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方法文章

微生物合作行为的研究 通过 感染过程中在琼脂和组织内生长的细菌菌落的成像质谱分析

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DOI：

10.3791/64200

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2022年11月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Florida, 2Division of Protective Immunity, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

一种用于分析基于琼脂的细菌大菌落的新型样品制备方法 通过 基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术

摘要

理解感染过程中微生物相互作用所产生的代谢后果，对生物医学成像领域提出了独特的挑战。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像质谱技术是一种无需标记、 原位 一种能够生成多种代谢物空间分布图的成像技术。目前，薄切片组织样本已常规用于分析 通过 该技术在对微生物学研究中常见的琼脂培养基上生长的细菌菌落等非传统基底进行成像质谱分析时，仍面临挑战，主要由于这些样品含水量高且表面形貌不均。本文展示了一种样品制备流程，以实现对这类样品的成像质谱分析。该方法以两种胃肠道病原菌的共培养宏菌落为例进行说明： 艰难梭菌 和 粪肠球菌在明确定义的琼脂环境中研究微生物相互作用，还可补充旨在了解这两种病原体在小鼠感染模型中代谢协作的组织学研究。本文展示了氨基酸代谢物精氨酸和鸟氨酸的成像质谱分析作为代表性数据。该方法广泛适用于其他分析物、微生物病原体或疾病，以及需要对细胞或组织生物化学进行空间测量的各类组织类型。

引言

人类微生物组是一个高度动态的生态系统，涉及细菌、病毒、古菌及其他微生物真核生物之间的分子相互作用。尽管近年来对微生物间关系的研究已十分深入，但在化学层面理解微生物过程方面仍有诸多未知。1,2这在一定程度上是由于缺乏能够准确测量复杂微生物环境的工具。过去十年间，成像质谱技术（IMS）领域的进展已使得 原位 无需标记即可对生物基质中的多种代谢物、脂质和蛋白质进行空间定位分析3,4基质辅助激光解吸/电离（MALDI）已成为成像质谱中最常用的电离技术，该技术利用紫外激光从薄组织切片表面消融材料，并通过质谱进行检测4该过程通过在样品表面均匀施加化学基质来实现，从而可在样品表面以光栅模式进行连续测量。数据采集完成后，生成分析物离子强度的热图。近年来，电离源和采样技术的进步使得对细菌等非传统基底的分析成为可能。5 和哺乳动物6,7,8 在营养琼脂上培养的细胞样本。成像质谱（IMS）所提供的分子空间信息能够为感染过程中微生物-微生物以及宿主-微生物相互作用的生化通讯机制提供独特的见解9,10,11,12,13,14.

在发生Clostridioides difficile感染（CDI）时，C. difficile会暴露于胃肠道中快速变化的微生物环境中，多微生物之间的相互作用可能影响感染的结局15,16。然而，目前对感染期间C. difficile与肠道常驻微生物群之间相互作用的分子机制知之甚少。例如，肠球菌是一类肠道微生物组中的机会性共生致病菌，已被证实与CDI易感性增加及疾病严重程度加剧相关17,18,19,20。然而，关于这些致病菌之间相互作用的分子机制仍了解甚少。为了可视化肠道微生物组成员之间的信号分子交流，本研究在琼脂培养基上培养细菌宏菌落，以模拟受控环境中的微生物-微生物相互作用 以及细菌生物膜的形成。然而，由于细菌培养样本含水量高且表面形貌不均，通过MALDI成像质谱分析获取具有代表性的代谢物分布图仍具挑战性。这主要归因于琼脂的高度亲水性以及在去除水分过程中琼脂表面响应不均所致。

琼脂的高含水量还可能使其难以实现均匀的基质辅助激光解吸电离基质包被，并可能干扰后续进行的基质辅助激光解吸电离分析 在真空中21例如，许多基质辅助激光解吸电离（MALDI）离子源在0.1–10 Torr的压力下运行，该真空条件足以去除琼脂中的水分，可能导致样品变形。真空环境引起的琼脂形态变化会导致干燥琼脂材料出现起泡和开裂现象。这些人为假象会降低琼脂与载玻片之间的粘附性，可能导致样品从载玻片脱落或剥落进入仪器的真空系统。琼脂样品在载玻片上的高度偏差可达5 mm，可能与仪器内部离子光学元件之间的空间不足，造成离子光学系统的污染和/或损坏。这些累积效应可能导致离子信号减弱，反映的是表面形貌特征，而非底层微生物生化相互作用的真实情况。在分析前，琼脂样品必须均匀干燥，并牢固地粘附于显微镜载玻片上。 在真空中.

本文展示了一种用于控制干燥在琼脂培养基上生长的细菌宏菌落的样品制备流程。该多步骤、较慢速的干燥过程（相对于先前报道的方法）可确保琼脂均匀脱水，同时最大限度地减少固定在显微镜载玻片上的琼脂样品出现起泡或开裂现象。通过使用这种逐步干燥方法，样品能够牢固地附着在显微镜载玻片上，适用于后续基质涂布及基质辅助激光解吸电离（MALDI）分析。本方法以在琼脂上培养的艰难梭菌（C. difficile）模型菌落以及携带或不携带共生菌和机会性病原体粪肠球菌（ Enterococcus faecalis）的小鼠组织模型为例进行了验证。对细菌和组织模型进行MALDI成像质谱分析，可实现氨基酸代谢物谱的空间定位，为微生物的能量代谢及其相互通讯机制提供新的见解。

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方案

注意：动物实验已获得费城儿童医院和宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院动物护理与使用委员会的批准（方案编号 IAC 18-001316 和 806279）。

警告：Clostridium difficile（C. difficile）和 Enterococcus faecalis（E. faecalis）属于生物安全二级（BSLII）病原体，操作时应极度谨慎。必要时应采用适当的去污染程序。

1. 细菌培养宏菌落的生长及过夜运输前的准备

  1. 准备 C. difficile 和 E. faecalis 的过夜培养物，并分别在厌氧培养箱（85% 氮气、10% 氢气、5% 二氧化碳）中，于 37 °C 条件下，在添加了 0.5% 酵母提取物和 0.1% L-半胱氨酸的脑心浸液肉汤（BHIS）中进行培养。所有平板样品均使用 1.5% 琼脂。
  2. 将细菌培养液的光密度调整至 600 nm 处（OD600）。取每种大菌落 5 µL 点种于含 L-半胱氨酸的 BHIS 琼脂平板上，并在 37 °C 下厌氧培养 7 天。对于多物种混合大菌落，点种前需将细菌培养液按 1:1 比例混合。
  3. 使用欧姆表检测氧化铟锡（ITO）镀层载玻片，以确定具有导电涂层的一侧。使用金刚石刻笔在载玻片的 ITO 镀层侧进行刻蚀并标记。
  4. 从琼脂生长平板上完整切下培养物，然后将其安装到 ITO 镀层载玻片上，确保琼脂与载玻片之间无气泡残留。
    NOTE: 琼脂培养基中的水分应足以使培养物自然黏附于载玻片表面。Yang 等人22的补充文档中提供了该操作过程的示例视频。
  5. 将菌落置于载玻片盒中以提供保护。将载玻片盒放入 8 英寸 × 8 英寸的生物危害标本运输袋中，加入适量干燥剂颗粒，密封后进行隔夜运输，以供后续处理和分析。
    ​NOTE: 在常温运输过程中，保持干燥环境对细菌培养物至关重要，可减缓细菌生长和代谢，维持标本的固定状态直至分析。该运输方法已通过大量实验优化，优于使用干冰冷冻运输。在干燥前经历较大的温度变化容易导致琼脂样品脱落及下方产生气泡。

2. C. difficile 与 E. faecalis 细菌大菌落的常温干燥

  1. 从包装材料中取出固定在ITO涂层显微镜载玻片上的琼脂糖细菌菌落。将样品置于含有干燥剂的干燥箱中，在室温下放置48-72小时。
    注意：这是一种温和且缓慢的干燥过程，可最大程度地减少培养基从显微镜载玻片表面起泡、开裂或脱落的现象。
  2. 妥善处理所有被污染的包装材料，并使用适当的杀菌/杀孢子消毒剂对工作区域进行去污染。
  3. 目视检查菌落在琼脂表面是否存在形变（例如起泡、开裂、脱落）。
    ​注意：琼脂糖表面的高度应明显降低，并在整个载玻片上保持平整。

3. 真空与热介导的 C. difficile + E. faecalis 细菌大菌落干燥

注意：已构建一个定制的真空干燥装置（图1），以促进从琼脂样品中去除过量水分。该装置采用旋片式真空泵，依次连接高效微粒空气生物过滤器（HEPA生物过滤器）、冷阱和一个不锈钢干燥室，细菌样品即置于该干燥室内。通过可调电压变压器连接至一根绝缘金属丝灯丝，使用户能够加热干燥室，从而加快干燥过程。

  1. 关闭样品室的真空管路，打开旋片泵的电源开关，使真空泵预热并达到所需的真空压力。
  2. 打开可调电压变压器，加热缠绕在腔室周围的钨丝。调节可调电源，使真空腔室内部温度升至约50 °C。在泵预热的同时，将干冰与100%乙醇的混合物放入冷阱的冷凝器中。
    注：冷阱可冷凝样品中释放的蒸气或孢子，防止污染旋片泵系统及真空泵油。
  3. 使用扳手松开16 mm双爪法兰卡箍，打开真空腔室。将琼脂糖样品放入腔室内，并用16 mm双爪法兰卡箍紧密密封腔室。
  4. 打开泵阀对腔室抽真空。使样品干燥60–120分钟（例如，在约150 mTorr条件下）。
    注：此干燥时间足以去除小块琼脂样品中的大部分水分。根据具体设备配置和样品情况，可能需要通过实验确定最佳干燥时间，以有效去除水分并降低琼脂高度。过长的干燥时间可能导致干燥后的琼脂变脆并易于开裂。
  5. 干燥完成后，通过关闭旋片泵上的阀门并打开通向外界空气的阀门，缓慢向真空腔室通气至常压。按照前述步骤打开腔室，取出干燥后的琼脂糖样品。
  6. 将样品存放在含有干燥剂的干燥箱中，直至进行基质涂覆。
    ​注：图2展示了琼脂表面在干燥前后的图像。

4. MALDI基质应用  通过 机器人喷洒

注意：琼脂糖样品彻底干燥且培养物切片高度明显降低后，使用机器人基质喷雾器均匀地喷涂一层薄薄的化学MALDI基质化合物。该操作应在化学通风橱中进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。

  1. 选择合适的MALDI基质。为遵循本方案，使用1,5-二氨基萘（DAN）MALDI基质，因其在负离子模式下对氨基酸具有良好的脱附和电离效果。
  2. 配制10 mL浓度为10 mg/mL的DAN MALDI基质溶液，溶剂为90/10（v/v）乙腈/水。使用HPLC级溶剂，超声处理30分钟，并在注入机器人喷雾器注射泵前通过0.2 µm尼龙注射式滤器过滤。此外，还需配制清洗液，以确保每次使用后喷雾管路清洁。
    注意：清洗液的选择旨在提高基质及其他污染物在喷雾管路中的溶解度，从而促进其从系统中清除。本方案所用清洗液包括90/10（v/v）乙腈/水、50/50（v/v）水/甲醇、99/1（v/v）乙腈/乙酸和95/5（v/v）水/氢氧化铵。
  3. 将样品固定于喷雾器载样盘上，并将已配制的溶液加载至喷雾管路中（图3）。通过计算机软件设定必要参数，以实现基质化合物的均匀涂布：喷嘴温度30 °C、喷雾8次、流速0.1 mL/min、CC模式、干燥时间0 s、压力10 psi。
    注意：通常认为，大多数病原体在施加MALDI基质（通常为小分子有机酸或碱）后会被灭活。
  4. 喷雾程序完成后，将样品从喷雾器载样盘上取下，并存放于干燥柜中直至进行分析。

5. 为基质辅助激光解吸电离成像质谱数据采集制备细菌宏菌落

注意：所有成像质谱分析均使用傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪进行。该仪器配备有 Nd:YAG MALDI 激光系统（2 kHz，355 nm）。

  1. 将包被基质的样品插入MALDI靶板显微镜载玻片适配器中，并使用永久性记号笔在涵盖样品区域的位置至少刻写三个基准标记图4使用平板扫描仪获取包含基准标记的显微镜载玻片的光学图像。
    注意：这些基准标记将用于将光学图像与仪器中观察到的MALDI相机视图进行配准。
  2. 定义一种针对所需质量范围、灵敏度和分辨率优化的质谱仪方法，包括质量校准、MALDI激光参数、离子光学参数和ICR池条件。对于该方法，选择一个 100 道尔顿质量窗口 从 m/z 100 到 200 用于气相信号富集 负离子模式 使用连续选择离子累积法（CASI）方法，23 包括 m/z 目标代谢物的数值。
  3. 打开仪器的图像采集软件并使用 安装向导 定义 文件名 和 位置，该 质谱采集方法, 感兴趣区域 待采样的，以及 空间分辨率 图像的
    注意：细菌大菌落成像通常采用 100–300 µm 的空间分辨率。
  4. 所有参数设定完毕后，启动采集序列，以在所定义的感兴趣区域内的每个像素点依次采集质谱。
    ​注意：图像采集时间取决于仪器设置，但通常在包含 5,000–10,000 像素的图像中，采集时间为 2 至 6 小时。

6. 成像质谱数据分析与化合物鉴定

  1. 完成图像采集后，将数据保存为 ".mis" 文件扩展名，这是一种针对成像质谱平台的厂商专用文件格式。可在 flexImaging 或 SCiLS 软件包中打开该数据文件，或将其导出为非专有数据格式（如 .mzml），并使用与厂商无关的软件（例如 Cardinal24 或 MSIreader25,26）进行可视化。
    注意：在 flexImaging 中打开成像数据时，会显示一个平均质谱图，该图代表在采样区域中检测到的所有离子的平均强度。可根据精确质量测定对感兴趣峰进行初步鉴定。通常，在傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪上，质量精度优于 5 百万分之一（ppm）即可满足代谢物鉴定的需求。
  2. 使用相关软件，为感兴趣峰定义质量窗口，以生成采样区域内离子分布的伪彩色热图。
    1. 在平均质谱图显示界面中，放大至目标峰，并选择适当的质量窗口，使其涵盖峰形轮廓的范围。
    2. 右键单击高亮显示的质量窗口，选择添加质量滤波器…。根据高分辨精确质量测定结果对疑似代谢物的初步鉴定，使用相应的 m/z 值进行标注。
    3. 选择强度阈值，以调整伪彩色热图所显示分析物图像的动态范围。进一步调整质量滤波参数，确保质量窗口覆盖峰形轮廓区域，然后添加质量滤波器。
      ​注意：可根据需要进行强度归一化，以改善不同测量区域间的相对定量效果。本文所述实验采用了 CASI 数据采集模式（见下文），这可能导致总离子流（TIC）和均方根（RMS）归一化方法不准确。因此，本文展示的所有离子图像均未进行归一化处理。

7. 非感染对照和产气荚膜梭菌（C. difficile）感染小鼠盲肠组织的制备与运输

  1. 将4至8周龄的C57BL/6雄性小鼠通过饮水添加抗生素（0.5 mg/mL头孢哌酮或0.5 mg/mL头孢哌酮+1 mg/mL万古霉素）进行接种 随意摄取 5天，随后进行2天恢复期，再进行感染。
  2. 通过 CO 处死动物2 窒息后立即采集小鼠盲肠器官。将其包埋于含20%最佳切割温度（OCT）包埋剂的蒸馏水混合液中。
  3. 将样品置于干冰上，随后包装并运送至分析地点；或在分析前于-80 °C保存。

8. 非感染对照与 C. difficile 感染小鼠盲肠组织的冷冻切片

  1. 使用100%乙醇冲洗所有冷冻切片设备，干燥后将样品放入冷冻切片机腔室。使用欧姆表检测载玻片的导电涂层一侧，以确定ITO涂层载玻片的涂层面。使用金刚石笔在ITO涂层侧的载玻片上刻划并标记。
    注意：应佩戴适当的个人防护装备，包括手套、护目镜、实验服和冷冻切片机专用袖套。
  2. 在科研用冷冻切片机上进行切片。将包埋在OCT中的小鼠盲肠组织从-80 °C冰箱中取出，置于干冰上，转移至冷冻切片机腔室（腔室温度30 °C，样品温度-28 °C）。将需通过成像质谱技术进行比较的组织样本（例如，未感染对照组与C. difficile感染组）置于同一张载玻片上，以确保两种组织样本的制备条件一致，便于准确比较代谢物。
  3. 在冷冻切片机腔室内，使用额外的OCT包埋剂将OCT包埋的组织固定在样品夹头上。待OCT溶液完全凝固后，将夹头固定至样品头。以10–50 µm的步进开始切片，直至达到目标组织深度或器官切面。
  4. 当获得理想的组织横截面后，开始以12 µm厚度收集切片。使用艺术家用画笔轻轻操作切片，并将其转移至特氟龙涂层载玻片上。
  5. 将ITO涂层载玻片轻轻滚压在组织切片上，从特氟龙涂层载玻片上拾取组织。通过用手掌按压ITO涂层载玻片背面，使组织切片在载玻片上自然解冻贴附。持续按压直至组织切片由半透明转变为不透明/哑光质地。
  6. 将贴有组织的载玻片置于干冰上，转移至含有干燥剂的干燥箱中，用于当天分析；如需长期保存，则应存放于-80 °C环境中。

9. 非感染对照与C. difficile感染小鼠盲肠组织的制备，用于基质涂布及基质辅助激光解吸电离成像质谱分析

  1. 采用与前述相同的方案进行MALDI基质点样 步骤 4 (喷嘴温度 30 °C，八次打印，流速 0.1 mL/min，CC 模式，干燥时间 0 s，气压 10 psi).
  2. 使用与所述相同的方案进行基质辅助激光解吸电离成像质谱分析 步骤 5 和 6.
  3. 分析多个生物学重复的离子图像，并比较结果以评估显著性 通过 使用上述引用的 SCiLS 统计软件进行强度箱线图比较。
    注意：适当的统计检验和比较方法取决于具体应用，可包括空间分割、分类模型以及用于确定具有区分性和相关性光谱特征的比较分析。比较分析可包括分配 p-值以识别显著特征，进行主成分分析以比较组织样本，并绘制箱线图以识别变异情况。此外，对染色后的组织切片进行明场显微镜观察，也有助于组织的可视化分析 通过 苏木精和伊红（H&E）&E）在成像质谱分析后进行。这有助于清晰识别组织中的形态学特征，并可与经过培训的病理学家共同进行分析。

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结果

我们对模式细菌菌落及共定植小鼠进行了代谢物基质辅助激光解吸电离成像质谱分析 E. faecalis 和 C. difficile 研究氨基酸在微生物-微生物相互作用中的作用。在琼脂上生长的细菌宏菌落可作为明确定义的模型，用于分析细菌生物膜形成过程中的特定生化变化。对在琼脂培养基上生长的细菌宏菌落，需确保其干燥过程受控，以尽量减少琼脂表面的变形和开裂。这一点已通过以下方式实现 通过 一个两步过程，包括在常温和常压下使用干燥剂进行初步干燥，随后在较高温度下进行更快速的真空辅助干燥步骤。采用自行设计的干燥装置，在促进琼脂脱水的同时，捕获样品中释放的任何细菌污染物或孢子（图1）。额外的真空干燥步骤对于确保样品完全脱水至关重要，可防止样品在质谱真空环境中发生形变。

琼脂切片的初始样品高度为 2-4 mm（图2A）并按照干燥方案将高度降至约 0.5 mm图2B）。...

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讨论

在基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI成像质谱）过程中，样品表面必须保持平整，以确保入射的MALDI激光在样品基底上的焦斑直径一致。样品高度的偏差会导致MALDI激光束偏离焦点，引起光束直径和强度的变化，从而影响MALDI电离效率。电离效率的这些变化可能导致分析物信号强度在组织表面出现差异，而这些差异并非反映组织本身的生物化学分布，而是反映了表面形貌的不均一性。此外，大多数MALDI电离源在低于大气压的条件下运行，而含水的琼脂样品在真空条件下属于脆弱样品。in vacuo（真空）环境可能导致琼脂糖样品脱水，从而在干燥过程中改变样品表面。含有气泡或大量水分的样品尤其容易发生此类变化。该问题在对琼脂上培养的细菌样本进行MALDI成像质谱分析时尤为常见。营养琼脂含有较高的水分以支持细菌生长；然而，在涂布MALDI基质并将其引入质谱仪真空系统之前，必须尽可能去除样品中的水分。

因此，水合琼脂样品不适合用于 在真空中 分析。除了由诱导的形态学变化外 在真空中 条件方面，当样品高度从基质辅助激光解吸电离（MALDI）靶板载玻片适配器中突...

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披露

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助项目 GM138660 的支持。J.T.S. 得到了佛罗里达大学 Charles 和 Monica Burkett 家族暑期奖学金的支持。J.P.Z. 得到了美国国立卫生研究院（NIH）K22AI7220（NIAID）和 R35GM138369（NIGMS）基金的支持。A.B.S. 得到了宾夕法尼亚大学细胞与分子生物学培训项目（T32GM07229）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 μm Titan3 尼龙注射器滤器Thermo Scientific42225-NN
1,5-二氨基萘 MALDI 基质Sigma Aldrich2243-62-1
20 mL Henke Ject 鲁尔锁注射器Henke Sass Wolf4200.000V0 
275i 系列对流真空计Kurt J. Lesker 公司KJL275807LL
配备 Smartbeam II Nd:YAG MALDI 激光系统（2 kHz，355 nm）的 7T solariX FTICR 质谱仪 Bruker Daltonics
乙酸溶液，适用于 HPLCSigma Aldrich64-19-7
乙腈，适用于 HPLC，梯度级，≥99.9%Sigma Aldrich75-05-8
氨水溶液，28% NH3 溶于 H2O，痕量金属含量 ≥99.99%Sigma Aldrich1336-21-6
可高压灭菌的生物危害袋：55 加仑Grainger45TV10
生物危害样本运输袋（8 英寸 × 8 英寸）Fisher Scientific01-800-07
脑心浸液肉汤BD Biosciences90003-040
C57BL/6 雄性小鼠 Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II 照片与文件扫描仪Canon
CM 3050S 研究型冷冻切片机Leica Biosystems
干燥柜Sigma AldrichZ268135
金刚石尖刻划笔，Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific50-254-51
Drierite 干燥剂颗粒Drierite21005
乙醇，200 证明Decon Labs2701
flexImaging 软件Bruker Daltonics
ftmsControl 软件Bruker Daltonics
玻璃真空捕集器Sigma AldrichZ549460
HTX M5 TM 机器人喷涂仪HTX Technologies
氧化铟锡（ITO）涂层显微镜载玻片Delta TechnologiesCG-81IN-S115
连接至真空泵的在线 HEPA 过滤器LABCONCO7386500
甲醇，HPLC 级Fisher Chemical  67-56-1
MTP 载玻片适配器 IIBruker Daltonics235380
最佳切割温度（OCT）包埋剂Fischer Scientific23-730-571
Peridox RTU 孢子杀灭剂、消毒剂和清洁剂CONTECCR85335 
聚四氟乙烯（PTFE，特氟龙）印刷载玻片，Electron Microscopy SciencesVWR100488-874
RV8 旋片式真空泵EdwardsA65401903
Tissue-Tek Accu-Edge 一次性高剖面切片机刀片Electron Microscopy Sciences63068-HP
透明真空软管Cole PalmerEW-06414-30
Ultragrade 19 真空泵油EdwardsH11025011
可变电压变压器Powerstat
水，适用于 HPLCSigma Aldrich7732-18-5
广口杜瓦瓶Sigma AldrichZ120790

参考文献

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微生物合作行为的研究 通过 感染过程中在琼脂和组织内生长的细菌菌落的成像质谱分析
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