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方法文章

从原代细胞和培养细胞中制备细胞质和细胞核长链RNA

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DOI：

10.3791/64199

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2023年4月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine

本文内容

摘要

本实验方案提供了一种高效且灵活的方法，利用培养细胞分离核和细胞质组分中的RNA，并通过qPCR进行验证。该方法可有效替代其他RNA提取试剂盒。

摘要

多年来，细胞内组分的分离一直是细胞生物学中的关键技术，能够为细胞组分定位如何影响其功能提供有价值的见解。特别是，在癌细胞研究以及寻找新药物靶点的背景下，核内与细胞质RNA的分离变得尤为重要。购买用于核-细胞质RNA提取的试剂盒成本较高，而许多所需材料在典型的实验室环境中均可获得。本方法可替代更昂贵的试剂盒或其他耗时的流程，仅需自制裂解缓冲液、台式离心机和RNA纯化柱即可实现核内和细胞质RNA的分离。裂解缓冲液用于温和裂解细胞的外膜，同时不破坏核膜的完整性，从而释放细胞内的组分。随后，由于细胞核的密度高于裂解液，可通过简单的离心步骤将其分离。离心法利用密度差异将细胞核与细胞质中的亚细胞组分分离开来。在离心分离出不同组分后，使用RNA纯化试剂盒对RNA进行纯化，并通过qPCR检测以评估分离质量，该质量通过不同组分中核内和细胞质RNA的含量进行量化。实验达到了具有统计学意义的分离水平，证明了该方案的有效性。此外，该系统还可适用于不同类型RNA（如总RNA、小RNA等）的分离，从而实现对细胞核-细胞质相互作用的靶向研究，并有助于理解定位于细胞核和细胞质中的RNA在功能上的差异。

引言

将细胞分馏为亚细胞组分，可实现对特定生化区域的分离与研究，有助于确定特定细胞过程的定位及其对功能的影响1。从细胞内不同位置分离RNA，可提高对转录水平事件及其他核质间相互作用进行遗传学和生物化学分析的准确性，这也是本实验方案的主要目的2。本方案旨在有效分离细胞质和细胞核中的RNA，以明确它们在核输出过程中的各自作用，并阐明RNA在细胞核与细胞质中的亚细胞定位如何影响其在细胞过程中的功能。利用常规实验室材料，本方法能够比以往建立的方案更高效、更经济地实现细胞核与细胞质的分馏，同时不损害实验结果的质量3。

此外，通过分离细胞质和细胞核区域，可以直接研究分子在这两个区域之间的交换。更具体而言，理解转录组对于研究发育和疾病至关重要。然而，RNA在任何特定时刻可能处于不同的成熟阶段，这会增加下游分析的复杂性。本方案能够从细胞核和细胞质亚细胞组分中分离RNA，有助于RNA相关研究，并可更深入地了解特定RNA的特性，例如非编码RNA的定位或细胞核内剪接位点的分析。

由于所使用的RNA纯化柱具有大小选择性，本方案已针对分离细胞质和细胞核中的长链RNA（包括mRNA、rRNA和长链非编码RNA（lncRNA））进行了优化，也可根据需要进行修改以分离其他感兴趣的RNA。以往研究表明，长链RNA（如mRNA和lncRNA）的功能在很大程度上取决于其在细胞内的特定定位4,5。因此，研究RNA从细胞核向亚细胞区域的转运过程，已成为深入理解RNA或其他细胞组分输出对细胞影响的重要方向。lncRNA即为典型例证，其翻译过程及后续效应在很大程度上依赖于与其他类型RNA的空间邻近性和相互作用6。此外，细胞核与细胞质之间细胞组分的交换还与多种癌症治疗的耐药机制相关7。通过分离细胞内不同区室，研究人员已开发出核输出抑制剂，从而减轻了不同疗法中耐药机制的影响8。

在分离核RNA与细胞质RNA后，需进行一系列步骤以纯化目标RNA。由于RNA纯化试剂盒在实验室中普遍存在，且能够有效纯化和分离长链RNA，因此非常适合本实验方案的需求。在RNA纯化过程中，获得260:280比值大于1.8是关键，以确保RNA样本的质量，满足RNA测序或其他需要高纯度和高分离度的类似实验的要求。异常的260:280比值提示存在苯酚污染，表明分离效果不佳，将导致结果不准确9。

RNA纯化完成后，确认260:280比值处于可接受范围以上，随后采用qPCR验证细胞核与细胞质组分的分离结果。为此，使用针对目标区域的特异性引物，以展示细胞核和细胞质的分离程度。在本实验方案中，MALAT1和TUG1分别作为细胞核和细胞质的标志物10。使用MALAT1时，预期显示较高的细胞核富集水平，而细胞质中的含量应较低；相反，使用TUG1时，细胞质中的富集水平应高于细胞核中的水平。

利用本方案，可根据RNA在细胞内的作用位置对其进行分离。由于实验中仅使用裂解缓冲液和基于密度的离心技术，且许多材料易于获取，因此该方法可广泛适用于其他类型的RNA及其他细胞组分。通过揭示特定位置的表达事件，该方法可提供重要信息，而这些信息若不经过分离则无法分辨。

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方案

本研究使用 K562 细胞。该方案已优化适用于 1 × 106 至 5 × 106 个细胞。然而，通过适当增加试剂体积，该操作可按比例放大以适用于更大数量的细胞。

1. 0.25x 裂解缓冲液的配制

  1. 通过混合 表 1A 中提供的以下组分来制备 0.25x 裂解缓冲液。
    ​注意：样品需要约 300 μL 的 0.25x 裂解缓冲液。推荐体积 = 样品数量 × 300 μL。

2. 分离核与细胞质组分

  1. 使用1.5 mL离心管离心收集细胞 通过 2000 × g 离心 5 分钟 g （室温）。使用抽吸移液管弃去上清液。
    注意：本实验方案使用了 K562 细胞。然而，该方案可针对多种细胞系进行调整。
  2. 将沉淀重悬于300 μL预冷的0.25x裂解缓冲液中。
    注意：置于冰上孵育 2 分钟，每隔 45 秒轻轻旋转离心管，以确保细胞充分裂解。
  3. 以最高速度（12,000 x）离心管子 g4 °C 下孵育 2 分钟。
  4. 离心后，小心移除上清液并转移至新的1.5 mL离心管中，此即为细胞质组分，可获得约300 μL。
  5. 剩余的沉淀为细胞核组分。向沉淀中加入500 μL预冷的PBS，于2,000 x g离心 g 室温下孵育5分钟。
    ​注意：此步骤中会去除多余的 DNA。

3. 使用RNA纯化试剂盒进行RNA纯化

注意：本实验方案使用市售的RNA纯化试剂盒完成（参见材料表）。

  1. 分别处理细胞质RNA样品和细胞核RNA样品（因为两者的分级步骤有所不同）。
    1. 分离细胞质组分时，加入1,050 µL的3.5x RLT裂解缓冲液（见材料表），短暂涡旋振荡。然后加入750 μL的90%乙醇，并将混合液加载到RNA纯化试剂盒的柱子上。
      注意：在将溶液上柱前必须充分混匀。
    2. 分离细胞核组分时，加入600 μL的3.5x裂解缓冲液并涡旋振荡。然后加入600 μL的70%乙醇。
  2. 将细胞质和细胞核组分分别上样至RNA纯化柱（见材料表）。
    注意：在步骤3的后续操作中，细胞质和细胞核样品的操作流程相同，但必须确保两种样品彼此独立，不得混淆。
    1. 将细胞质和细胞核组分分别上样至RNA纯化柱，于室温下以8,000 x g离心30秒，弃去穿流液。
    2. 加入350 μL商品化纯化试剂盒中的洗涤缓冲液（RW1缓冲液，见材料表），再次离心，弃去穿流液。
    3. 加入DNA酶溶液（1 U/μL），室温孵育15分钟。然后加入350 μL洗涤缓冲液，再次离心，弃去穿流液。
    4. 加入500 μL温和洗涤缓冲液（RPE，见材料表），再次离心，弃去穿流液。再加入500 μL温和洗涤缓冲液，再次离心，但此次仅离心2分钟。
    5. 将纯化柱转移至新的1.5 mL微量离心管中，向柱膜中央加入30 μL无核酸酶水，静置1分钟后再进行离心洗脱。

4. 细胞核-细胞质分离的验证

  1. 进行 cDNA 合成
    1. 在提取并纯化 RNA 的亚细胞组分后，使用 qPCR 确认各组分的分离效果。为此，首先使用市售试剂盒按照制造商说明将 RNA 转化为 cDNA（参见材料表）。
    2. 配制逆转录酶预混液，加入模板 RNA，在热循环仪中孵育反应体系。
      注意：对于随机六聚体，所用循环参数见表 2A。逆转录反应产物应立即使用或于 -20 °C 保存（表 1B）。
  2. 进行定量聚合酶链式反应（qPCR）及分析。
    1. 用焦碳酸二乙酯（DEPC）水（参见材料表）稀释 cDNA 合成产物，使其终浓度为 20 ng/mL。
    2. 使用 PCR 预混液，根据下文列出的手动说明为每个样本配制反应体系。
    3. 获取用于检测细胞质和细胞核分馏的商用探针。使用 MALAT1 作为核标记物，TUG1 作为细胞质标记物（参见材料表）。
      注意：MALAT1 和 TUG1 的序列见表 3。
    4. 通过将各组分乘以 3 来计算每种组分的体积，以满足每个样本的技术重复数。
    5. 对每个核组分和细胞质组分样本，分别准备以下反应组合：(a) 核组分与 MALAT1，(b) 细胞质组分与 MALAT1，(c) 核组分与 TUG1，以及 (d) 细胞质组分与 TUG1（表 1C）。
    6. 短暂涡旋混匀，将 20 μL 混合液转移至光学反应板的每个孔中（参见材料表）。
    7. 用适用于 qPCR 的透明粘性封膜覆盖反应板（参见材料表），短暂离心以去除气泡，然后在室温下以 300 × g 离心 5 分钟使样品沉降至管底。
    8. 使用设计与分析软件（参见材料表），选择循环参数的标准曲线（表 2B）。
    9. 在 qPCR 软件中选择设置运行（补充图 1）。
    10. 在“数据文件属性”页面中，选择方法，并输入来自表 2B的循环参数（补充图 2）。
    11. 输入循环参数后，选择板选项卡，输入待运行的样本信息（补充图 3），然后选择开始运行。
      注意：上述步骤在 qPCR 仪器中完成，使用了市售的预混液（参见材料表）。
  3. 进行数据分析
    1. 运行完成后，创建一个包含样本名称、靶标名称和定量循环值（Cq）的数据表格（补充表 1）。
    2. 首先使用 MALAT1 样本计算核组分比例。用 MALAT1 核组分值减去 MALAT1 细胞质组分值（表 4）。
    3. 然后计算 ΔCq（2^(-值)）（表 5）。
    4. 继续使用 MALAT1 样本计算细胞质组分比例，用 MALAT1 细胞质组分值减去 MALAT1 核组分值，然后计算 ΔCq（2^(-值)）（表 6）。
      注意：观察 ΔCq 可知，核内 MALAT1 组分（绿色高亮）的 MALAT1 标记物高于细胞质组分（红色高亮），但还需进一步确认细胞质组分主要为细胞质成分，且核组分未受细胞质污染。
    5. 对 TUG1 样本执行与上述相同的计算步骤（步骤 4.3.2–4.3.4）（表 7）。
      注意：观察 ΔCq 可知，细胞质 TUG1 组分（绿色高亮）的 TUG1 标记物高于核组分（红色高亮），从而证实细胞质与核组分实现了良好分离（表 8，图 1）。

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结果

为确保已实现细胞核与细胞质的分离，通过qPCR验证了结果。具体操作中，使用针对目标区域的特异性引物，以展示细胞核和细胞质的分离程度。本研究中，分别采用MALAT1和TUG1作为细胞核和细胞质的引物。二者联合使用可证明细胞核组分的高富集程度，其中MALAT1作为细胞核组分的阳性对照；而细胞质组分的富集程度则预期较低。相反，当以TUG1作为细胞质组分的阳性对照时，细胞质组分的富集水平应高于细胞核组分。这一点可在图2中得到体现，该图展示了一个阳性结果，证实了细胞核与细胞质RNA的有效分离。

在图3中可见阴性结果，该图显示在含有MALAT1的样本中观察到了细胞质分级的水平。这表明从核组分中分离的RNA可能存在污染，可能由于裂解浓度过低或过高所致。本研究还测试了其他引物，但MALAT1和TUG1在核与细胞质分离方面表现出最高的相关性，这一点通过Western blot和RNA电泳得到了验证，确认了样本的纯度与质量（图4

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讨论

在整个实验方案中，采取了一些步骤以优化各要素，使其对目标细胞系最为有效。尽管方案中的步骤相对简单，但在关键环节进行分析和微调可能是必要的。方案中最关键的步骤是根据目标细胞系和细胞靶标，将裂解缓冲液的浓度调整至适当水平。由于裂解缓冲液的作用主要依赖于破坏细胞膜，而不同细胞系在细胞脆弱性和膜通透性方面存在细微差异，因此裂解缓冲液在不同细胞系中的有效性自然存在差异12。实验从1x裂解缓冲液作为基础浓度开始，在逐步将裂解缓冲液浓度降低至0.25x的过程中执行方案步骤，结果表明较低浓度可获得更有效的效果。由于本实验旨在最终分离出大量亚细胞组分，因此确保裂解缓冲液浓度针对目标细胞系进行优化，对于获得最高得率和最佳实验结果至关重要。

除了调整裂解缓冲液的浓度外，还需注意RNA的脆弱性，并在RNA提取过程中格外谨慎。RNA比DNA及许多其他细胞成分更易降解，因其核糖上的2'羟基可作为RNase（一类能够降解RNA并导致实验结果不佳的酶）的结合位点。即使微量存在，RNase也具有极强的RNA降解能力13。...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

由美国血液学会、罗伯特·伍德·约翰逊基金会、多丽丝·杜克慈善基金会、爱德华·P·埃文斯基金会和美国国家癌症研究所（1K08CA230319）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent TapestationAgilentG2991BAAgilent TapeStation 系统是一种用于 DNA 和 RNA 样本质量控制的自动化电泳解决方案。 
0.5% Nonidet P-40Thermo-Fischer28324用于配制裂解缓冲液
50 mM Tris-Cl pH 8.0Thermo-Fischer15568025用于配制裂解缓冲液
MALAT1 GE AssayThermo-FischerHs00273907_s1用于确认核组分
MicroAmp 光学 96 孔反应板（带条形码）Thermo-Fischer4326659Applied Biosystems MicroAmp 光学 96 孔反应板（带条形码）经过优化，可提供无与伦比的温度准确性和均匀性，实现快速高效的 PCR 扩增。该反应板由单一刚性聚丙烯材料制成，采用 96 孔格式，适用于 Applied Biosystems 96 孔实时 PCR 系统和热循环仪。
MicroAmp 光学粘性封膜Thermo-Fischer4311971Applied Biosystems MicroAmp 光学粘性封膜在 qPCR 过程中覆盖于微孔板上，可降低孔间污染和样本蒸发的风险
PBSGibco20012-023磷酸盐缓冲液（PBS）是一种平衡盐溶液，广泛用于多种细胞培养操作，例如细胞解离前的洗涤、细胞或组织样本的转运、细胞稀释计数以及试剂的配制。
Qiagen RNA 纯化试剂盒 - RNeasy Mini KitQiagen74106RNA 纯化试剂盒可高效纯化酶促反应产物，并适用于不同方法提取的 RNA 的后续纯化。本试剂盒包含本实验方案中多次提及的 RW1、RLT 和 RPE 缓冲液。
QuantStudio 6Thermo-FischerA43180本实验方案中使用的 qPCR 软件，包含用于分析分步分离样本的设计与分析软件
RLT BufferQiagen79216RNA 纯化试剂盒中的裂解缓冲液
RPE BufferQiagen1018013RNA 纯化试剂盒中的洗涤缓冲液
RW1 BufferQiagen1053394RNA 纯化试剂盒中的洗涤缓冲液
TaqMan 基因表达检测Thermo-Fischer4331182Applied Biosystems TaqMan 基因表达检测是行业内最大规模的预设计检测集合，涵盖 32 种真核生物及多种微生物，检测种类超过 280 万种。TaqMan 基因表达检测可让您快速获得结果，无需花费时间优化 SYBR Green 引物，也无需额外进行和分析熔解曲线。
TaqMan Universal PCR Master MixThermo-Fischer4305719TaqMan Universal PCR Master Mix 是适用于多种 5' 核酸酶 DNA 应用的理想预混试剂。Applied Biosystems 试剂已与 TaqMan 检测和 Applied Biosystems 实时系统完成验证，确保每次实验均具有高灵敏度、准确性和可靠性。
TUG1 GE AssayThermo-FischerHs00215501_m1用于确认细胞质组分
UltraPure DEPC 处理水Thermo-Fischer750024UltraPure DEPC 处理水适用于 RNA 相关实验。该水经 0.1% 二乙基焦碳酸酯（DEPC）孵育处理后，再通过高压灭菌去除 DEPC，并经过无菌过滤。

参考文献

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