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方法文章

使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性

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DOI：

10.3791/64179

⸱

2022年12月9日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

本文内容

摘要

本实验方案重点介绍利用蛋白质印迹技术研究神经元中K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性。方案详细描述了对KCC2在激酶调控位点Thr906/1007处磷酸化水平的检测方法。 通过 western印迹。此外，本文还简要介绍了其他用于验证KCC2活性的方法。

摘要

钾氯共转运蛋白2（KCC2）是溶质载体家族12（SLC12）中阳离子-氯离子共转运蛋白（CCCs）的一员，仅存在于神经元中，对氯离子（Cl⁻）稳态的正常调控至关重要- 稳态，从而影响GABA能抑制功能。KCC2调控异常具有破坏性，已被证实与包括癫痫在内的多种神经系统疾病的发生相关。随着研究技术的发展，科研人员得以探究KCC2的功能与活性，有关其调控机制的研究已取得显著进展；这些技术或可 通过 直接（评估激酶调控位点的磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性）的研究方法。本文重点介绍如何利用蛋白质印迹技术检测KCC2在激酶调控位点Thr906和Thr1007的磷酸化水平。此外，还有其他经典方法可用于直接测量KCC2活性，例如铷离子和铊离子摄取实验。进一步地，膜片钳电生理技术可用于测量GABA活性，从而通过评估细胞内氯离子稳态间接反映KCC2的激活或失活状态。本文将简要讨论其中部分附加技术。

引言

氯化钾共转运蛋白2（KCC2）是溶质载体家族12（SLC12）中阳离子-氯离子共转运蛋白（CCCs）的一员，仅存在于神经元中，对氯离子（Cl⁻）正常功能的维持至关重要- 稳态以及随之而来的功能性GABA能抑制1,2,3,4. 神经元内低氯离子浓度的维持- 浓度（[Cl⁻]）-]i在脑和脊髓中，通过KCC2将细胞内Cl⁻浓度维持在4-6 mM水平，促进γ-氨基丁酸（GABA）/甘氨酸介导的超极化及突触抑制5KCC2 调控异常与多种神经系统疾病（包括癫痫）的发生密切相关4此外，KCC2介导的Cl⁻外排功能下降− 外排及受损的超极化性GABAA 以及/或者甘氨酸受体介导的电流已被证实与癫痫、神经性疼痛和痉挛有关6,7神经元KCC2受到负向调节 通过 其C末端胞内区关键调控残基被无赖氨酸（with-no-lysine, WNK）-STE20/SPS1相关富含脯氨酸/丙氨酸（SPAK）/氧化应激反应（OSR）激酶信号复合物磷酸化1，这有助于维持未成熟神经元中去极化的GABA活性2,8,9WNK-SPAK/OSR1 磷酸化苏氨酸残基 906 和 1007（Thr906/Thr1007），并随后下调 mRNA 基因表达 KCC2，导致其生理功能随之退化8,10更重要的是，目前已知的事实是，WNK-SPAK/OSR1激酶复合物能够磷酸化并抑制KCC2的表达1,2,4,11,12，且激酶复合物信号通路对Thr906/Thr1007位点的磷酸化抑制与该蛋白表达水平的上调相关 KCC2 mRNA基因13,14,15需要特别注意的是，神经元中 KCC2 和 Na 的调控+-K+-2Cl- 通过蛋白质磷酸化调节共转运蛋白1（NKCC1）的表达以协同且相反的模式进行1,4,16.

关于KCC2调控机制的理解已取得持续且显著的进展，这得益于相关技术的发展，使研究人员能够研究其功能与活性； 通过 直接（评估激酶调控位点的磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性）研究。本文所述方案重点介绍利用蛋白质印迹技术研究神经元K+-Cl- 通过研究共转运体在激酶调控位点Thr906/1007的磷酸化，探讨共转运体KCC2的功能.

Western blot 是一种用于从组织或细胞样品中检测特定目标蛋白的方法。该方法首先通过电泳根据蛋白质的大小进行分离，然后将蛋白质通过电泳转移至固相支持物（通常为膜）上，再利用特异性抗体标记目标蛋白。抗体可偶联不同的标签或荧光染料标记的二抗，通过比色法、化学发光法或荧光法进行检测。该技术可实现从复杂的蛋白质混合物中特异性地检测目标蛋白。该方法已被用于表征 KCCs 的磷酸化特异性位点1，并用于鉴定可抑制 KCC3 Thr991/Thr1048 磷酸化的激酶抑制剂17。通过遵循本实验方案，可从细胞或组织裂解液中特异性检测总 KCC2 蛋白及其磷酸化形式。原则上，该技术通过检测蛋白偶联的抗体，对于深入理解 KCC2 磷酸化位点的协同作用具有重要意义，有助于揭示其生理调控所涉及的分子机制。对总蛋白表达水平的定量分析可代表 KCC2 的功能与活性状态。此外，还有其他经典方法可直接测定 KCC2 活性，例如铷离子和铊离子摄取实验。其他技术如膜片钳电生理学则用于检测 GABA 活性，从而间接反映 KCC2 的激活或失活状态，其依据为细胞内氯离子稳态的评估结果。

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方案

注意：本实验方案描述了通过蛋白质印迹法检测特定目标蛋白的方法。

1. 细胞培养与转染

  1. 在进行细胞培养操作前，将所有试剂在珠浴中预热至 37 ˚C。准备培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清，以及各 1% 的 2 mM L-谷氨酰胺、100 倍非必需氨基酸、100 mM 丙酮酸钠和 100 单位/毫升青霉素-链霉素。
  2. 在珠浴（37 ˚C）中完全解冻稳定转染的大鼠 KCC2b 人胚胎肾 293 细胞（HEK293rnKCC2b）18。将细胞从冻存管转移至含有 5 mL 新鲜培养基的离心管中，在 1200 ×g 条件下离心 3–5 分钟。
  3. 使用连接真空泵的移液器吸除上清液，并加入 10 mL 新鲜培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至 10 cm 培养皿中。
  4. 将培养皿放入培养箱，在 37 °С、含 5% CO2 的湿润环境中培养 48 小时。监测培养过程以确保细胞健康生长。培养结束后，当细胞融合度超过 90% 时进行进一步传代。
  5. 吸除细胞培养皿中的旧培养基，用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。加入 2 mL 胰蛋白酶，在室温下孵育约 1–2 分钟。
  6. 用 2 mL 完全培养基轻轻冲洗消化后的细胞。向新的培养皿中加入 9 mL 新鲜培养基，并从原培养皿中取 1 mL 细胞悬液接种至每个新皿中。将传代后的细胞培养皿放回培养箱继续培养 48 小时，直至融合度达到 ≥ 90%。
  7. 在收集细胞前，用二甲基亚砜（DMSO）作为对照，或分别用 8 µM 星形孢菌素或 0.5 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理细胞 15 分钟，随后用裂解缓冲液收集细胞。

2. 细胞裂解液的制备与上样

  1. 吸弃培养皿中的培养基（来自转染操作）。将细胞培养物置于冰上，并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  2. 吸弃 PBS，然后加入 1.0 mL 冰冷的裂解缓冲液，其中含有 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚-N,N,N′，N′-四乙酸（EGTA），1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），50 mM 氟化钠，5 mM 焦磷酸钠，10 mM 钠-β-甘油磷酸盐、1 mM 正钒酸钠、1% (w/v) Triton X-100、0.27 M 蔗糖、1 mM 苯胺、0.1% (v/v) 2-巯基乙醇和 2 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）加入培养皿中。
    注意：细胞收获过程中裂解缓冲液的体积因培养皿尺寸而异，例如，每 1 x 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm²2 烧瓶，而每5 x 10⁵细胞使用0.5 mL为宜6 细胞/60 mm 培养皿/75 cm²2 培养瓶
  3. 使用预冷的塑料细胞刮刀将细胞从培养皿底部刮下，然后用移液器轻轻将细胞悬液转移至已置于冰上的微量离心管中。在4℃下持续振荡孵育30分钟。 °C.
  4. 在低温离心机（4 ℃）中离心细胞裂解液 °C) 在 16,000 x g 下离心 g 20分钟后，小心地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至预冷的干净离心管中，弃去沉淀。
    注意：根据细胞类型的不同，可能需要调整离心力和离心时间。尽管如此，一般建议在16,000 x g 20分钟。然而，具体时间需根据每个实验进行确定。例如，白细胞等脆弱细胞需要非常低的离心速度。

3. 从细胞裂解液中制备免疫沉淀物

  1. 用移液器将 300 µL 蛋白 G-琼脂糖加入微量离心管中。在 500 x g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液。
  2. 加入 500 µL PBS，充分涡旋混匀。在 500 x g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
  3. 将 1 mg 抗 KCC2 Thr906 和抗 KCC2 Thr1007 抗体与 200 µL 蛋白 G-琼脂糖微珠混合，并用 PBS 定容至 500 µL。在 4 °C 条件下于振荡平台或旋转仪上孵育 2 小时。用 PBS 洗涤两次。
  4. 对全细胞裂解液进行蛋白定量，将 1 mg 细胞裂解液加入已洗涤的微珠中。在 4 °C 条件下于旋转仪上轻柔孵育 2 小时。离心收集微珠，并用含 150 mM 氯化钠（NaCl）的 PBS 洗涤三次。
  5. 用 200 µL PBS 将免疫沉淀物（微珠）洗涤三次。将最终沉淀重悬于 100 μL 1x 十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液中。
  6. 室温下在旋转振荡器上摇动试管 5 分钟，随后在 75 °C 加热块中孵育 10 分钟。将上样样品在 11,000 x g 条件下离心 2 分钟，取上清液用于上样。

4. 进行蛋白质印迹实验

  1. 组装制胶装置，并倒入新配制的8%分离胶（配方/配制方法见表1），在玻璃板顶部预留约2 cm空间。向装置中加入200 µL无水异丙醇，室温静置60分钟。
    注意：用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的聚丙烯酰胺凝胶配方取决于目标蛋白的大小（表2）。因此，在确定所需凝胶浓度前，请先记录目标蛋白的分子量。
  2. 使用移液器吸除异丙醇，并用约200 µL蒸馏水小心冲洗凝胶表面。加入新配制的6%浓缩胶（配方/配制方法见表1），填充制胶装置中约2 cm的空间。轻轻插入样品梳，室温静置30分钟。
  3. 将制备好的凝胶固定于电泳槽中。
  4. 将30.3 g Tris碱、144.1 g甘氨酸和10 g SDS溶于1000 mL蒸馏水中，配制10x转移缓冲液。取10 mL 10% SDS和100 mL 10x转移缓冲液，加入890 mL蒸馏水中，配制成1x电泳缓冲液。
  5. 将1x电泳缓冲液倒入电泳槽中。在第一孔中加入5 µL分子量标记物，其余每孔加入等量蛋白样品（18–30 µL，具体体积取决于所用样品梳的规格）。空孔中加入1x LDS缓冲液，在120 V电压下电泳约90–120分钟。
  6. 将58.2 g Tris碱和29.3 g甘氨酸溶于1000 mL蒸馏水中，配制10x转移缓冲液。用含20%甲醇的1x转移缓冲液活化硝酸纤维素膜。用转移缓冲液冲洗凝胶和膜，然后将其轻轻铺放在转膜夹层中。
    注意：运行缓冲液和转移缓冲液无需调节pH，因其已处于所需最佳pH范围。此外，建议在实验前预先配制这些缓冲液并室温保存，以节省时间。
  7. 按以下顺序组装转膜“三明治”结构：负极（黑色框/端）— 夹层海绵 — 滤纸 — 已冲洗的SDS-PAGE凝胶 — 已冲洗的硝酸纤维素膜 — 滤纸 — 夹层海绵 — 正极（红色框）。将组装好的“三明治”结构放入转膜槽中，在90 V电压下运行90分钟，或在30 V电压下运行360分钟。

5. 抗体染色与图像显影

  1. 取出膜并使其干燥。使用含0.1% 1x Tween 20的Tris缓冲盐水（1x TBS-T）配制的5%脱脂奶粉封闭液，在室温下封闭膜1小时。
  2. 将膜与适当稀释的一抗8,15,19以及β-actin（上样对照）在封闭液中孵育，室温下1小时或4 °C过夜。用1x TBS-T溶液洗涤膜三次，每次5分钟。
    注意：使用β-actin、α-tubulin或甘油醛-3-磷酸脱氢酶等上样对照抗体分别孵育膜，是为了在后续定量分析中对其他Western blot结果进行归一化处理。每种一抗的推荐稀释比例可参考生产商说明书。
  3. 将洗涤后的膜与以封闭液按5000倍稀释的二抗在室温下孵育60分钟。再次用1x TBS-T溶液洗涤膜三次，每次5分钟。
    注意：强烈建议二抗的宿主物种应针对一抗的宿主物种产生。例如，若总KCC2的一抗为小鼠来源的抗KCC2抗体，则应选用抗小鼠的二抗。
  4. 将洗涤后的膜置于成像板上。取等体积的增强化学发光（ECL）试剂混合，轻轻将混合液均匀覆盖于膜表面以显影信号。

6. 使用成像系统进行图像采集及数据定量分析

  1. 将成像板转移至成像系统相应的成像区域。在计算机上打开成像软件以进行图像处理。
  2. 在工具栏中，点击 新建方案，选择 单通道。在凝胶成像/应用对话框中点击 选择，滚动至 印迹，并选择 化学发光高灵敏度 或 化学发光高分辨率。然后点击 信号累积设置，设定采集图像的持续时间及图像数量。
  3. 在方案设置中点击 放置凝胶，必要时调整成像系统中的凝胶位置。点击 运行方案 以采集图像。
  4. 在成像目录框中右键点击其中一幅已采集的图像，将图像保存至计算机。浏览至目标图像，在运行对话框中点击 选择图像并继续。
  5. 点击 图像转换 图标以调整图像的对比度和像素饱和度。根据所需的图像格式，点击通用工具栏上的 截图 图标将图像保存至计算机。
  6. 使用 ImageJ 软件测量条带密度，并采用适当的统计工具进行分析。

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结果

此处，图1 所示的代表性结果利用蛋白质印迹技术，研究了星形孢菌素（staurosporine）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）对稳定表达KCC2b的HEK293细胞系（HEKrnKCC2b）18中WNK-SPAK/OSR1介导的KCC2和NKCC1磷酸化的影响。有关代表性结果的详细信息见Zhang等人的研究15。与NEM类似，星形孢菌素是一种广谱激酶抑制剂，可增强KCC2的转运活性并抑制NKCC1的活性15,20。对HEK293细胞使用星形孢菌素和NEM处理后，SPAK靶位点的磷酸化水平降低——即位于T环激酶结构域内的Thr233位点，以及人源SPAK（hsSPAK）S环磷酸化位点Ser373。因此，这两种化合物均降低了上述SPAK磷酸化位点的磷酸化水平。此外，星形孢菌素降低了HEKrnKCC2b

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讨论

已采用多种方法来检测在神经元中表达的 SLC12 家族阳离子-氯离子共转运蛋白（CCC）的活性，包括 KCC2。其中许多技术已被证实有助于深入理解这些转运蛋白的功能相关性及其在不同疾病相关突变中的结构-功能关系。关键的是，各种方法均存在各自的优势与局限性21。然而，上文所述方案重点介绍了如何利用蛋白质印迹法（western blot）检测 KCC2 在激酶调控位点 Thr906 和 Thr1007 上的磷酸化水平，该方法对于研究 KCC2 的功能与活性具有重要意义。

KCC2的调控通过在关键的丝氨酸/苏氨酸残基上的磷酸化与去磷酸化实现1。Western印迹是一种有效的技术，可用于研究KCC2在Thr906和Thr1007激酶调控位点的磷酸化状态。该方法的基本原理是利用针对目的免疫印迹样品/蛋白质中磷酸化肽段的磷酸化位点特异性抗体，检测KCC2磷酸化水平的变化。Western印迹法用于从组织或细胞样品中检测特定的目标蛋白。该方法首先通过电泳根据蛋白分子大小进行分离，然后将蛋白通过电转移方式...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了英国皇家学会（资助号：IEC\NSFC\201094）以及英联邦博士奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40% 丙烯酰胺Sigma-AldrichA2917用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶 
过硫酸铵Sigma-Aldrich248614用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶 
抗 pSPAK 抗体Dundee UniversityS670B用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 抗体Dundee UniversityS700C用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pSer940 抗体Thermo Fisher ScientificPA5-95678用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr1007 抗体Dundee UniversityS961C用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr906 抗体Dundee UniversityS959C用作 Western 印迹的一抗
抗小鼠二抗Cell Signalling technology66002用作 Western 印迹的二抗
抗 NKCC1 抗体Dundee UniversityS841B用作 Western 印迹的一抗
抗 NKCC1 pThr203/207/212 抗体Dundee UniversityS763B用作 Western 印迹的一抗
抗兔二抗Cell Signalling technologyC29F4用作 Western 印迹的二抗
抗绵羊二抗abcamab6900用作 Western 印迹的二抗
抗 SPAK 抗体Dundee UniversityS669D用作 Western 印迹的一抗
抗-β-微管蛋白 III 抗体Sigma-AldrichT8578用作 Western 印迹的一抗
苯胺Merck UK135828用作裂解缓冲液的组分
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148用作上样缓冲液和裂解缓冲液的组分
Bradford 考马斯亮蓝Thermo Scientific1856209用于裂解液蛋白定量
凝胶制备装置Atto WSE-1165W用于运行 SDS-PAGE 电泳
离心机Eppendorf5804用于裂解液制备
离心机VWRMicroStar 17R用于样品离心
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100ML用于细胞培养实验
脱脂奶粉MarvelN/A用于制备封闭缓冲液
杜氏改良伊格尔培养基 - 高糖Sigma-AldrichD6429用于细胞培养
ECL 显影试剂Perkin ElmerORTT755/2655用于 Western 印迹图像的显影
EDTAFisher ScientificD/0700/53用作裂解缓冲液的组分
EGTASigma-Aldriche4378用作裂解缓冲液的组分
电泳电源BioRadPowerPAC HC为 SDS-PAGE 电泳提供电源
乙醇ThermoFisherE/0650DF/17用于制备无菌设备和环境
胎牛血清 -  热灭活Merck Life Sciences UKF9665用于细胞培养
通风橱WalkerA7277用于细胞培养
转印滤纸 - WhatmanGE Healthcare 10426981用于 Western 印迹中制备转印夹心结构
甘氨酸Sigma-Aldrich15527用于制备缓冲液
GraphPad Prism 软件GraphPad Software, Inc., USA版本 6.0用于绘制 Western 印迹的图表并进行数据分析 
HClAcros Organics10647282用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶 
加热金属块GrantQBT1用于加热 Western 印迹上样样品
HEK293 细胞Merck UK12022001-1VL用于培养实验的细胞系
ImageJ 软件Wayne Rasband 及贡献者；NIH, USA ImageJ 1.53e用于测量 Western 印迹图像中的条带强度
成像系统BioRadChemiDoc MP用于获取 Western 印迹图像
培养箱LEECLEEC precision 190D用于细胞培养
异丙醇Honeywell24137用于电泳凝胶的制备
L-谷氨酰胺溶液Sigma-AldrichG7513用于细胞培养
十二烷基硫酸锂 (LDS)NovexNP0008用作 Western 印迹的上样缓冲液
MEM 非必需氨基酸 Merck Life Sciences UKM7145用于细胞培养
微量离心机Eppendorf5418用于制备 Western 印迹用裂解液
酶标仪BioRadiMark用于测定裂解液蛋白浓度
Microsoft PowerPointMicrosoft, USAPowerPoint2016用于编辑 Western 印迹图像
分子量标记物BioRad1610373用于 Western 印迹
N-乙基马来酰亚胺Thermo Fisher Scientific23030用于细胞培养实验
硝酸纤维素膜Fisher Scientific45004091用于 Western 印迹
青霉素-链霉素Gibco15140122用于细胞培养
pH 计Mettler ToledoSeven compact s210用于监测缓冲液的 pH 值
苯甲基磺酰氟 (PMSF)Sigma-AldrichP7626用作裂解缓冲液的组分
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichD8537用于细胞培养
PKCδ pThr505Cell Signalling technology9374用作 Western 印迹的一抗
Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002用于免疫沉淀
氯化钠Sigma-AldrichS7653用作洗涤缓冲液的组分
氯化钠Sigma-AldrichS7653用于制备 TBS-T 缓冲液
十二烷基硫酸钠Sigma-AldrichL5750用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶 
正钒酸钠Sigma-AldrichS6508用作裂解缓冲液的组分
丙酮酸钠Sigma-AldrichS8636用于细胞培养
甘油磷酸钠-βMerck UKG9422用作裂解缓冲液的组分
星形孢菌素（来自 Streptomyces sp.）Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MG用于细胞培养实验
蔗糖Scientifc Laboratory SuppliesS0389用作裂解缓冲液的组分
TEMEDSigma-AldrichT7024用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶 
转印槽BioRad1658005EDU用于 Western 印迹中将蛋白转印至膜上
TrisSigma-AldrichT6066用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787用作裂解缓冲液的组分
胰蛋白酶-EDTA 溶液Merck Life Sciences UKT4049用于细胞培养
Tween-20Sigma-AldrichP3179用于制备 TBS-T 缓冲液
真空泵Charles AustenDymax 5用于细胞培养
涡旋振荡器Scientific IndustriesK-550-GE用于样品制备
涡旋混合器Scientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GE用于混合已溶解的样品
水浴锅Grant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5用于孵育溶液

参考文献

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KCC2功能神经元KCC2KCC2磷酸化氯离子稳态GABA能抑制蛋白质定量HEK293细胞激酶调控位点蛋白激酶C
使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性
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