从原代细胞和培养细胞中制备细胞质和细胞核长链RNA

摘要

本实验方案提供了一种高效且灵活的方法，利用培养细胞分离核和细胞质组分中的RNA，并通过qPCR进行验证。该方法可有效替代其他RNA提取试剂盒。

摘要

多年来，细胞内组分的分离一直是细胞生物学中的关键技术，能够为细胞组分定位如何影响其功能提供有价值的见解。特别是，在癌细胞研究以及寻找新药物靶点的背景下，核内与细胞质RNA的分离变得尤为重要。购买用于核-细胞质RNA提取的试剂盒成本较高，而许多所需材料在典型的实验室环境中均可获得。本方法可替代更昂贵的试剂盒或其他耗时的流程，仅需自制裂解缓冲液、台式离心机和RNA纯化柱即可实现核内和细胞质RNA的分离。裂解缓冲液用于温和裂解细胞的外膜，同时不破坏核膜的完整性，从而释放细胞内的组分。随后，由于细胞核的密度高于裂解液，可通过简单的离心步骤将其分离。离心法利用密度差异将细胞核与细胞质中的亚细胞组分分离开来。在离心分离出不同组分后，使用RNA纯化试剂盒对RNA进行纯化，并通过qPCR检测以评估分离质量，该质量通过不同组分中核内和细胞质RNA的含量进行量化。实验达到了具有统计学意义的分离水平，证明了该方案的有效性。此外，该系统还可适用于不同类型RNA（如总RNA、小RNA等）的分离，从而实现对细胞核-细胞质相互作用的靶向研究，并有助于理解定位于细胞核和细胞质中的RNA在功能上的差异。

引言

将细胞分馏为亚细胞组分，可实现对特定生化区域的分离与研究，有助于确定特定细胞过程的定位及其对功能的影响¹。从细胞内不同位置分离RNA，可提高对转录水平事件及其他核质间相互作用进行遗传学和生物化学分析的准确性，这也是本实验方案的主要目的²。本方案旨在有效分离细胞质和细胞核中的RNA，以明确它们在核输出过程中的各自作用，并阐明RNA在细胞核与细胞质中的亚细胞定位如何影响其在细胞过程中的功能。利用常规实验室材料，本方法能够比以往建立的方案更高效、更经济地实现细胞核与细胞质的分馏，同时不损害实验结果的质量³。

此外，通过分离细胞质和细胞核区域，可以直接研究分子在这两个区域之间的交换。更具体而言，理解转录组对于研究发育和疾病至关重要。然而，RNA在任何特定时刻可能处于不同的成熟阶段，这会增加下游分析的复杂性。本方案能够从细胞核和细胞质亚细胞组分中分离RNA，有助于RNA相关研究，并可更深入地了解特定RNA的特性，例如非编码RNA的定位或细胞核内剪接位点的分析。

由于所使用的RNA纯化柱具有大小选择性，本方案已针对分离细胞质和细胞核中的长链RNA（包括mRNA、rRNA和长链非编码RNA（lncRNA））进行了优化，也可根据需要进行修改以分离其他感兴趣的RNA。以往研究表明，长链RNA（如m....

方案

本研究使用 K562 细胞。该方案已优化适用于 1 × 10⁶ 至 5 × 10⁶ 个细胞。然而，通过适当增加试剂体积，该操作可按比例放大以适用于更大数量的细胞。

1. 0.25x 裂解缓冲液的配制

1. 通过混合 表 1A 中提供的以下组分来制备 0.25x 裂解缓冲液。
   ​注意：样品需要约 300 μL 的 0.25x 裂解缓冲液。推荐体积 = 样品数量 × 300 μL。

2. 分离核与细胞质组分

1. 使用1.5 mL离心管离心收集细胞 通过 2000 × g 离心 5 分钟 g （室温）。使用抽吸移液管弃去上清液。
   注意：本实验方案使用了 K562 细胞。然而，该方案可针对多种细胞系进行调整。
2. 将沉淀重悬于300 μL预冷的0.25x裂解缓冲液中。
   注意：置于冰上孵育 2 分钟，每隔 45 秒轻轻旋转离心管，以确保细胞充分裂解。
3. 以最高速度（12,000 x）离心管子 g4 °C 下孵育 2 分钟。
4. 离心后，小心移除上清液并转移至新的1.5 mL离心管中....

结果

为确保已实现细胞核与细胞质的分离，通过qPCR验证了结果。具体操作中，使用针对目标区域的特异性引物，以展示细胞核和细胞质的分离程度。本研究中，分别采用MALAT1和TUG1作为细胞核和细胞质的引物。二者联合使用可证明细胞核组分的高富集程度，其中MALAT1作为细胞核组分的阳性对照；而细胞质组分的富集程度则预期较低。相反，当以TUG1作为细胞质组分的阳性对照时，细胞质组分的富集水平应高于细胞核组分。这一点可在图2中得到体现，该图展示了一个阳性结果，证实了细胞核与细胞质RNA的有效分离。

在图3中可见阴性结果，该图显示在含有MALAT1的样本中观察到了细胞质分级的水平。这表明从核组分中分离的RNA可能存在污染，可能由于裂解浓度过低或过高所致。本研究还测试了其他引物，但MALAT1和TUG1在核与细胞质分离方面表现出最高的相关性，这一点通过Western blot和RNA电泳得到了验证，确认了样本的纯度与质量（图4

讨论

在整个实验方案中，采取了一些步骤以优化各要素，使其对目标细胞系最为有效。尽管方案中的步骤相对简单，但在关键环节进行分析和微调可能是必要的。方案中最关键的步骤是根据目标细胞系和细胞靶标，将裂解缓冲液的浓度调整至适当水平。由于裂解缓冲液的作用主要依赖于破坏细胞膜，而不同细胞系在细胞脆弱性和膜通透性方面存在细微差异，因此裂解缓冲液在不同细胞系中的有效性自然存在差异¹²。实验从1x裂解缓冲液作为基础浓度开始，在逐步将裂解缓冲液浓度降低至0.25x的过程中执行方案步骤，结果表明较低浓度可获得更有效的效果。由于本实验旨在最终分离出大量亚细胞组分，因此确保裂解缓冲液浓度针对目标细胞系进行优化，对于获得最高得率和最佳实验结果至关重要。

除了调整裂解缓冲液的浓度外，还需注意RNA的脆弱性，并在RNA提取过程中格外谨慎。RNA比DNA及许多其他细胞成分更易降解，因其核糖上的2'羟基可作为RNase（一类能够降解RNA并导致实验结果不佳的酶）的结合位点。即使微量存在，RNase也具有极强的RNA降解能力¹³。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	Agilent TapeStation 系统是一种用于 DNA 和 RNA 样本质量控制的自动化电泳解决方案。
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	用于配制裂解缓冲液
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	用于配制裂解缓冲液
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	用于确认核组分
MicroAmp 光学 96 孔反应板（带条形码）	Thermo-Fischer	4326659	Applied Biosystems MicroAmp 光学 96 孔反应板（带条形码）经过优化，可提供无与伦比的温度准确性和均匀性，实现快速高效的 PCR 扩增。该反应板由单一刚性聚丙烯材料制成，采用 96 孔格式，适用于 Applied Biosystems 96 孔实时 PCR 系统和热循环仪。
MicroAmp 光学粘性封膜	Thermo-Fischer	4311971	Applied Biosystems MicroAmp 光学粘性封膜在 qPCR 过程中覆盖于微孔板上，可降低孔间污染和样本蒸发的风险
PBS	Gibco	20012-023	磷酸盐缓冲液（PBS）是一种平衡盐溶液，广泛用于多种细胞培养操作，例如细胞解离前的洗涤、细胞或组织样本的转运、细胞稀释计数以及试剂的配制。
Qiagen RNA 纯化试剂盒 - RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA 纯化试剂盒可高效纯化酶促反应产物，并适用于不同方法提取的 RNA 的后续纯化。本试剂盒包含本实验方案中多次提及的 RW1、RLT 和 RPE 缓冲液。
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	本实验方案中使用的 qPCR 软件，包含用于分析分步分离样本的设计与分析软件
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA 纯化试剂盒中的裂解缓冲液
RPE Buffer	Qiagen	1018013	RNA 纯化试剂盒中的洗涤缓冲液
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	RNA 纯化试剂盒中的洗涤缓冲液
TaqMan 基因表达检测	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan 基因表达检测是行业内最大规模的预设计检测集合，涵盖 32 种真核生物及多种微生物，检测种类超过 280 万种。TaqMan 基因表达检测可让您快速获得结果，无需花费时间优化 SYBR Green 引物，也无需额外进行和分析熔解曲线。
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix 是适用于多种 5' 核酸酶 DNA 应用的理想预混试剂。Applied Biosystems 试剂已与 TaqMan 检测和 Applied Biosystems 实时系统完成验证，确保每次实验均具有高灵敏度、准确性和可靠性。
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	用于确认细胞质组分
UltraPure DEPC 处理水	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC 处理水适用于 RNA 相关实验。该水经 0.1% 二乙基焦碳酸酯（DEPC）孵育处理后，再通过高压灭菌去除 DEPC，并经过无菌过滤。