本实验方案描述了在微流控腔室中对神经元线粒体进行接种和染色的方法。这些腔室中的流体压力梯度可实现对轴突内线粒体的选择性处理，从而在不干扰胞体区室的情况下，分析其对药物干预的响应特性。
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摘要
摘要
线粒体是神经元中三磷酸腺苷（ATP）的主要供应者。线粒体功能障碍是多种神经退行性疾病中常见的表型。鉴于某些轴突结构复杂且长度极长，轴突内的线粒体所处的微环境可能与其胞体中的线粒体不同，这一点并不令人意外。有趣的是，轴突线粒体的功能障碍通常早于胞体出现相关效应。为模拟轴突线粒体功能障碍 体外微流控装置可实现对轴突内线粒体的处理，同时不影响胞体内的线粒体。这些装置中的流体压力梯度可阻止分子逆梯度扩散，从而允许分析轴突内线粒体在局部药物刺激下的特性变化。本方案详细描述了在微流控装置中接种离体培养的海马神经元、使用膜电位敏感性染料进行染色、施加线粒体毒素处理，以及后续的显微成像分析。这一用于研究轴突生物学的多功能方法可适用于多种药理学干预和成像检测手段，并可用于多种神经元亚型。
引言
线粒体是神经元中三磷酸腺苷（ATP）的主要供应者。由于神经元的健康与线粒体功能密切相关，因此这些细胞器的功能失调与多种神经退行性疾病（包括帕金森病1）的发生有关，这一点并不令人意外。此外，通过线粒体中毒成功地在动物中模拟出了帕金森样症状2。在动物模型和人类疾病中，神经元的退变均起始于远端区域3,4，提示轴突内的线粒体可能更容易受到损伤。然而，由于难以在不同时干扰胞体过程的情况下对轴突线粒体进行靶向处理和分析，轴突中线粒体的生物学特性尚未被充分理解。
离体神经元培养技术的最新进展 体外 现在可通过微流控装置实现轴突与细胞体的流体分离5如图所示 图1A，这些装置具有四个通路孔（a/h 和 c/i），每对之间有两个通道相连（d 和 f）。大通道之间通过一系列长为450 µm的微通道相互连接（e）。两个腔室之间填充液位的有意差异可形成流体压力梯度（图1B）可防止小分子从液位较低的通道向另一侧扩散图1C, 用台盼蓝染料染色显示）。
我们最近使用微流控装置研究了轴突线粒体自噬（选择性清除受损线粒体）过程中局部翻译的需求6。在本实验方案中，通过使用线粒体复合物III抑制剂抗霉素A（Antimycin A）对轴突进行选择性处理，以诱导局部线粒体损伤，并详细展示了各个操作步骤6,7。
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方案
所有动物实验均按照上巴伐利亚政府的相关指南和规定进行。原代神经元取自E16.5时期的C57BL/6野生型小鼠胚胎，雌雄均有，制备方法采用既往文献所述的标准方法6。
1. 微流控装置的组装
- 用终浓度为 20 µg/mL 的多聚-L-赖氨酸（Poly-D-Lysine）和 3.4 µg/mL 的层粘连蛋白（Laminin）在 PBS（磷酸盐缓冲液）中包被一块六孔玻璃底组织培养板（见材料表）。
- 将包被后的培养板在室温下避光孵育过夜。
注意：也可在 37 °C 孵育 1–2 小时。包被条件的选择取决于所使用的细胞类型。 - 包被完成后，将六孔板转移至无菌操作台，用无菌 ddH2O 洗涤两次。
注意：请勿使用含盐缓冲液（如 PBS）进行洗涤，因为盐结晶会干扰密封的形成。 - 将培养板倾斜放置干燥 3–5 分钟，通过真空抽吸或移液去除多余水分。
- 将微流控腔室浸泡于 80% 乙醇中。
注意：微流控腔室购自商业来源（见材料表）。 - 将微流控腔室倾斜放置干燥 3–5 分钟，通过真空、抽吸或移液去除多余乙醇。
- 待其完全干燥后，将微流控腔室置于孔板中央。
注意：当空气从培养板与硅胶装置之间的界面被排出时，可通过反射性质的变化观察到密封的形成。在组装前，培养板和微流控腔室必须完全干燥，以确保良好的密封。然而，干燥时间应尽可能缩短，以保证细胞的正常贴附。因此，必须目视检查孔板和腔室内是否残留液滴。若未见液滴，应立即进行腔室组装。 - 轻轻敲击微流控腔室的边缘及其中部的微沟道区域，以确保其与玻璃板正确贴合。
2. 神经元的接种与培养
- 在1.5 mL离心管中收集每个培养腔所需数量的离解海马神经元。
注意：本研究中，采用 1.5 x 105 每个装置接种的神经元用于基于成像的应用。 - 以 1000 x 离心神经元 g 室温下持续 4 分钟。
- 用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于 8 µL B27-Neurobasal 培养基中（参见 材料表).
- 将细胞溶液用移液器加入微流控腔室的通道入口（b 在 图1A).
- 轻敲平板背面，以促进液体流过通道。
注意：敲击时可施加较大力度，无需担心密封会破裂。 - 用移液器吸除通道出口处残留的任何细胞悬液g 在 图1A以减少通道外的细胞数量。
- 将含有细胞的微流控芯片在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 15–20 分钟2.
- 在顶部轴突小室中加入 50 µL B27-Neurobasal 培养基（c 在 图1A).
- 轻敲平板背面，以促进液体流过通道。
- 填充胞体侧的孔a 和 h 在 图1A用150 µL B27-Neurobasal培养基分别重悬，形成顶部张力气泡，气泡体积约为20 µL。
注意：形成张力气泡并非实现流体隔离的必要条件，但它能清晰地显示胞体侧的体积较大。 - 填充轴突侧的两个孔c 和 i 在 图1A) 加入 100 µL B27-Neurobasal 培养基。
注意：为了促进轴突通过微沟生长，建议胞体侧小室中的培养基体积多于轴突侧小室。然而，即使两侧体积无差异，轴突仍可能随机通过微沟生长。 - 将微流控室置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 7-8 天。
注意：轴突生长进入轴突室通常从此时开始观察到 体外培养天数 （体外培养天数）5。若需要更成熟的培养物，可延长培养时间。 - 每2-3天更换一次神经元培养基，移除上方两个孔中的培养液（a 和 c）并用新鲜的B27-Neurobasal培养基替换，直至形成张力泡。
3. 使用线粒体膜电位敏感性染料进行染色
- 在 DIV 7-8 时，在光学显微镜下评估轴突是否已穿过微通道并延伸至轴突室中。
注意：根据所需的神经元年龄，也可选择其他 DIV 阶段。 - 用预热的成像培养基（37 °C）清洗两次：移除所有孔中的 B27-Neurobasal 培养基，并向轴突室和胞体室的上部孔（a 和 c）各加入约 100 µL 成像培养基，使培养基自然流向下部孔（h 和 i）。
- 移除下部孔及上部孔中残留的培养基，更换新鲜培养基，清洗结束后保持各孔为空。
注意：由于通道（d 和 f）内存在较强的毛细作用力，通道中会残留少量清洗液，不应完全清除，以防止神经元干燥。可使用任何无酚红的成像培养基，例如 Hibernate E（参见材料表）。若显微镜未配备 CO2 供气系统，应确保成像培养基使用碳酸盐/CO2 以外的缓冲体系（如 HEPES）8。
- 移除下部孔及上部孔中残留的培养基，更换新鲜培养基，清洗结束后保持各孔为空。
- 将 1 mM 四甲基罗丹明乙酯（TMRE，红色，参见材料表）储备液用成像培养基稀释至终浓度 5 nM。
注意：最终稀释液中 DMSO 浓度不得超过 1%，以避免细胞毒性。 - 向胞体室和轴突室的上部孔（a 和 c）各加入 100 µL 5 nM TMRE 稀释液，使液体流经胞体室和轴突室，直至所有孔中液体体积相等。再补充含 TMRE 的培养基至各孔中。
- 将神经元放回恒温恒湿培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 25 分钟。
- 按前述方法（步骤 3.2）用预热的成像培养基（37 °C）清洗两次。最后一次清洗时，向每个孔中加入 100 µL 培养基，并在胞体室的上部孔（a 和 c）中形成张力液泡。
4. 活细胞成像
注意：所示静态图像使用转盘共聚焦显微镜采集，物镜为40倍、数值孔径（NA）1.25的浸油物镜（参见材料表）。红色荧光通道选择200 ms曝光时间和10%激光功率，明场选择500 ms曝光时间。然而，也可使用常规共聚焦显微镜或宽场倒置显微镜观察TMRE荧光强度。
- 使用倒置显微镜对细胞进行成像。
- 确保显微镜配备有载物台培养箱，以便在整个实验过程中将神经元培养物维持在 37 °C。
- 选择胞体区的一个感兴趣区域，并沿微沟道追踪至轴突区。确保所成像的微沟道在胞体区和轴突区中一致（以便于进行处理前后的基线比较）。
- 使用 561 nm 激发光和 625 nm 发射光采集红色荧光信号的荧光图像。
- 获取图像。
- 为诱导线粒体去极化，向轴突区的成像培养基中加入 20 µM 抗霉素 A（见材料表）。为确保胞体室与轴突室之间存在体积差，请检查胞体侧是否存在张力气泡（表示体积 >110 µL）。
- 从轴突侧下部孔（i）中移除所有成像培养基，仅保留通道内的液体（f）。向轴突侧上部孔（c）中加入 160 µL 的 20 µM 抗霉素 A，使其流经通道，直至两个轴突孔中的液体体积相等。每个轴突孔的体积约为 80 µL。
注意：为确保适当的液体压力，轴突孔中的液体体积应小于胞体孔中的体积。建议体积差至少为 10 µL（约为孔体积的 10%），但也可使用更大的体积差。
- 从轴突侧下部孔（i）中移除所有成像培养基，仅保留通道内的液体（f）。向轴突侧上部孔（c）中加入 160 µL 的 20 µM 抗霉素 A，使其流经通道，直至两个轴突孔中的液体体积相等。每个轴突孔的体积约为 80 µL。
- 将神经元在受控环境培养室（37 °C）中孵育 20–30 分钟。
- 重复上述成像步骤（步骤 4.3–4.5）。确保成像位置与基线采集时相同（可通过微沟道轻松识别）。
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结果
在对微流控装置中的原代海马神经元培养7-8天后，使用膜敏感性染料（TMRE）对两个通道内的线粒体进行25分钟染色。如图2A所示，该方法实现了微沟槽两侧线粒体的均匀染色，但不足以使染料充分扩散至微沟槽中部。当在轴突侧加入抗霉素A后，胞体侧的线粒体仍保留TMRE信号（图2B和视频1），而轴突侧线粒体的TMRE荧光则消失（图2C和视频1）。视频采用完全集成的数字宽场显微镜拍摄（见材料表）。
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讨论
本实验方案描述了一种在微流控装置中接种和培养离解的海马神经元，以实现对轴突线粒体进行独立处理的方法。本文展示了该方法结合膜电位敏感性染料TMRE和复合体III抑制剂抗霉素A（Antimycin A）的应用（如先前研究所示7），但该方法也可轻松适配于其他线粒体染料或可实现局部显微成像读数的基因编码线粒体功能传感器9。其他类型的神经元细胞也可在微流控腔室中培养，例如原代皮层神经元10或诱导性多能干细胞（ipSC）来源的运动神经元11，这使得该平台成为研究特定神经元类型中神经退行性病变下线粒体功能的多功能工具。微流控装置的组装对于实现有效密封至关重要，通过观看经验丰富的研究人员进行组装操作是最直观的理解方式。本文所述的下游标记与处理步骤仅为示例性流程，可根据各实验室现有的实验方案进行调整，同时需保持流体压力梯度不变。
本文所述的接种技术与已发表的方案及制造商的说明有所不同，我们跳过了对组装好的装置进...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本研究由德国研究基金会（HA 7728/2-1 和 EXC2145 项目编号 390857198）以及马克斯·普朗克学会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔玻璃底板 | Cellvis | P06.1.5H-N | 硅胶装置 |
| 抗霉素A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 宽场显微镜 | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | 全集成数字宽场显微镜 |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| 倒置转盘共聚焦显微镜 | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | 配备培养箱腔室 |
| 层粘连蛋白 | Invitrogen | L2020 | |
| 微流控装置 | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
参考文献
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663(2021).
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- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
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