东方果实蝇 Bactrocera dorsalis 的 CRISPR/Cas9 诱变实验方案

摘要

本文介绍了对东方果蝇Bactrocera dorsalis进行CRISPR/Cas9诱变的逐步实验方案。该标准化方案提供的详细步骤将为开展B. dorsalis基因功能研究中的突变果蝇制备提供有益的指导。

摘要

东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种高度侵入性和适应性强的害虫，对柑橘类及全球超过150种其他水果作物造成严重危害。由于成虫具有较强的飞行能力，且雌虫将卵产于果实表皮之下，需要与害虫直接接触的杀虫剂在田间通常效果不佳。随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，许多科学家正致力于开发环境友好的害虫管理策略。这些策略包括基于RNA干扰（RNAi）或基因编辑的杀虫剂，通过下调或沉默多种害虫中与搜寻行为相关的嗅觉基因等关键基因（分子靶标）。为了将这些策略应用于东方果实蝇的防控，亟需建立有效的功能基因研究方法。在B. dorsalis的生存与繁殖中发挥关键作用的基因，是进行基因敲低和/或沉默的理想分子靶点。CRISPR/Cas9系统是一种可靠的基因编辑技术，尤其适用于昆虫研究。本文介绍了一套针对B. dorsalis的CRISPR/Cas9诱变系统化方法，包括向导RNA的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选。这些实验方案将为致力于B. dorsalis功能基因研究的研究人员提供有价值的参考指南。

引言

东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种世界性分布的重要农业害虫，可危害超过150种水果作物，包括番石榴、芒果、蒲桃属（Eugenia spp.）、西印度樱桃、柑橘、枇杷和木瓜¹。仅在中国广东省，其造成的经济损失估计超过2亿元人民币。成虫雌蝇将卵产于成熟或接近成熟的果实表皮之下，导致果实腐烂和提前脱落，从而降低果实品质和整体产量²。由于成虫具有较强的飞行能力，且幼虫钻入果皮内部取食，需要与害虫直接接触才能起效的杀虫剂在田间防治中效果较差。此外，杀虫剂的广泛使用已导致B. dorsalis对多种农用化学品产生抗药性，使得对该类害虫的防控更加困难³。因此，迫切需要开发高效且环境友好的害虫管理策略。

近年来，随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，科学家们正致力于开发环境友好的害虫管理策略，例如RNA干扰（RNAi），以靶向多种害虫重要基因（分子靶标）的功能。通过功能基因研究，可以鉴定出对害虫生存和繁殖至关重要的基因，并进一步将其作为潜在的分子靶标，用于改进具有特异性靶向性和环境友好性的害虫管理工具⁴。为了将这些策略应用于橘小实蝇的防治，需要有效的功能基因研究方法。

CRISPR/C....

方案

1. 靶点设计与 体外 sgRNA的合成

1. 预测目标基因的结构并确定外显子与内含子之间的边界 通过 生物信息学分析 B. dorsalis 基因组（此处使用的软件应用程序列于 材料表).
   注意：BLAT²⁰ 用于在基因组中搜索潜在的基因位点。使用Hisat2将高质量的RNA-seq测序读段（转录组）比对至获得的基因位点²¹. Samtools²² 用于生成排序后的 bam 文件。将排序后的 bam 文件作为输入提供给 Stringtie2²³ 以提供组装的转录本。组装的转录本与基因位点信息由 Transdecoder 进行整合。²⁴通过 Transdecoder 获得的结果在 IGV 工具中进行了可视化展示²⁵ 外显子与内含子之间的边界得以确定。
2. 在候选靶基因位点内确定合适的靶区域。总长度必须小于750 bp，以便于测序图1B）。设计特异性引物，通过 PCR 从野生型基因组 DNA 中扩增目标区域（

结果

本方案介绍了利用CRISPR/Cas9技术创制B. dorsalis突变体的详细步骤，包括基因组DNA筛选、胚胎收集与显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选的代表性结果。

所选基因的靶位点示例位于第三个外显子图1C）。该位点高度保守，通过凝胶电泳检测到合成gRNA的DNA模板仅有一条条带图1D）以及通过获得的gRNA 体外 转录（图1E).

按照第3节所述方法，对200个 freshly harvested 卵进行显微注射。胚胎的培养按照步骤4.1–4.3中描述的方案进行。通过PCR产物测序检测发现，80%的G0代个体为嵌合突变体（表1）。此处选择在G1代中发生8 bp缺失、导致氨基酸翻译提前终止的突变体（图3C）。这将导致该基.......

讨论

CRISPR/Cas9 系统是目前应用最广泛的基因编辑工具，具有多种应用，如基因治疗³⁰、作物育种³¹以及基因功能的基础研究³²。该系统已成功应用于多种昆虫物种的基因编辑，并已成为害虫功能基因研究的有效工具。本文所展示的实验方案标准化了引导 RNA 的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选等操作步骤。此外，还提供了一个故障排除表，用于总结各步骤中可能出现的问题并给出相应的解决方案，以减轻工作负担并提高实验效率（表 2）。该流程为靶基因的编辑提供了可靠的方法，有助于提升对橘小实蝇（B. dorsalis）的功能基因组学研究水平。

首先，靶基因的选择对于提高CRISPR/Cas9系统的效率至关重要，目前已有多种开源软件可自动设计靶点并预测潜在的脱靶率，例如ChopChop^33,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6x DNA上样缓冲液	TransGen Biotech	GH101-01
人工气候室	上海博迅	MGC-350P
AxyPrep 基因组DNA小量提取试剂盒	Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA	用于在基因组中搜索潜在基因位点
毛细玻璃管	WPI	1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 显微操作仪	Eppendorf	InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒	Thermo Fisher Scientific	A29377
HISAT2	NA	NA	用于将转录组数据比对到获得的基因位点
IGV	NA	NA	用于可视化Transdecoder的分析结果
微型研磨器	NARISHIGE	EG-401
奥林巴斯显微镜	奥林巴斯公司	SZ2-ILST
pEASY-Blunt 克隆试剂盒	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
酚红溶液	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 微量移液器拉制仪操作手册	Instrument Company		https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (预混液)	宝生物医学科技	R040A
SAMtools	NA	NA	用于生成排序后的bam文件
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA设计 http://123.57.239.141:8080/home
Sutter 微量移液器拉制仪 Sutter	Instrument Company	P-97
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecoder	NA	NA	用于整合转录本组装结果与基因位点信息 https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 蛋白 v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
超微量生物检测仪	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C