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东方果实蝇 Bactrocera dorsalis 的 CRISPR/Cas9 诱变实验方案

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DOI：

10.3791/64195

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2022年9月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Sustainable Forest Ecosystem Management - Ministry of Education, Northeast Forestry University, 2Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Genome Analysis Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了对东方果蝇Bactrocera dorsalis进行CRISPR/Cas9诱变的逐步实验方案。该标准化方案提供的详细步骤将为开展B. dorsalis基因功能研究中的突变果蝇制备提供有益的指导。

摘要

东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种高度侵入性和适应性强的害虫，对柑橘类及全球超过150种其他水果作物造成严重危害。由于成虫具有较强的飞行能力，且雌虫将卵产于果实表皮之下，需要与害虫直接接触的杀虫剂在田间通常效果不佳。随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，许多科学家正致力于开发环境友好的害虫管理策略。这些策略包括基于RNA干扰（RNAi）或基因编辑的杀虫剂，通过下调或沉默多种害虫中与搜寻行为相关的嗅觉基因等关键基因（分子靶标）。为了将这些策略应用于东方果实蝇的防控，亟需建立有效的功能基因研究方法。在B. dorsalis的生存与繁殖中发挥关键作用的基因，是进行基因敲低和/或沉默的理想分子靶点。CRISPR/Cas9系统是一种可靠的基因编辑技术，尤其适用于昆虫研究。本文介绍了一套针对B. dorsalis的CRISPR/Cas9诱变系统化方法，包括向导RNA的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选。这些实验方案将为致力于B. dorsalis功能基因研究的研究人员提供有价值的参考指南。

引言

东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种世界性分布的重要农业害虫，可危害超过150种水果作物，包括番石榴、芒果、蒲桃属（Eugenia spp.）、西印度樱桃、柑橘、枇杷和木瓜1。仅在中国广东省，其造成的经济损失估计超过2亿元人民币。成虫雌蝇将卵产于成熟或接近成熟的果实表皮之下，导致果实腐烂和提前脱落，从而降低果实品质和整体产量2。由于成虫具有较强的飞行能力，且幼虫钻入果皮内部取食，需要与害虫直接接触才能起效的杀虫剂在田间防治中效果较差。此外，杀虫剂的广泛使用已导致B. dorsalis对多种农用化学品产生抗药性，使得对该类害虫的防控更加困难3。因此，迫切需要开发高效且环境友好的害虫管理策略。

近年来，随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，科学家们正致力于开发环境友好的害虫管理策略，例如RNA干扰（RNAi），以靶向多种害虫重要基因（分子靶标）的功能。通过功能基因研究，可以鉴定出对害虫生存和繁殖至关重要的基因，并进一步将其作为潜在的分子靶标，用于改进具有特异性靶向性和环境友好性的害虫管理工具4。为了将这些策略应用于橘小实蝇的防治，需要有效的功能基因研究方法。

CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）核酸酶系统最初在细菌和古菌中被发现，是一种参与识别和降解外源性细胞内DNA（例如由感染性噬菌体引入的DNA）的适应性机制5。在II型CRISPR系统中，Cas9核酸酶由小型相关RNA（crRNA和tracrRNA）引导，切割入侵的DNA6,7,8，迄今已成为最广泛应用的基因编辑工具之一9,10,11,12。由于CRISPR/Cas9系统具有基因沉默效率高、成本低等优势，目前已成功应用于多种昆虫物种的基因编辑，包括埃及伊蚊（Aedes aegypti）13,14、飞蝗（Locusta migratoria）15和家蚕（Bombyx mori）16。在B. dorsalis中，已利用CRISPR/Cas9成功敲除了与体色、翅多型性和性别决定相关的基因17,18,19。然而，该昆虫中CRISPR/Cas9应用的详细操作流程仍不完善。此外，研究人员提供的B. dorsalis基因编辑步骤也存在差异，亟需标准化。例如，已发表文献中所使用的Cas9形式各不相同17,18,19。

本文提供了一种利用CRISPR/Cas9系统对B. dorsalis进行基因突变的系统性方法，包括引导RNA的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选。该实验方案可为致力于研究B. dorsalis基因功能的科研人员提供生成突变果蝇的有效指导。

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方案

1. 靶点设计与 体外 sgRNA的合成

  1. 预测目标基因的结构并确定外显子与内含子之间的边界 通过 生物信息学分析 B. dorsalis 基因组（此处使用的软件应用程序列于 材料表).
    注意：BLAT20 用于在基因组中搜索潜在的基因位点。使用Hisat2将高质量的RNA-seq测序读段（转录组）比对至获得的基因位点21. Samtools22 用于生成排序后的 bam 文件。将排序后的 bam 文件作为输入提供给 Stringtie223 以提供组装的转录本。组装的转录本与基因位点信息由 Transdecoder 进行整合。24通过 Transdecoder 获得的结果在 IGV 工具中进行了可视化展示25 外显子与内含子之间的边界得以确定。
  2. 在候选靶基因位点内确定合适的靶区域。总长度必须小于750 bp，以便于测序图1B）。设计特异性引物，通过 PCR 从野生型基因组 DNA 中扩增目标区域（图1B（引物：F-引物：AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT，R-引物：CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC）。将PCR产物克隆至平末端载体中26 并选取20个单菌落进行测序，以确定目标区域在实验室昆虫种群中的保守程度。
  3. 典型的靶位点包含一个三核苷酸序列基序（NGG 或 CCN）以及紧邻 NGG 或 CCN 基序的 20 bp 序列（20 bp-NGG 或 CCN-20 bp）。将候选靶位点序列与 B. dorsalis 基因组，并确保预测的编辑效率足够高且脱靶率较低；已有多种开源软件可自动进行此类预测。在本方案中，使用 sgRNAcas9-AI27 用于筛选和评估最佳靶点。该软件的使用详情可参见其使用手册。
    注意：优先选择靠近目标基因5'非翻译区（5' UTR）的靶位点，并且20 bp序列起始处含有1-2个鸟嘌呤（G）的序列。为了获得可通过PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测的大片段缺失，需设计两个靶向序列28 建议间隔超过 100 bp图1C).
  4. 使用市售的gRNA合成试剂盒生成设计好的sgRNA。按照说明书中的步骤依次操作。用无核酸酶水重悬gRNA产物，使用紫外-可见分光光度计测定浓度，并在使用前于-80 °C保存（本实验所用试剂盒成功合成的单条gRNA [10 µL] 浓度约为4000–6000 ng/µL，甚至更高）。
    ​注意：尽管构建突变果蝇是每位研究人员的第一步，但为后续实验/分析选择适当的阴性对照至关重要。在构建突变体的同时生成这些对照可节省研究人员的时间和精力。例如，可将随机序列sgRNA设为阴性对照。

2. 胚胎的收集与制备

  1. 放置 B. dorsalis 蛹 放入塑料饲养笼中。成虫羽化后，提供糖和酵母（1:1）的混合物作为食物，并提供水源。图 2A，B饲养条件为55%相对湿度（RH）、26.5 °C，以及14:10的光/暗循环（光照开启时间为早晨6点，关闭时间为晚上8点）。
  2. 大多数成虫在羽化后10天达到性成熟。应提供适宜的环境以促进成虫尽可能多地交配。理想条件下使用带有30–50 lux光照的光照架，这可提高雌蝇的产卵量，从而提升胚胎收集效率。
    注意：将成虫（羽化后5-6天）置于光线较暗（<100 lux）的环境可促进交配。通常产卵高峰发生在下午3:00（14:10/L:D，光照开启时间为上午6:00，关闭时间为晚上8:00）；为获得足够的胚胎，建议在下午3:00前30分钟将产卵室放入饲养笼中。
  3. 在产卵室中放置一个200目筛网，距离室盖1-2 mm。这有助于获得尽可能多的胚胎。
    注意：避免让胚胎浸泡在橙汁中或用纱布擦拭，因为这会显著降低胚胎的存活率。
  4. 当显微注射装置准备就绪时，将一个新的产卵室放入笼中。每10分钟用湿润的细毛刷收集一次胚胎，然后将其排列在自制的注射板上（聚甲基丙烯酸甲酯材质，长55 mm，宽13.75 mm，高5 mm；中部开有一条45 mm × 5 mm × 0.3 mm的浅槽，便于卵的放置）。若胚胎内部压力较高，可进行轻微干燥处理 <10% 相对湿度下处理 10 分钟为可选步骤。注射过程中将胚胎浸入卤代烃油中，以避免进一步脱水（图 2C).

3. 胚胎显微注射

  1. 使用微量移液器拉制仪制备玻璃注射针。
    注意：遵循用户指南设置参数非常重要。在本方案中，可依据微量移液器拉制仪说明书推荐的参数制备不同形状的针头。玻璃毛细管必须尽可能清洁，以防止灰尘堵塞针头。
  2. 配制工作溶液。将Cas9蛋白与相应的sgRNA混合至以下工作浓度： sgRNA，300 ng/µL；Cas9蛋白，150 ng/µL。向混合液中加入1 µL酚红，以便于标记已注射的胚胎。将配制好的混合液置于冰上，防止sgRNA降解。
    注意：使用无核酸酶的移液器吸头和PCR管。Cas9蛋白的浓度应小于或等于150 ng/µL；浓度过高具有毒性，会显著降低胚胎存活率。Cas9也可通过DNA或mRNA形式递送以实现成功的基因编辑17,19。本方案推荐使用Cas9蛋白，因为mRNA易降解，而质粒DNA表达Cas9蛋白需要经历转录和翻译过程，耗时较长。
  3. 设置注射仪参数。初始程序设定为：Pi-500 hPa，Ti-0.5 s，PC-200 hPa。在显微注射过程中可根据需要进一步调整这些参数。
  4. 将3 µL混合液加入注射针中。避免引入可能堵塞针头的气泡。使用微型研磨器打开针尖。
  5. 根据用户指南将针头连接至显微操作器（图2E）。
  6. 将排列好胚胎的培养皿置于显微镜载物台上。在精细光学显微镜下调整微量移液管的位置，使移液管与胚胎处于同一焦平面。通过踩踏脚踏板调节液滴体积，建议注射体积为胚胎体积的1/10。
  7. 将针尖插入胚胎的后部（植物极）。通过踩下注射仪的脚踏板将混合液注入胚胎。若已添加酚红，可立即观察到轻微的红色染色。
    ​注意：针孔处少量的胞质回流不会降低胚胎存活率。注射约200个胚胎足以实现单个基因的成功诱变。添加更多卤代烃油以浸没胚胎，可防止进一步脱水。注射操作需在极细胞形成之前完成，以确保每个突变能够高效遗传。

4. 注射后昆虫的饲养

  1. 将注射后的胚胎连同注射板一起放入人工气候箱中，保持相对湿度55%、温度26.5 °C，并设置14:10的光暗循环（早晨六点开灯，晚上八点关灯）。
  2. 注射后，胚胎发育通常需要24小时完成，36小时后开始孵化。使用细头毛刷将幼虫转移至已准备好的幼虫饲料上。每日收集幼虫三到四次，直至不再有幼虫孵化。一般情况下，幼虫孵化过程持续2–3天，并在7天内化蛹。
    ​注意：本实验使用以玉米为基础的饲料喂养幼虫。饲料配方包含150 g玉米粉、150 g香蕉、0.6 g苯甲酸钠、30 g酵母、30 g蔗糖、30 g纸巾、1.2 mL盐酸和300 mL水29。应尽量减少幼虫在油中的停留时间（<2 h）。尽可能在幼虫孵化后立即转移至饲料中，这可显著提高存活率和化蛹率。不要提供过多饲料（90 mm培养皿中装至约2/3体积的饲料足以供30条幼虫食用）；否则饲料易发霉，降低幼虫存活率。
  3. 将成熟的幼虫放入湿润的沙土中使其化蛹。蛹期约为10天。在成虫羽化开始前，将蛹转移至塑料饲养笼中。

5. 突变体筛选

  1. 突变体筛选的流程图如图3A所示。将显微注射获得的G0代成虫与野生型成虫杂交，以获得杂合子品系。通过基因分型验证子代（G1代）所携带的突变类型。
  2. 将具有相同突变基因型的G1代个体进行自交，以在G2代中获得纯合子品系。若G1代突变体的基因型完全不同，则将杂合子与野生型果蝇杂交，通常在G3代获得纯合子品系。为后续表型分析实验，需保留两到三个纯合子品系。
  3. 提取新鲜蛹壳或单个成虫中足的基因组DNA用于基因分型。设计特异性引物扩增目标区域，引物应至少位于目标位点上下游50 bp处。引物设计细节参见步骤1.2。
    注意：由于蛹壳中的DNA含量极低，建议使用 commercially available DNA extraction kits（商业化DNA提取试剂盒）。
  4. PCR扩增程序如下：98 °C 预变性3 min，随后进行35个循环：98 °C 变性10 s，退火温度（根据所设计引物确定）退火15 s，72 °C 延伸35 s，最后72 °C 终延伸10 min。
  5. 对纯化的PCR产物进行测序。若在目标位点附近检测到多个重叠峰（图3B），则表明成功发生了突变。将纯化的PCR产物亚克隆至平末端载体中，挑取10个单菌落进行测序，以确认突变体的基因型。保留发生移码突变及提前终止翻译的品系（图3C）。
    注意：无需对G0代个体进行单克隆测序以验证其基因型，只需对PCR产物直接测序，并保留目标位点附近出现明显多重重叠峰的个体。在初次注射后，建议选取10枚胚胎提取基因组DNA，并依据步骤5.3的标准对PCR产物进行测序，以提前预测突变率。本研究中，基因型测定所用的Sanger测序由测序公司完成。

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结果

本方案介绍了利用CRISPR/Cas9技术创制B. dorsalis突变体的详细步骤，包括基因组DNA筛选、胚胎收集与显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选的代表性结果。

所选基因的靶位点示例位于第三个外显子图1C）。该位点高度保守，通过凝胶电泳检测到合成gRNA的DNA模板仅有一条条带图1D）以及通过获得的gRNA 体外 转录（图1E).

按照第3节所述方法，对200个 freshly harvested 卵进行显微注射。胚胎培养按照步骤4.1–4.3中描述的方案进行。通过PCR产物测序检测发现，80%的G0个体为嵌合突变体（表1）。此处选择在G1代中发生8 bp缺失并导致氨基酸翻译提前终止的突变体（图3C）。这将导致该基因产...

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讨论

CRISPR/Cas9 系统是目前应用最广泛的基因编辑工具，具有多种应用，如基因治疗30、作物育种31以及基因功能的基础研究32。该系统已成功应用于多种昆虫物种的基因编辑，并已成为害虫功能基因研究的有效工具。本文所展示的实验方案标准化了引导 RNA 的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选等操作步骤。此外，还提供了一个故障排除表，用于总结各步骤中可能出现的问题并给出相应的解决方案，以减轻工作负担并提高实验效率（表 2）。该流程为靶基因的编辑提供了可靠的方法，有助于提升对橘小实蝇（B. dorsalis）的功能基因组学研究水平。

首先，靶基因的选择对于提高CRISPR/Cas9系统的效率至关重要，目前已有多种开源软件可自动设计靶点并预测潜在的脱靶率，例如ChopChop33,

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披露

作者不存在任何利益冲突。

致谢

本工作由深圳市科技创新计划（资助编号：KQTD20180411143628272）以及深圳市大鹏新区科技创新与产业发展专项资金（资助编号：PT202101-02）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6x DNA上样缓冲液TransGen BiotechGH101-01
人工气候室上海博迅MGC-350P
AxyPrep 基因组DNA小量提取试剂盒AxygenAP-MN-MS-GDNA-250G
BLATNANA用于在基因组中搜索潜在基因位点
毛细玻璃管WPI 1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 显微操作仪EppendorfInjectMan 4
GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒Thermo Fisher ScientificA29377
HISAT2NANA用于将转录组数据比对到获得的基因位点
IGVNANA用于可视化Transdecoder的分析结果
微型研磨器NARISHIGEEG-401
奥林巴斯显微镜奥林巴斯公司SZ2-ILST
pEASY-Blunt 克隆试剂盒TransGen BiotechCB101-02https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
酚红溶液Sigma-AldrichP0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 微量移液器拉制仪操作手册Instrument Company https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (预混液)宝生物医学科技R040A
SAMtoolsNANA用于生成排序后的bam文件
sgRNAcas9-AINANAsgRNA设计
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter 微量移液器拉制仪 Sutter Instrument Company P-97
Trans2K DNA MarkerTransGen BiotechBM101-02
TransdecoderNANA用于整合转录本组装结果与基因位点信息
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 蛋白 v2Thermo Fisher ScientificA36498
超微量生物检测仪Thermo Fisher ScientificNanodrop 2000C

参考文献

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