本文介绍了对东方果蝇Bactrocera dorsalis进行CRISPR/Cas9诱变的逐步实验方案。该标准化方案提供的详细步骤将为开展B. dorsalis基因功能研究中的突变果蝇制备提供有益的指导。
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本文内容
摘要
摘要
东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种高度侵入性和适应性强的害虫，对柑橘类及全球超过150种其他水果作物造成严重危害。由于成虫具有较强的飞行能力，且雌虫将卵产于果实表皮之下，需要与害虫直接接触的杀虫剂在田间通常效果不佳。随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，许多科学家正致力于开发环境友好的害虫管理策略。这些策略包括基于RNA干扰（RNAi）或基因编辑的杀虫剂，通过下调或沉默多种害虫中与搜寻行为相关的嗅觉基因等关键基因（分子靶标）。为了将这些策略应用于东方果实蝇的防控，亟需建立有效的功能基因研究方法。在B. dorsalis的生存与繁殖中发挥关键作用的基因，是进行基因敲低和/或沉默的理想分子靶点。CRISPR/Cas9系统是一种可靠的基因编辑技术，尤其适用于昆虫研究。本文介绍了一套针对B. dorsalis的CRISPR/Cas9诱变系统化方法，包括向导RNA的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选。这些实验方案将为致力于B. dorsalis功能基因研究的研究人员提供有价值的参考指南。
引言
东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种世界性分布的重要农业害虫，可危害超过150种水果作物，包括番石榴、芒果、蒲桃属（Eugenia spp.）、西印度樱桃、柑橘、枇杷和木瓜1。仅在中国广东省，其造成的经济损失估计超过2亿元人民币。成虫雌蝇将卵产于成熟或接近成熟的果实表皮之下，导致果实腐烂和提前脱落，从而降低果实品质和整体产量2。由于成虫具有较强的飞行能力，且幼虫钻入果皮内部取食，需要与害虫直接接触才能起效的杀虫剂在田间防治中效果较差。此外，杀虫剂的广泛使用已导致B. dorsalis对多种农用化学品产生抗药性，使得对该类害虫的防控更加困难3。因此，迫切需要开发高效且环境友好的害虫管理策略。
近年来，随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，科学家们正致力于开发环境友好的害虫管理策略，例如RNA干扰（RNAi），以靶向多种害虫重要基因（分子靶标）的功能。通过功能基因研究，可以鉴定出对害虫生存和繁殖至关重要的基因，并进一步将其作为潜在的分子靶标，用于改进具有特异性靶向性和环境友好性的害虫管理工具4。为了将这些策略应用于橘小实蝇的防治，需要有效的功能基因研究方法。
CRISPR/C....
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方案
1. 靶点设计与 体外 sgRNA的合成
- 预测目标基因的结构并确定外显子与内含子之间的边界 通过 生物信息学分析 B. dorsalis 基因组（此处使用的软件应用程序列于 材料表).
注意：BLAT20 用于在基因组中搜索潜在的基因位点。使用Hisat2将高质量的RNA-seq测序读段（转录组）比对至获得的基因位点21. Samtools22 用于生成排序后的 bam 文件。将排序后的 bam 文件作为输入提供给 Stringtie223 以提供组装的转录本。组装的转录本与基因位点信息由 Transdecoder 进行整合。24通过 Transdecoder 获得的结果在 IGV 工具中进行了可视化展示25 外显子与内含子之间的边界得以确定。 - 在候选靶基因位点内确定合适的靶区域。总长度必须小于750 bp，以便于测序图1B）。设计特异性引物，通过 PCR 从野生型基因组 DNA 中扩增目标区域（
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结果
本方案介绍了利用CRISPR/Cas9技术创制B. dorsalis突变体的详细步骤，包括基因组DNA筛选、胚胎收集与显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选的代表性结果。
所选基因的靶位点示例位于第三外显子图1C）。该位点高度保守，通过凝胶电泳检测到合成gRNA的DNA模板仅有一条条带图1D）以及通过获取的gRNA 体外 转录（图1E).
按照第3节所述方法，对200个 freshly harvested 卵进行显微注射。胚胎的培养按照步骤4.1–4.3中描述的方案进行。通过PCR产物测序检测发现，80%的G0代个体为嵌合突变体（表1）。在此，选择在G1代中发生8 bp缺失并导致氨基酸翻译提前终止的突变体（图3C）。这将导致该基.......
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讨论
CRISPR/Cas9 系统是目前应用最广泛的基因编辑工具，具有多种应用，如基因治疗30、作物育种31以及基因功能的基础研究32。该系统已成功应用于多种昆虫物种的基因编辑，并已成为害虫功能基因研究的有效工具。本文所展示的实验方案标准化了引导 RNA 的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选等操作步骤。此外，还提供了一个故障排除表，用于总结各步骤中可能出现的问题并给出相应的解决方案，以减轻工作负担并提高实验效率（表 2）。该流程为靶基因的编辑提供了可靠的方法，有助于提升对橘小实蝇（B. dorsalis）的功能基因组学研究水平。
首先，靶基因的选择对于提高CRISPR/Cas9系统的效率至关重要，目前已有多种开源软件可自动设计靶点并预测潜在的脱靶率，例如ChopChop33,
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披露
作者不存在任何利益冲突。
致谢
本工作由深圳市科技创新计划（资助编号：KQTD20180411143628272）以及深圳市大鹏新区科技创新与产业发展专项资金（资助编号：PT202101-02）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6x DNA上样缓冲液 | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| 人工气候室 | 上海博迅 | MGC-350P | |
| AxyPrep 基因组DNA小量提取试剂盒 | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | 用于在基因组中搜索潜在基因位点 |
| 毛细玻璃管 | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 显微操作仪 | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| HISAT2 | NA | NA | 用于将转录组数据比对到获得的基因位点 |
| IGV | NA | NA | 用于可视化Transdecoder的分析结果 |
| 微型研磨器 | NARISHIGE | EG-401 | |
| 奥林巴斯显微镜 | 奥林巴斯公司 | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt 克隆试剂盒 | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| 酚红溶液 | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 微量移液器拉制仪操作手册 | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (预混液) | 宝生物医学科技 | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | 用于生成排序后的bam文件 |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA设计 http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter 微量移液器拉制仪 Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | 用于整合转录本组装结果与基因位点信息 https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 蛋白 v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| 超微量生物检测仪 | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
参考文献
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. P....
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