颅窗手术已成为转基因小鼠活体成像中广泛应用的外科技术。本方案描述了一种手术机器人的使用方法，该机器人可进行半自动化的颅骨钻孔以制备颅窗，有助于减少不同手术者之间的操作差异，并部分减轻因热损伤导致的血脑屏障破坏。
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摘要
摘要
颅骨窗手术可利用双光子或其他活体成像技术对活体小鼠脑组织进行成像。然而，手工实施任何开颅手术时，常会导致脑组织产生热损伤，这种损伤在不同手术间具有固有的变异性，并可能依赖于术者的个体操作技术。引入手术机器人可实现手术操作的标准化，从而减少与手术相关的热损伤。本研究测试了三种机器人钻孔方法以评估其热损伤程度：水平钻孔、逐点钻孔和脉冲式逐点钻孔。水平钻孔采用连续钻孔模式，而逐点钻孔则在颅骨窗范围内钻出多个小孔。脉冲式逐点钻孔在此基础上增加了脉冲模式 "2秒开启，2秒关闭" 钻孔方案设计为允许在钻孔过程中进行间歇性冷却。通过静脉注射伊文思蓝（Evans Blue, EB）染料并进行荧光成像，可评估脑组织损伤程度；同时在钻孔部位下方放置热电偶以测量热损伤。热电偶结果显示，脉冲式逐点钻孔组的温度变化显著低于水平钻孔组和连续逐点钻孔组，分别为6.90 °C ± 1.35 °C、16.66 °C ± 2.08 °C 和18.69 °C ± 1.75 °C。同样，在颅窗钻孔后，脉冲式逐点钻孔组的EB染料渗漏明显少于水平钻孔组，表明其对脑内血管的损伤更小。因此，脉冲式逐点钻孔方法似乎是减少热损伤的最佳钻孔方案。机器人钻孔设备是一种有助于减少操作培训需求、降低操作变异性并减少热损伤的有效工具。随着多光子成像技术在各研究实验室中的广泛应用，提升实验的严谨性和可重复性显得尤为重要。本文所述方法将有助于指导研究人员更有效地使用此类手术机器人，从而推动该领域的发展。
引言
颅窗技术已广泛应用于神经科学、神经工程学和生物学领域，用于在活体动物中直接观察和成像大脑皮层1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11转基因小鼠与多光子成像技术的强强联合，为研究神经环路活动及其他生物学过程提供了极为宝贵的见解 体内 脑12,13,14,15,16<....
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方案
所有实验操作和动物护理程序均经过克利夫兰路易斯·斯托克斯退伍军人事务医疗中心机构动物护理和使用委员会审查、批准，并遵循其规定执行。
1. 手术机器人硬件设置
- 手术前，请遵循手术机器人（参见材料表）的使用手册和指南，完成硬件和软件的设置。按照手册中的说明执行框架校准。如果钻头或框架发生移动，建议重新校准钻头以确保精度。
2. 软件准备
- 进入手术软件（参见材料表），通过选择从空白项目开始创建一个新项目。在顶部将受试对象设置为小鼠，以指定将使用的钻孔坐标。
- 选择开始新项目。
- 在此界面，点击左下角的规划，进入钻孔坐标规划界面。为即将实施的颅窗技术创建钻孔方案。
- 为此，请在立体定位图谱上任意位置点击。以Bregma为参考点，输入运动皮层的以下坐标：AP = 1.50，ML = 1.25，DV = 0.00。按键盘上的回车键以更新所选坐标。
注意：背腹向（DV）坐标表示钻孔深度，因此此处无需输....
- 为此，请在立体定位图谱上任意位置点击。以Bregma为参考点，输入运动皮层的以下坐标：AP = 1.50，ML = 1.25，DV = 0.00。按键盘上的回车键以更新所选坐标。
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结果
热效应评估
通过测量使用横向（图2A）、逐点（图2B）和脉冲式逐点（图2C）方法进行钻孔时相对于基线的温度变化，评估了热损伤的潜在风险。图2D展示了获取热数据的实验装置。热效应评估采用 N = 4 个颅窗样本。横向法与逐点法采用相同的初始钻孔示意图，但在边缘点切割方式上有所不同。脉冲式逐点法则在初始钻孔和边缘钻孔部分均采用脉冲模式。对于横向法，初始钻孔的最大温度变化为 16.66 °C ± 2.08 °C，边缘钻孔为 9.08 °C ± 0.37 °C。对于逐点法，初始钻孔的最大温度变化为 18.69 °C ± 1.75 °C，边缘钻孔为 8.53 °C ± 0.36 °C。对于脉冲式逐点法，初始钻孔的最大温度变化为 6.90 °C ± 1.35 °C，边缘钻孔为 4.10 °C ± 0.51 °C。横向钻孔与逐点钻孔方案在热变化方面无显著差异。然而，改用脉冲.......
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讨论
使用伊文思蓝染料（EB染料）及成像技术操作简便、快速，对于评估新方法和技术在脑部血管损伤方面的效果具有重要价值。无论是在使用手术机器人，还是在验证实验室当前已有方法时，验证手术技术以区分实验处理效应与手术本身影响，并改善动物福利，都是至关重要的。采用热电偶装置也有助于评估钻孔方法，确保不产生热损伤。已知骨组织钻孔过程中温度升高可导致组织损伤，即使温度升高5 °C，也足以在脑内引发显著的血管损伤32,33,34,35,36。建议采用本文详述的方法，以优化实验室和手术技术。
尽管热电偶评估具有一定的应用价值，但也存在一些局限性。由于需要在颅骨侧面钻孔以将热电偶插入脑内，且可能对脑组织造成损伤，因此热电偶数据只能通过尸体小鼠获取。因此，所测得的温度差异反映的是钻孔条.......
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披露
作者无任何利益冲突需要声明。本内容不代表美国退伍军人事务部、美国国立卫生研究院或美国政府的观点。
致谢
本研究部分得到了美国退伍军人事务部康复研究与发展服务局的功绩评审奖资助，项目编号为 GRANT12418820（Capadona）和 GRANTI01RX003420（Shoffstall/Capadona），以及研究职业科学家奖 #GRANT12635707（Capadona）。此外，本工作还部分得到了美国国立卫生研究院、国家神经疾病与卒中研究所 GRANT12635723（Capadona）以及国家生物医学成像与生物工程研究所 T32EB004314（Capadona/Kirsch）的资助。本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：GRANT12635723）支持的工作。本材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者（们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的立场。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1×磷酸盐缓冲液 类型：试剂 | VWR | MRGF-6235 | 伊文思蓝稀释液 |
| Aura 软件 类型：工具 | Spectral Instruments Imaging | 用于Lumina成像系统的开源图像处理软件 | |
| 布托啡诺 类型：药物 | 来自动物设施 | ||
| 碳化钨钻头，0.6 mm（机器人钻） 类型：工具 | Stoelting | 58640-1 | |
| 卡洛芬 类型：药物 | 源自动物设施 | ||
| 头孢唑林 类型：药物 | 来自动物设施 | ||
| 伊文思蓝染料 类型：试剂 | Millipore Sigma | E2129 | 用1×磷酸盐缓冲液重悬 |
| 异氟烷 类型：药物 | 源自动物设施 | ||
| IVIS Lumina II 类型：工具 | Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III 目前已取代市场上的 Lumina II |
| Jenco线性化温度计 类型：工具 | Jenco | 765JF | 热电偶设置 |
| 氯胺酮 类型：药物 | 来自动物设施 | ||
| LivingImage 类型：工具 | Perkin Elmer | IVIS Lumina III 软件 | |
| Marcaine 类型：药物 | 源自动物设施 | ||
| Neurostar 软件 类型：工具 | 斯托尔廷 | 随手术机器人购买附赠 | |
| MouseSTAT 生理监测系统® 脉搏血氧仪 &和心率监测器 类型：工具 | Kent Scientific | PS-03 | 用于监测生命体征 |
| PrismPlus小鼠 类型：动物 | 杰克逊实验室 | 031478，RRID:IMSR_JAX:031478，雄性，约8月龄 | 用于研究的动物 |
| Stoelting 钻孔与注射机器人用于电动立体定位仪 类型：工具 | Stoelting | 58640 | 主机器人钻机与立体定位架 |
| 热电偶 类型：工具 | TC Direct | 206-557 | 热电偶设置 |
| USB-6008 多功能 I/O 数据采集设备 类型：工具 | 国家仪器公司 | USB-6008 | 热电偶设置 |
| 赛拉嗪 类型：药物 | 源自动物实验设施 |
参考文献
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678(2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Prot....
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