使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性

摘要

本实验方案重点介绍利用蛋白质印迹技术研究神经元中K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性。方案详细描述了对KCC2在激酶调控位点Thr906/1007处磷酸化水平的检测方法。 通过 western印迹。此外，本文还简要介绍了其他用于验证KCC2活性的方法。

摘要

钾氯共转运蛋白2（KCC2）是溶质载体家族12（SLC12）中阳离子-氯离子共转运蛋白（CCCs）的一员，仅存在于神经元中，对氯离子（Cl⁻）稳态的正常调控至关重要^- 稳态，从而影响GABA能抑制功能。KCC2调控异常具有破坏性，已被证实与包括癫痫在内的多种神经系统疾病的发生相关。随着研究技术的发展，科研人员得以探究KCC2的功能与活性，有关其调控机制的研究已取得显著进展；这些技术或可 通过 直接（评估激酶调控位点的磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性）的研究方法。本文重点介绍如何利用蛋白质印迹技术检测KCC2在激酶调控位点Thr906和Thr1007的磷酸化水平。此外，还有其他经典方法可用于直接测量KCC2活性，例如铷离子和铊离子摄取实验。进一步地，膜片钳电生理技术可用于测量GABA活性，从而通过评估细胞内氯离子稳态间接反映KCC2的激活或失活状态。本文将简要讨论其中部分附加技术。

引言

氯化钾共转运蛋白2（KCC2）是溶质载体家族12（SLC12）中阳离子-氯离子共转运蛋白（CCCs）的一员，仅存在于神经元中，对氯离子（Cl⁻）正常功能的维持至关重要^- 稳态以及随之而来的功能性GABA能抑制^1,2,3,4. 神经元内低氯离子浓度的维持^- 浓度（[Cl⁻]）^-]_i在脑和脊髓中，通过KCC2将细胞内Cl⁻浓度维持在4-6 mM水平，促进γ-氨基丁酸（GABA）/甘氨酸介导的超极化及突触抑制⁵KCC2 调控异常与多种神经系统疾病（包括癫痫）的发生密切相关⁴此外，KCC2介导的Cl⁻外排功能下降⁻ 外排及受损的超极化性GABA_A 以及/或者甘氨酸受体介导的电流已被证实与癫痫、神经性疼痛和痉挛有关^6,7神经元KCC2受到负向调节 通过 其C末端胞内区关键调控残基被无赖氨酸（with-no-lys....

方案

注意：本实验方案描述了通过蛋白质印迹法检测特定目标蛋白的方法。

1. 细胞培养与转染

1. 在进行细胞培养操作前，将所有试剂在珠浴中预热至 37 ˚C。准备培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清，以及各 1% 的 2 mM L-谷氨酰胺、100 倍非必需氨基酸、100 mM 丙酮酸钠和 100 单位/毫升青霉素-链霉素。
2. 在珠浴（37 ˚C）中完全解冻稳定转染的大鼠 KCC2b 人胚胎肾 293 细胞（HEK293^rnKCC2b）¹⁸。将细胞从冻存管转移至含有 5 mL 新鲜培养基的离心管中，在 1200 ×g 条件下离心 3–5 分钟。
3. 使用连接真空泵的移液器吸除上清液，并加入 10 mL 新鲜培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至 10 cm 培养皿中。
4. 将培养皿放入培养箱，在 37 °С、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养 48 小时。监测培养过程以确保细胞健康生长。培养结束后，当细胞融合度超过 90% 时进行进一步传代。
5. 吸除细胞培养皿中的旧培养基，用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。加入 2 mL 胰蛋白酶，在室温下孵育约 1–2 分钟。
6. 用 2 mL 完全培养基轻轻冲洗消化....

结果

此处，图1 所示的代表性结果利用蛋白质印迹技术，研究了星形孢菌素（staurosporine）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）对稳定表达KCC2b的HEK293细胞系（HEK^rnKCC2b）¹⁸中WNK-SPAK/OSR1介导的KCC2和NKCC1磷酸化的影响。有关代表性结果的详细信息见Zhang等人的研究¹⁵。与NEM类似，星形孢菌素是一种广谱激酶抑制剂，可增强KCC2的转运活性并抑制NKCC1的活性^15,20。对HEK293细胞使用星形孢菌素和NEM处理后，SPAK靶位点的磷酸化水平降低——即位于T环激酶结构域内的Thr233位点，以及人源SPAK（hsSPAK）S环磷酸化位点Ser373。因此，这两种化合物均降低了上述SPAK磷酸化位点的磷酸化水平。此外，星形孢菌素降低了HEK^rnKCC2b

讨论

已采用多种方法来检测在神经元中表达的 SLC12 家族阳离子-氯离子共转运蛋白（CCC）的活性，包括 KCC2。其中许多技术已被证实有助于深入理解这些转运蛋白的功能相关性及其在不同疾病相关突变中的结构-功能关系。关键的是，各种方法均存在各自的优势与局限性²¹。然而，上文所述方案重点介绍了如何利用蛋白质印迹法（western blot）检测 KCC2 在激酶调控位点 Thr906 和 Thr1007 上的磷酸化水平，该方法对于研究 KCC2 的功能与活性具有重要意义。

KCC2的调控通过在关键的丝氨酸/苏氨酸残基上的磷酸化与去磷酸化实现¹。Western印迹是一种有效的技术，可用于研究KCC2在Thr906和Thr1007激酶调控位点的磷酸化状态。该方法的基本原理是利用针对目的免疫印迹样品/蛋白质中磷酸化肽段的磷酸化位点特异性抗体，检测KCC2磷酸化水平的变化。Western印迹法用于从组织或细胞样品中检测特定的目标蛋白。该方法首先通过电泳根据蛋白分子大小进行分离，然后将蛋白通过电转移方式.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A2917	用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	248614	用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶
抗 pSPAK 抗体	Dundee University	S670B	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 抗体	Dundee University	S700C	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pSer940 抗体	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr1007 抗体	Dundee University	S961C	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr906 抗体	Dundee University	S959C	用作 Western 印迹的一抗
抗小鼠二抗	Cell Signalling technology	66002	用作 Western 印迹的二抗
抗 NKCC1 抗体	Dundee University	S841B	用作 Western 印迹的一抗
抗 NKCC1 pThr203/207/212 抗体	Dundee University	S763B	用作 Western 印迹的一抗
抗兔二抗	Cell Signalling technology	C29F4	用作 Western 印迹的二抗
抗绵羊二抗	abcam	ab6900	用作 Western 印迹的二抗
抗 SPAK 抗体	Dundee University	S669D	用作 Western 印迹的一抗
抗-β-微管蛋白 III 抗体	Sigma-Aldrich	T8578	用作 Western 印迹的一抗
苯胺	Merck UK	135828	用作裂解缓冲液的组分
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148	用作上样缓冲液和裂解缓冲液的组分
Bradford 考马斯亮蓝	Thermo Scientific	1856209	用于裂解液蛋白定量
凝胶制备装置	Atto	WSE-1165W	用于运行 SDS-PAGE 电泳
离心机	Eppendorf	5804	用于裂解液制备
离心机	VWR	MicroStar 17R	用于样品离心
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	用于细胞培养实验
脱脂奶粉	Marvel	N/A	用于制备封闭缓冲液
杜氏改良伊格尔培养基 - 高糖	Sigma-Aldrich	D6429	用于细胞培养
ECL 显影试剂	Perkin Elmer	ORTT755/2655	用于 Western 印迹图像的显影
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	用作裂解缓冲液的组分
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	用作裂解缓冲液的组分
电泳电源	BioRad	PowerPAC HC	为 SDS-PAGE 电泳提供电源
乙醇	ThermoFisher	E/0650DF/17	用于制备无菌设备和环境
胎牛血清 -  热灭活	Merck Life Sciences UK	F9665	用于细胞培养
通风橱	Walker	A7277	用于细胞培养
转印滤纸 - Whatman	GE Healthcare	10426981	用于 Western 印迹中制备转印夹心结构
甘氨酸	Sigma-Aldrich	15527	用于制备缓冲液
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software, Inc., USA	版本 6.0	用于绘制 Western 印迹的图表并进行数据分析
HCl	Acros Organics	10647282	用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶
加热金属块	Grant	QBT1	用于加热 Western 印迹上样样品
HEK293 细胞	Merck UK	12022001-1VL	用于培养实验的细胞系
ImageJ 软件	Wayne Rasband 及贡献者；NIH, USA	ImageJ 1.53e	用于测量 Western 印迹图像中的条带强度
成像系统	BioRad	ChemiDoc MP	用于获取 Western 印迹图像
培养箱	LEEC	LEEC precision 190D	用于细胞培养
异丙醇	Honeywell	24137	用于电泳凝胶的制备
L-谷氨酰胺溶液	Sigma-Aldrich	G7513	用于细胞培养
十二烷基硫酸锂 (LDS)	Novex	NP0008	用作 Western 印迹的上样缓冲液
MEM 非必需氨基酸	Merck Life Sciences UK	M7145	用于细胞培养
微量离心机	Eppendorf	5418	用于制备 Western 印迹用裂解液
酶标仪	BioRad	iMark	用于测定裂解液蛋白浓度
Microsoft PowerPoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	用于编辑 Western 印迹图像
分子量标记物	BioRad	1610373	用于 Western 印迹
N-乙基马来酰亚胺	Thermo Fisher Scientific	23030	用于细胞培养实验
硝酸纤维素膜	Fisher Scientific	45004091	用于 Western 印迹
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	用于细胞培养
pH 计	Mettler Toledo	Seven compact s210	用于监测缓冲液的 pH 值
苯甲基磺酰氟 (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	用作裂解缓冲液的组分
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537	用于细胞培养
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	用作 Western 印迹的一抗
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	用于免疫沉淀
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用作洗涤缓冲液的组分
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用于制备 TBS-T 缓冲液
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L5750	用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶
正钒酸钠	Sigma-Aldrich	S6508	用作裂解缓冲液的组分
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	S8636	用于细胞培养
甘油磷酸钠-β	Merck UK	G9422	用作裂解缓冲液的组分
星形孢菌素（来自 Streptomyces sp.）	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	用于细胞培养实验
蔗糖	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	用作裂解缓冲液的组分
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶
转印槽	BioRad	1658005EDU	用于 Western 印迹中将蛋白转印至膜上
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	用作裂解缓冲液的组分
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Merck Life Sciences UK	T4049	用于细胞培养
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	用于制备 TBS-T 缓冲液
真空泵	Charles Austen	Dymax 5	用于细胞培养
涡旋振荡器	Scientific Industries	K-550-GE	用于样品制备
涡旋混合器	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	用于混合已溶解的样品
水浴锅	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	用于孵育溶液