料表静脉注射。
  2. 颈静脉渗透压微型泵植入
    1. 按照步骤3.1所述放置动物。无菌准备并铺巾于动物颈部右侧。
    2. 使用22号手术刀片，从胸骨柄外侧2-3 cm处开始，向头侧延伸做一8-10 cm长的切口。该切口在向头侧延伸时应略偏向外侧。
    3. 使用梅岑鲍姆剪刀解剖分离颈浅肌、胸骨舌骨肌和胸骨头肌。采用钝性分离技术加深切口，直至可见颈外静脉。
    4. 在切口处放置自持式拉钩并打开，以改善视野。
    5. 使用 Adson 棕色组织镊（参见 材料表）以及梅岑鲍姆剪刀，清除颈静脉上下周围的软组织（图2A这一步骤至关重要，因为在后续阶段，覆盖在血管上的软组织可能会阻碍微型泵导管的通过。
    6. 使用5-0可吸收缝线穿过静脉尾端暴露的末端，位置大约在血管最尾端可见边缘头侧1 cm处。以5 mm的进针间距按以下方式进针：右侧从头侧向尾侧进针，自右向左，左侧从尾侧向头侧进针。最终形成的缝合轨迹应呈“方形的三边”状。确保两端缝线尾部长度相等。
    7. 按照产品说明书中的描述组装微型泵（参见 材料表).
    8. 在血管的头端和尾端分别用弹力血管结扎环套住，初始时保持松弛。让助手拉紧血管结扎环以阻断血管。
    9. 使用14号针头，在缝合材料形成的“三角形区域”中心的静脉处穿刺（步骤5.2.7）； 图2B).
    10. 将微型泵导管插入穿刺点。导管必须能顺利进入血管。若遇到阻力，切勿继续推进；应将导管退出，重新尝试。
    11. 将导管推进至距血管外剩余1-2 cm处。用缝合线在导管周围收紧并打简单的间断结固定。助手松开并移除血管结扎线。
    12. 用2-0不可吸收缝线在微型泵体上缠绕数圈并打结，确保缝线牢固固定在泵体上。随后，使用单纯间断结将泵固定于邻近软组织图2C，D).
    13. 取出切口内的牵开器。以标准的三层连续缝合法关闭切口。
    14. 在恢复期间皮下注射0.2 mg/kg的美洛昔康。
  3. 经皮经心内膜注射
    1. 将动物置于仰卧位，前肢和后肢伸展，并用绑带固定。
    2. 无菌处理动物的尾腹部及内侧大腿。使用带窗口的股动脉造影手术巾覆盖动物（参见 材料表).
    3. 根据产品说明书设置电生理解剖标测系统的线缆和贴片（参见 材料表).
    4. 使用线阵超声探头定位股动脉。在超声引导下，用Cook穿刺针穿刺股动脉，并置入0.035英寸导丝进入血管 通过 导丝上移除针头。
    5. 沿动脉导丝插入8 Fr动脉鞘管及导入器，并推进至仅鞘管接头外露于皮肤。确保导丝始终可见，从鞘管接头处穿出。
      注意：由于套管较大，有时可能需要使用11号手术刀做一小切口以方便通过。
    6. 移除鞘管导入器和导丝。给予静脉肝素（100–200 单位/千克）。
    7. 通过鞘管引入经心内膜注射导管，并推进至左心室 通过 经逆行主动脉入路
    8. 通过轻柔地在心内膜表面拖动导管，构建左心室的电解剖图。通过轴向旋转及轻柔调整导管头端弯曲角度，以获得良好的心内膜接触。根据标准电压阈值识别瘢痕区、边缘区和远端区。
    9. 在X线透视和电生理标测系统的引导下，将导管送至理想的注射部位。通过轻柔的轴向旋转并偏转导管远端头端，以实现并维持稳定的心内膜接触。
    10. 通过至少两个角度的透视视图确认导管尖端的位置。轻柔推进核心导管，随后将针头延伸至预定的心肌内深度（心尖部注射为3.5 mm，室间隔注射为5 mm）。
    11. 冲洗4-6 mL含碘造影剂（参见 材料表) 通过注射导管注入，直至在透视下可见。观察造影剂接下来的10–30秒，以确保其停留在组织内。图3A).
    12. 在针头推进和注射过程中需密切观察心电图，因为室性异位搏动的成串出现较为常见。
      注意：心室异位是指针尖与心肌接触。
    13. 如果造影剂注射成功，则接着注射目标试剂。使用造影剂冲洗，直至在荧光透视下观察到为止。
      注意：所关注的试剂因用户而异，具体取决于其正在测试的治疗方法。
    14. 回撤针头。将注射导管从动脉鞘中取出。
    15. 移除动脉鞘，并在穿刺部位加压长达20分钟，直至实现止血。

6. 全身麻醉恢复

  1. 关闭正在使用的吸入麻醉或静脉麻醉泵。将呼吸机的呼吸频率调低至 8-10 次/分钟。
  2. 2-5 分钟后，将呼吸机切换至“自由呼吸”模式，每次持续时间不超过 30 秒。观察动物及二氧化碳波形图，判断是否出现自主呼吸。
  3. 若已出现自主呼吸，保持呼吸机关闭；若动物仍无呼吸，重新开启呼吸机通气 1-2 分钟后再次尝试，直至恢复自主呼吸。
    注意：恢复所需时间因手术操作和动物个体差异而异，通常在 15 分钟至 1 小时之间。
  4. 当动物呼吸平稳（呼吸频率为 15-30 次/分钟，呼气末二氧化碳低于 60，血氧饱和度 SpO₂ 高于 95%）时，断开氧气连接，保留其他监测设备。
  5. 移除临时建立的血管通路，并施加压力以防止血肿形成。若动物在接下来 5 分钟内保持生命体征稳定且氧合良好，即可转运至恢复区域。
  6. 当动物连续出现三次自主吞咽动作后，放空气管插管的气囊，并轻柔拔除插管。
  7. 继续监测动物至少 5 分钟，确保其持续保持良好氧合，且未出现呼吸困难。若拔管后动物出现氧饱和度下降，应根据需要给予面罩吸氧。

结果

开胸术与心外膜细胞注射
接受开胸术及心外膜注射的29只动物中，有26只存活。组织学分析证实，所有存活动物均成功植入了通过该方法递送的人源细胞（图1E）。1只动物在细胞注射过程中出现致死性心律失常，未能复苏成功。另1只动物在关胸过程中出现无脉性电活动，尽管长时间对气道施加正压，仍未能恢复。第3只动物在拔管后发生呕吐并随即出现呼吸骤停，未能成功复苏。

两只动物出现严重并发症，但均成功恢复。一只动物在心肌内注射过程中发生心室颤动，经使用心内除颤板和心脏按摩后成功复苏；另一只动物在拔管时发生呕吐并出现短暂呼吸停止，但迅速重新插管后恢复良好。这些事件均发生在早期实验阶段，随着团队对实验方案操作经验的积累，不良事件发生率有所降低。表1).

颈静脉渗透压微型泵植入
未见与颈静脉渗透压微型泵植入相关的死亡或重大并发症报道。7只动物中的大多数在术后24小时内手术部位出现轻度肿胀，无需干预即自行消退。泵植入后第3天对血清进行的ELISA检测表明，该泵具有显著效果，与对照组相比，人血小板源性生长因子AB（PDGF-AB）在血液中的浓度显著升高7（图2E）。

经皮经心内膜注射
共有22只动物接受了心内膜注射。其中17次注射被认为是“成功”的，依据是在动物死后于靶组织中观察到荧光或墨汁染色（图3B）。本操作未导致任何动物死亡。一只动物因右心室穿孔出现少量心包积液，但为自限性，未引起心血管功能障碍。该动物最终死亡，但原因是心肌内注射后进行的另一项无关的附加操作所致。

外科手术、心脏标测、荧光显微镜；电生理实验、心脏组织。
图1：经心外膜心肌细胞注射可实现心脏的直接可视化，并将高比例的存活细胞递送至心肌组织。（A）通过将湿润纱布带引导至心脏基底部下方，暴露心尖部位。（B）心外膜标测导管用于界定瘢痕区及边缘区，并标注注射位点。（C）使用31 G针头经心外膜将细胞注射至心肌内。（D）带有注射位点标注的心外膜电压图。紫色：正常电压，健康心肌；红色：异常电压，病变心肌；灰色圆点：注射位点。动物处死后，取出心脏并用福尔马林固定，用于后续组织学评估。（E）通过免疫染色检测移植的人源细胞，所用抗体包括人源抗核抗体Ku80及抗GFP抗体。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

外科植入过程，PDGF释放实验；显示对照组与实验组PDGF水平的图表。
图2：颈静脉微型泵植入为在7天时间内递送血小板源性生长因子（PDGF）提供了一种安全且可靠的方法。 (A暴露右侧颈静脉，并清除血管周围的软组织。B) 血管结扎以闭塞血管，同时使用14 G针头穿刺，通过该穿刺孔道将微型泵导管插入。C将微型泵导管插入静脉，并将微型泵主体固定于邻近软组织。D) 植入前的微型泵本体和导管。E) 递送的重组蛋白的血清浓度 通过 在植入后第3天，通过ELISA检测每只动物的微型泵和PDGF-AB含量。接受PDGF-AB的动物血液中PDGF-AB浓度显著高于对照组动物，证实了渗透压微型泵给药方法的有效性。**表示组间差异具有统计学意义（p = 0.005，Mann-Whitney U 检验 请点击此处以查看此图的放大版本。

用于手术中胆管显影的导管X射线与荧光图像。
图3：经心内膜心肌内注射可实现微创治疗递送。 (A) 右前斜位X射线透视图像，显示注射导管（白色箭头）将造影剂（黄色箭头）注入心肌。造影剂注射在治疗性注射前后均进行，以确认针头位于心肌内。(B) 注入的载体表达绿色荧光蛋白（GFP），以便在组织采集后观察到荧光信号，从而确认注射成功。 请点击此处查看该图的高清版本。

经心外膜注射 (n = 29)经心内膜注射 (n = 22)渗透压微型泵 (n = 7)
死亡率 300
术后呕吐与呼吸骤停100
注射期间发生心室颤动100
关胸期间出现无脉电活动100
发病率010
气胸000
胸腔积液000
心腔穿孔010
出血000

表1：并发症列表。

讨论

经心外膜心肌内注射
该方法具有直接观察心脏的优势，并已证明其对治疗药物的局部滞留效果优于全身给药方法9,10,14。然而，开胸手术具有侵入性，需要较高的技术水平，且相较于其他方法，其并发症和死亡风险更高10,15。了解该操作过程中关键且高风险的阶段，有助于降低上述风险。

由于存在较高的心律失常风险及相关的血流动力学障碍，在操作心脏以暴露心尖时必须格外谨慎。持续的有创血压监测和心电图检查有助于快速识别低血压或不稳定的心律失常，从而便于及时干预和纠正。短暂性低血压通常可通过静脉推注间羟胺进行治疗。持续性低血压可暂时通过降低吸入麻醉剂浓度（需密切监测麻醉深度）并启动血管加压药物输注来处理，同时应同步查明血流动力学异常的原因。对于不稳定的心律失常（如室性心动过速或心室颤动），可采用电复律治疗，必要时联合静脉使用抗心律失常药物。

在关闭胸腔前，成功清除胸膜腔内的游离气体对动物的存活同样至关重要。若未充分排气，可能导致气胸的发生，使动物在术后脱离机械通气时面临严重的呼吸功能障碍甚至死亡的风险。应维持正压气道至少30秒，直至观察不到气泡产生为止。一旦气泡停止逸出，应立即拔除硅胶管，并迅速关闭胸腔。此外，也可在关胸时手术置入胸腔引流管，以便在术后24至72小时内手动排出空气和炎性液体。然而，这种方法难以保持清洁和完整，尤其是在动物群养的情况下。引流管若受损或污染，可能引发脓胸、气胸或败血症。根据我们的经验，若在关胸前已充分清除游离气体，则无需放置临时胸腔引流管。

经皮经心内膜心肌内注射
与手术方法相比，这种治疗给药方式因其侵入性较小，可在实现局部组织递送的同时降低风险10,14。该技术已应用于大型动物研究，在无法直接可视的情况下，可借助X线透视和电机械标测进行引导10,16,17。

由于心脏不在直视下，操作者在选择注射位点时应谨慎使用正交透视视角。此外，在注射治疗剂之前先注射稀释的碘造影剂，对于确认心肌接触极为重要。通过观察特征性的“心肌染色”现象，可以确认接触是否恰当，这种现象可能是组织取材前判断注射成功与否的唯一指标之一。由于存在心腔穿孔的风险，建议所选注射位点的心肌壁厚度应大于9 mm14,16。

颈静脉渗透压微型泵
渗透压微型泵是一种在小型动物研究中广泛使用的装置。由于其能够在设定的时间段内以恒定速率递送治疗药物，近年来在大型动物模型中应用该装置的兴趣日益增加7,18,19。该方法可能存在的一个局限性在于，若不更换或移除泵，则无法调整或停止药物的输注速率。在采用此种方式开展治疗试验前，应充分考虑这一因素。

本研究表明，该方法在猪体内操作具有较高的成功率，且发病率和死亡率较低。需要注意的是，手术部位邻近许多重要结构，包括淋巴结、胸腺和颈动脉。强烈建议严格遵循本方法，并参考解剖学文献20，以避免意外损伤这些结构。该方法最令人担忧的并发症是由于意外损伤颈静脉或周围结构所导致的失血性休克。因此，必须仔细清除颈静脉周围的软组织。若未能正确完成此步骤，可能导致难以放置微型泵导管或无法有效控制意外出血。

本文介绍了三种心脏活性治疗药物的递送方法。尽管每种技术均有成功报道，但仍存在固有的局限性需要考虑。侵入性操作（经心外膜注射）可提高治疗药物递送的准确性，但同时也带来更高的潜在致命并发症风险。此外，侵入性递送对操作技术要求更高，以尽量降低并发症风险。同样，荧光透视引导下的经心内膜注射也需要一定的技术能力来进行导管插入及器械操作。若该方法操作不当，可能导致注射失败并引发致命并发症。

所述的直接注射方法可用于将治疗剂一次性递送至靶组织。颈静脉植入渗透压微型泵则可实现治疗剂在7天内的持续全身给药。相比之下，该方法操作更简便且相关风险更小，但其疗效依赖于治疗剂通过全身循环到达心肌。此外，一旦微型泵植入完成，在不重新麻醉动物并取出泵的情况下，无法终止给药或调整给药速率。

本文所述所有方法均在心肌梗死当天或两周后于动物身上实施。因此，本研究无法报告上述方法在健康动物或经历其他类型心脏病变的动物中的应用效果。最后，任何预期药物的药理学与生物技术特性均需仔细考量，因为这些因素将与所选递送途径的有效性密切相关。对此进行详细讨论已超出本论文的范围。

对临床前方法进行全面描述有助于动物福利以及更广泛的科学界。由此带来的实验操作和结果的可重复性提升，可减少动物健康并发症，降低获得显著结果所需的动物数量，并增强对实验结果的信心21,22。本文描述了在猪模型中用于治疗心肌梗死的三种新型治疗剂给药方法。通过详细说明所采用的技术，并阐明每种方法的优势与风险，期望研究人员能够顺利建立符合其研究目标的稳定且可靠的临床前模型。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（APP1194139/APP1126276，JC）、澳大利亚国家干细胞基金会和新南威尔士州政府卫生与医学研究办公室（JC）的资助项目资助。DS 获得皇家澳大利亚内科医学院、临床病理学与医学研究研究所和澳大利亚政府研究培训计划的支持。TD 获得临床病理学与医学研究研究所、奔富家族奖学金、澳大利亚国家健康与医学研究委员会（APP2002783）以及澳大利亚国家心脏基金会（104615）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>中心静脉导管置入
2-0 缝合线EthiconJJ9220
Arrow® 儿科双腔中心静脉导管置管包（含蓝色FlexTip导管）（内含18G Cook针和0.035" J-tip导丝TeleflexCS-14502中心静脉导管
绿色荧光蛋白（GFP）Abcamab139701:100 稀释比例
<强>组织学抗体
Ku80细胞信号技术C48E71:500 稀释比例
11号手术刀Swann-Morton203
Sparq 超声系统PhilipsMP11742 Medpick
无菌超声探头套Atris28041947
中号带口袋猪用背心Lomir BiomedicalSS J2YJJET
<强>颈静脉渗透压微型泵植入
阿德森布朗组织镊Icon 医疗用品KLINI316012
贝尔卢奇自持牵开器surgicalinstruments.net.au第24组-26.02自持式组织牵开器
带有“边缘”涂层电极的电外科笔CovidienE2450H电烙笔
梅岑鲍姆剪刀Icon 医疗用品ARMO3250
No. 22 手术刀片Swann-Morton208
尼龙缝合线  (2-0, 3-0)EthiconD9635, 663G
渗透压输注微型泵Alzet2ML1, 2ML2, 2ML4
血管硅胶结扎带Vecmedical95001
Vicryl 缝合线（5-0）EthiconW9982
<强>经皮经心内膜注射
Artis Zee' C型臂X线透视系统 西门子 IR-19-1994
CARTO' 3 系统  Biosense Webster电生理标测软件 &和系统
Cook穿刺针Cook MedicalG07174插管针
快速导管引入器（6 法规，8 法规）Abbott406204, 406142带导引器和导丝的血管鞘
Myostar 注射导管Biosense Webster121117S, 121119S, 1211120S心肌内注射导管
No.11 手术刀Swann-Morton203
欧乃派克® 碘海醇造影剂GE HealthcareAUST R 39861 碘化对比剂
Sparq 超声系统飞利浦MP11742 Medpick
<强>镇静 &和全身麻醉
复方乳酸钠林格溶液自由屈曲894451
芬太尼 50 mcg/mL辉瑞AUST R 107027静脉麻醉与镇痛
异氟烷AbbottAUST R 29656 吸入性麻醉剂
GE Aestiva 5 麻醉机 Datex Ohmeda17002-9, 17002A9 Avante Health Solutions麻醉机 
Hypnovel® 咪达唑仑 5 mg/mL罗氏AUST R 13726镇静剂
静脉留置针BD Angiocath38113720 号套管针
氯胺酮“Ketamil” 10 mg/mL髂骨APVMA 编号：51188c 镇静剂
喉镜MillerVDI-6205
右美托咪定 1 mg/mL髂骨APVMA 编号 64251；ACVM 编号 A10488 镇静剂
间羟胺 10 mg/mLPhebraAUST R 284784短效血管加压药
美沙酮 10 mg/mL髂骨APVMA 编号：63712 镇静剂，管制药品
Onsetron' 盐酸昂丹司琼 2 mg/mLAccord HealthcareAUST R 205593 止吐剂
Propofol-Lipuro' 丙泊酚 10 mg/mL布劳恩AUST R 142906 静脉麻醉药
脉搏血氧仪 MeditechGVPMT-M3S便携式脉搏血氧仪
Shiley 带套囊基础型气管插管（规格 5.5） & 6.0)美敦力86108-, 86109-
Shiley 气管插管导丝，10 Fr美敦力85864
0.9% 氯化钠自由屈曲FAH1322
<强>开胸术与心外膜细胞注射
27 G 胰岛素注射针头Terumo51907
阿德森布朗组织镊Icon 医疗用品KLINI316012
CARTO' 3 系统  Biosense Webster电生理标测软件 &和系统
头孢唑林 1 g 小瓶AFT Pharmaceuticals9421900137367 CH2抗生素预防 
胸腔引流管SurgiVetSKU-336
Cook穿刺针Cook MedicalG07174插管针
库利胸骨牵开器（小儿型）Millennium Surgical9-61287
多瑞吉 100 微克/小时 芬太尼贴剂扬森AUST R 112371 术后镇痛
带有“边缘”涂层电极的电外科笔CovidienE2450H电烙笔
带“边缘”涂层电极的电外科笔CovidienE2450H电烙笔
快速导管引入器（6 法规，8 法规）Abbott406204, 406142带导引器和导丝的血管鞘
利多卡因 20 mg/mL辉瑞AUST R 49296、AUST R 49297、AUST R 49293 和 AUST R 49295局部麻醉，抗心律失常
Marcaine' 布比卡因 0.5%辉瑞AUST R 48328 局部麻醉 
梅岑鲍姆剪刀Icon 医疗用品ARMO3250
22号手术刀Swann-Morton208
尼龙缝合线  (2-0, 3-0)EthiconD9635，JJ76264
1号PDS缝线EthiconJJ75414
Sparq' 超声系统飞利浦MP11742 Medpick
无菌纱布KerlixKE5072
无菌剖腹手术纱布Propax2907950
Thermocool Smartouch 导管Biosense WebsterD133601, D133602, D133603心外膜标测导管

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