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C. elegans 性腺解剖与冰冻裂解用于免疫荧光及 DAPI 染色

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DOI：

10.3791/64204

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2022年9月16日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Massachusetts Lowell

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

这是一种常用的方法 秀丽隐杆线虫 性腺解剖结合冷冻裂解，用于制备生殖系样本以进行免疫荧光分析 通过 抗体染色，或仅使用DAPI染色以观察DNA。该方案已成功应用于科研实验室中的本科生，以及基于课程的本科生科研实践教学中。

摘要

C. elegans 的生殖系是研究减数分裂的优良模型，部分原因在于对解剖后的动物进行细胞学分析十分简便。整体封片标本能够保持减数分裂细胞核的结构，更重要的是，每条性腺臂均按时间-空间顺序排列着减数分裂的所有阶段，便于识别处于不同阶段的细胞核。成年雌雄同体线虫具有两条性腺臂，每条均为封闭的管状结构，远端闭合处为增殖的生殖系干细胞，近端开口处为已细胞化的卵母细胞，两条性腺臂在中央汇入子宫。通过解剖可将一条或两条性腺臂从体腔中释放出来，从而实现对整个减数分裂过程的观察。本文介绍了一种针对目标蛋白的常用免疫荧光染色方案，并结合 DAPI 染色以标记所有染色体。选取年轻成虫，用左旋咪唑固定后，迅速使用两根注射器针头进行解剖。在生殖系组织挤出后，样品先经固定，随后在液氮中进行冷冻裂解，以增强角质层及其他组织的通透性。之后，样品可依次经乙醇脱水、再水化，并与一抗和二抗孵育。DAPI 在封片介质中加入，有助于 DNA 的可靠观察，并便于在荧光显微镜下定位待成像的个体。对于熟悉 C. elegans 操作的研究者而言，仅需数小时练习解剖技术即可掌握该方法。该方案已被用于培训高中生及科研实验室中的本科生，并已纳入一所文理学院的课程化本科科研实践课程中。

引言

减数分裂是所有有性生殖生物用于产生配子（卵细胞和精子/花粉）的特殊细胞分裂方式1,2。交叉重组是指同源染色体之间发生的DNA片段互换，对减数分裂至关重要，既为遗传多样性提供了重要来源，也有助于维持世代间的基因组稳定性。在减数分裂过程中未能形成至少一个交叉的染色体将随机分离，可能导致染色体不分离，产生染色体数目异常的配子——这种情况通常会导致子代无法存活3。在减数分裂中，交叉由程序化的DNA双链断裂诱发4。其中一部分断裂会以交叉的方式被修复，形成称为交叉点（chiasmata）的DNA物理连接结构，有助于同源染色体在细胞分裂前正确排列5。减数分裂的各个阶段在所有真核生物中高度保守，其染色体构象特征明显，易于识别。

减数分裂是生物学中的一个基本概念，学生会在不同的生物学课程中多次接触到这一主题。通常在高中阶段，学生会初步学习减数分裂过程中染色体分离的机制；而在大学阶段的课程中，则更侧重于染色体分离的细胞生物学机制以及交换重组对遗传的影响。然而，对许多学生而言，减数分裂是一个 notoriously 难以掌握的概念1。如果学生未能理解基因、DNA、染色体与减数分裂之间的关系，就容易产生误解，并在知识理解上留下空白，从而阻碍其对遗传规律的全面掌握6,7。提高学生对抽象概念理解的一种有效方法是提供具体、动手参与的实践活动。例如，在讲授减数分裂时，教师可以选择模拟分子分析的活动8、使用允许学生操作分子结构的三维模型9，或通过角色扮演让学生亲自演绎分子层面的动态过程1。引入具有未知结果的研究是一种特别有效的教学策略。这种教学实践被称为基于课程的本科生科研经历（course-based undergraduate research experience, CURE），不仅能加深学生的理解，还有助于增强其科学态度和自主性，尤其对那些在科学、技术、工程和数学（STEM）领域中代表性不足群体的学生更为有益10,11。线虫 Caenorhabditis elegans 因其在行为、繁殖力和遗传杂交方面的研究适宜性，非常适用于课堂教学，是向学生介绍生物学研究的高效模式生物12。

C. elegans 将分子遗传学与简单的细胞学分析相结合，成为细胞生物学研究中一种强大的模式生物。它也特别适合用于生物学课堂教学13,14,15。在实验室中，它们易于培养且成本低廉，在标准室温或最常用的20 °C培养条件下，每3天即可产生数百个子代。重要的是，它们可以以甘油菌种的形式冷冻保存于-80 °C冰箱中，这意味着新手研究人员在饲养过程中出现的任何失误都可轻易纠正16。此外，其基因组注释完善，可支持正向和反向遗传学技术的应用17,18，使得C. elegans 能够用于回答从分子水平到进化水平的各类生物学问题。最后，C. elegans 研究领域已形成一个富有支持性的科研社区，通常乐于为初出茅庐的科学家提供帮助与建议19。这些优势促使C. elegans 被广泛应用于多种类型教育机构开设的课程整合科研项目（CUREs）中12,19,20,21,22,23。

除了在研究和教学中的优势外，C. elegans 已成为研究减数分裂和生殖系发育的常用模型24,25,26。这些动物具有光学透明性，便于进行细胞学研究27，且在成体中，性腺几乎占动物总体积的一半，提供了大量可用于研究的减数分裂细胞。在性腺中，减数分裂的生殖系细胞核呈流水线式排列（图1）；有丝分裂发生在性腺远端末端，细胞核随着向性腺近端移动而逐步经历减数分裂各阶段，最终受精胚胎从阴门产出。由于这种高度保守的空间排列也反映了减数分裂的时间进程，因此可根据染色体结构和在性腺中的位置，轻松识别不同阶段的细胞。最后，任何干扰减数分裂并导致非整倍体的异常过程都会产生易于鉴定的表型，即使初学者也能识别：如不育、胚胎致死，或雄性子代高发（Him 表型）28。

这是一种用于可视化减数分裂染色体的简单方案 秀丽隐杆线虫将固定、解剖、固定和抗体染色步骤均在同一块显微镜载玻片上进行，简化了实验流程，并实现了近乎完全的样品回收。该方法适用于简单的DAPI染色以观察染色体，也可用于免疫荧光染色以观察蛋白质在性腺中的定位。学生使用常规解剖显微镜解剖性腺，制备整体封片样本用于DNA或免疫荧光观察，并在复式荧光显微镜下成像。本实验方案已应用于高中生及本科学生科研教学中 秀丽隐杆线虫 研究实验室并整合到一所文理学院的课程型本科科研项目（CURE）中12尽管CURE课程的班级规模相对较小，但由于线虫品系和试剂的成本相对较低，该方案适用于各类教学机构的课程。教师主要受限于可用解剖显微镜的数量。此前的课程实施中，学生三人一组共用一台显微镜，整个实验分为三次90分钟的课时：第一次课练习解剖操作，第二次课进行解剖与DAPI染色，第三次课在宽场荧光显微镜下对玻片进行成像。本科生参与科研可为学生带来诸多益处11,29，包括学术和个人方面。将研究融入课程中 通过 CUREs 使学生能够在正常上课时间内参与科研活动11,30,31，这使得人们能够更便捷、公平地获得这些益处。

方案

1. C. elegans 培养

注意：更多细节请参见 C. elegans 培养方案16 以及 Elgin 等人32 的文献。C. elegans 菌株可从 Caenorhabditis 遗传中心（https://cgc.umn.edu）轻松获取，并通过普通邮件寄送至美国任何地点。每株菌株费用为 10 美元，每个实验室或用户需支付每年 30 美元的费用。

  1. 采用无菌操作技术，制备6 cm线虫生长培养基琼脂平板（NGM琼脂平板）。
    注意：倒好的平板可倒置存放于原始塑料封套或密闭容器中，在4 °C条件下可保存数月。
    1. 制备NGM琼脂平板时，加入3 g NaCl、2.5 g胰蛋白胨（Bacto peptone）、20 g NGM琼脂，并用ddH2O定容至1 L（约975 mL）。使用液体程序在121 °C高压灭菌20分钟。待培养基冷却至55 °C后，在无菌条件下加入1 mL胆固醇溶液、0.5 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4和25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH 6）。
      注意：配制1 M磷酸钾缓冲液时，将108.3 g KH2PO4（单碱式）与35.6 g K2HPO4（双碱式）混合；如需调节pH至6，可用KOH调整。加ddH2O至约900 mL，定容至1 L，于121 °C高压灭菌40分钟。1 L NGM培养基可制备约100个平板，每板含10 mL培养基。 
  2. 使用血清移液管或转移移液管，在平板上滴加三滴大肠杆菌（E.coli）OP50菌液（约150 µL）。尽量将菌滴滴于平板中央，避免靠近边缘；此举可防止线虫爬至平板边缘而干燥死亡。
  3. 待细菌菌膜干燥后，将接种好的平板倒置于室温（RT）下保存，最多可保存2周。建议在使用前至少提前1–2天接种，以便形成更厚的细菌菌膜，从而支持更高密度的线虫生长。
    注意：OP50菌株可从秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）订购。将OP50菌种从甘油保存液中划线接种至LB平板上，以获得单菌落，并于4 °C保存4–6周。OP50菌液培养时，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 °C过夜培养（无需摇动）。配制LB培养基的方法为：加入10 g胰蛋白胨（Tryptone）、10 g NaCl、5 g酵母提取物、950 mL ddH2O，用10 N NaOH调节pH至7 ，再用ddH2O定容至1 L。分装为每份100 mL，于121 °C高压灭菌20分钟。
  4. 为每个品系建立工作种群时，挑选三个L4期雌雄同体个体转移至已接种细菌的NGM平板上。将平板置于15–25 °C条件下培养。标准培养温度为20 °C。若无恒温培养箱，可在室温台面上维持培养。
    注意：L4期雌雄同体可通过体型（小于成虫）以及体内中段出现明显的半月形结构（发育中的阴门）来识别。在20 °C条件下，线虫自孵化后34–46小时进入L4期（约在胚胎产出后40–52小时）。有关发育阶段时间的更多细节，请参见Corsi等人的研究14。
    1. 通过将培养物转移至不同温度条件，调控其发育速度。温度较高时发育较快，温度较低时发育较慢。当温度超过25 °C时，线虫开始出现不育现象。
      ​注意：某些突变基因型具有温度敏感性，其表型会随培养温度的不同而发生变化。
  5. 每隔4天，将三个L4期雌雄同体个体转移至新的接种细菌的NGM平板上，以维持工作种群。此操作可确保种群持续稳定、营养充足，并包含多种发育阶段的个体。

2. 性腺解剖

  1. 收集同龄成虫：在解剖前12-24小时，将L4期雌雄同体挑至新的带有菌斑的NGM平板上——次日这些个体将发育为年轻的成虫，适合进行解剖。所需L4期雌雄同体的数量取决于所进行的细胞学分析类型；通常每张载玻片解剖10-20只雌雄同体，每种实验条件制备两到四张载玻片。
    注意：在食物充足的动物中，性腺最易成功挤出。务必从未饥饿的培养物中挑选L4期雌雄同体线虫（即平板上仍可见明显的细菌菌苔）。饥饿的线虫往往出现不完全的性腺挤出，难以观察。
    1. 若要评估减数分裂的较晚阶段（如终变期），应解剖较年长的成虫（L4期后48小时），因其体内终变期阶段的细胞核更为丰富，便于分析。但研究者需注意，部分效应可能由母体高龄所致。
  2. 准备解剖。
    1. 制备M9：加入3 g KH2PO4 （一碱），6 克 Na2HPO4 （二碱基），5 g NaCl，加入ddH₂O2O至100 mL。在121 °C下高压灭菌20分钟，冷却后加入1 mL 1 M MgSO₄4 采用无菌技术。
    2. 制备解剖缓冲液：将1 µL 10% Tween 20、12 µL 100 mM 左旋咪唑、10 µL 10x M9 和77 µL ddH₂O 混合。2O.
      注意：解剖缓冲液中包含Tween 20，用于降低表面张力并进一步增加组织膜的通透性。
    3. 配制固定液（2% PFA [100 µL]）：将12.5 µL 16% 多聚甲醛（PFA）、10 µL 10x M9 和 77.5 µL ddH₂O 混合。2O；务必使用新开封的PFA安瓿瓶（开封时间不超过2周）。
      注意：PFA 为有害化学品，固定液应在通风橱中配制。
    4. 设置冷冻方法——液氮更易于操作，但如有需要，也可在干冰上放置铝块来替代。
      1. 液氮法：将塑料烧杯或塑料考普林罐置于聚苯乙烯盒中，向烧杯内倒入液氮（溢入聚苯乙烯容器中亦可）。将镊子放置在附近。理想情况下，烧杯应足够狭窄，以防止载玻片完全水平滑落——载玻片应呈倾斜状态，便于用镊子夹取。
        注意：使用液氮时，必须使用塑料容器而非玻璃容器，以避免因快速冷却导致玻璃破碎。
      2. 干冰法：
        1. 将一块平的铝块放置于聚苯乙烯容器或长方形冰桶内的干冰上。为便于冷冻载玻片，铝块的顶部应略高于容器的边缘。
        2. 佩戴手套，轻轻按压铝块以确保其与干冰充分接触，从而加快冷却速度（金属快速冷却时可能会发出尖锐的声响）。将剃刀片放置在附近。
        3. 将铝块置于干冰中至少30分钟，以确保充分冷却，这是实现快速冷冻所必需的步骤。
          注意：理想情况下应使用大块的干冰，这有助于保持表面水平。如有必要，可将铝块放置在干冰颗粒上，但需注意确保表面保持水平。
        4. 铝块表面会结霜，这可能影响载玻片与铝块之间的紧密接触。使用剃刀刀片刮去表面霜层，为每张载玻片清理出适当区域。用盖子盖住聚苯乙烯容器有助于防止霜层过度积聚。
    5. 在 Coplin 染色缸中加入约 40 mL 的 95% 乙醇。
    6. 在三个Coplin染色缸中各加入约40 mL PBS-T。
      注意：配制 PBS-T 时，取 100 mL 10x PBS、5 mL Triton X-100 和 2 mL 0.5 M EDTA（pH 8），加入 873 mL ddH₂O。剧烈振荡以溶解 Triton X-100。配制 10x PBS 时，将 25.6 g Na2HPO4·7H2O，80 g NaCl，2 g KCl 和 2 g KH2PO4. 加入ddH₂O2O 加至 1 L。在 121°C 下高压灭菌 40 分钟。洗涤缓冲液 PBS-T 中含有去垢剂 Triton X-100，以降低表面张力并增强整体封片动物样本在载玻片上的附着。
  3. 在18 mm × 18 mm的玻璃盖玻片上解剖动物。由于解剖缓冲液易蒸发，此步骤需控制时间，解剖过程应于5分钟内完成。
    注意：左旋咪唑用于固定动物以方便解剖，但若将动物在左旋咪唑中放置过久，会导致性腺外翻效果不佳。为确保操作在5分钟内完成，最简便的方法是减少每张载玻片上解剖的动物数量。
    1. 将固定载玻片放置在解剖显微镜的载物台上——该固定载玻片用于更方便地移动盖玻片，可无限次重复使用（图 2A，左侧照片）。
    2. 将盖玻片置于持片载玻片上方，并用移液器吸取4 µL解剖液滴加至盖玻片中央。将持片载玻片移至显微镜载物台一侧，以腾出视野。
    3. 挑选10-20条雌雄同体放入一滴解剖液中。选择足够数量的个体以保证每张载玻片可获得约10个样本，但不宜过多，以免无法在5分钟内完成解剖。
    4. 使用两根注射器针头解剖动物，每只手各持一根（图2A).
      1. 将针尖交叉形成 X 形，并用 X 的底部将成虫固定在盖玻片表面。
        注意：掌握每根针的最佳持针角度和旋转方式可能需要练习。开始时，应将针的斜面（倾斜边缘）朝下持握。有关初次学习在较大体积中进行解剖的建议，请参见讨论部分图 2D).
      2. 将 X 形结构置于咽部后方，约位于年轻成虫体长的五分之一处，或位于头部透明区域的下方图2A，右图）。
      3. 用剪刀式动作迅速切断动物头部（类似于用刀叉切割食物）。操作得当的情况下， gonad 的一条臂（有时是两条臂）会完全从体腔中脱出，同时伴随一条或两条肠管半段一同释放。图2B肠道呈现较暗且宽度均匀，而性腺则透明，远端呈锥形尖端（左图）。
        1. 每只动物仅应切割一次；若切割后性腺未突出，则直接进行下一只动物的操作。首次切割会显著降低体内静水压力，使得再次切割几乎不可能实现更好的外翻效果。在成像过程中，不完整或效果不佳的外翻现象易于识别，可予以忽略。图2B，右图）。
          注意：不要试图将性腺与尸体分离，否则通常会撕裂组织，从而限制可分析的减数分裂阶段的数量。
      4. 对盖玻片上剩余的动物重复解剖操作。
  4. 用甲醛固定样品。
    1. 轻柔操作，将4 µL固定液用移液器加到盖玻片上靠近动物液滴的附近。理想情况下，液滴应足够接近以自然融合；避免将固定液直接加入解剖液滴中，以免移位已解剖的尸体。
    2. 用一只手的手指将盖玻片固定在载玻片上，另一只手轻轻弹击盖玻片数次以混匀液滴。最终固定液浓度为 0.8% PFA。
    3. 手持带正电荷的载玻片，使其正面朝下，用其在载玻片中央拾取盖玻片。轻轻接触样品液滴，液滴的表面张力将使盖玻片被吸附。
      注意：带正电荷的载玻片具有静电涂层，有助于组织贴附于表面，防止样本丢失。
      1. 必要时，将盖玻片斜向放置，使其一个角悬伸出载玻片顶部或底部边缘约1 mm。留出悬边有助于在冷冻后更易将盖玻片敲碎取下图2C).
    4. 将载玻片置于实验台，室温下准确固定5分钟。在此期间，用铅笔标记载玻片。
      注意：样本过度固定是常见问题，可通过抗体无法进入细胞核甚至所有组织来判断。此外，某些抗体对甲醛特别敏感。在此类情况下，应缩短固定时间，或降低所用甲醛的终浓度。
  5. 冷冻裂解
    1. 固定后立即冷冻载玻片。
      1. 若使用液氮：用镊子夹住已标记的玻片边缘，轻轻将其浸入液氮中。松开玻片，使其斜靠在烧杯侧壁，盖玻片朝上。玻片在10秒内即完成冷冻（待液氮停止沸腾时）。
      2. 若使用干冰：用刀片刮去铝块表面的霜。牢固握住载玻片的标记边缘，将其放置在清理过的表面上，并向下施加一定压力，以确保载玻片与铝块充分接触。盖玻片应完全置于铝块表面。冷冻过程在10秒内完成，可通过盖玻片下的样品结冰来目视确认。
      3. 两种方法均需将载玻片放置至少 5 分钟，以确保完全冻结。
        注意：切片冷冻后可置于液氮中或冷冻块上 15–20 分钟，只要保持冷冻状态即可。此步骤可同时收集多个切片，再进行后续的裂解操作。
    2. 迅速操作，将盖玻片从样品上取下。此步骤具有时间敏感性。在样品开始解冻前，移除盖玻片并将载玻片浸入乙醇中。
      1. 用镊子取出冷冻载玻片（使用液氮时）。
      2. 牢固握住载玻片的标签短边，并将一侧长边紧靠实验台面。
      3. 另一只手紧握剃刀，将剃刀边缘沿载玻片向下滑动，以弹掉盖玻片并使其远离样本。若盖玻片放置时有一角悬出，此步骤会稍显容易图2C).
  6. 立即将载玻片放入盛有95%乙醇的考普林瓶中，于室温下放置。载玻片在乙醇中至少浸泡5分钟。
    注意：切片可在乙醇中放置一段时间——此步骤可先收集多张切片，再进行后续洗涤。切片在此步骤也可保存数天。若需保存，请将盛有切片的柯铂林瓶（Coplin jar）连同乙醇一起置于 -20 °C。
  7. 用 PBS-T 在室温下洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。每次洗涤使用新鲜的 PBS-T。
  8. 如果使用抗体染色，则进行步骤3（抗体染色）；如果仅使用DAPI染色以观察染色体，则进行步骤4（封片与成像）。

3. 抗体染色

  1. 一抗孵育
    注意：在为新抗体确定合适条件时，必须包含以下阴性对照，以验证荧光信号的特异性：1）不加一抗、仅加二抗的切片；2）仅加一抗、不加二抗的切片。这些阴性对照均应完全无信号。若在仅加二抗的切片上检测到荧光，应提高二抗的稀释比例或更换不同的二抗；若在仅加一抗的切片上检测到荧光，则可能是由于自发荧光或其他潜在污染物所致。
    1. 用抗体稀释缓冲液（50 mg BSA + 50 µL 10% 叠氮化钠 + 10 mL PBS-T）稀释一抗——每张切片准备20–30 µL稀释液。
    2. 准备湿盒：在带密封盖的塑料容器底部铺上湿润的纸巾，再在其上平放一层玻璃巴斯德移液管。这些移液管可形成一个支撑面，使切片保持水平并悬空于纸巾之上。
      注意：建议使用带卡扣盖的塑料食品储存盒作为湿盒，便于开合且不会扰动内部切片。应选择长度足以容纳巴斯德移液管、底部相对平坦且无凹陷的容器，以确保切片完全水平放置。
    3. 从最后一次PBS-T洗涤中取出切片。自此步骤起需快速操作，始终确保样本保持湿润，避免蒸发。若样本干燥，将严重影响抗体染色效果。
    4. 用折叠成紧凑矩形的擦拭纸擦干切片整个表面。擦拭切片正反面时，应远离样本区域留出足够空间。特别注意在靠近样本区域时小心操作，避免过于接近样本，使约等于盖玻片大小的中心区域保持湿润。但需确保样本周围边缘区域干燥，以便进行下一步操作。
    5. 使用疏水性PAP笔在样本周围画一圈。应小心包围整个样本区域，避免触碰切片表面可见的动物尸体。等待约5秒，使屏障完全干燥。
      注意：由于切片表面已涂有含去污剂的PBS-T，必须使用疏水屏障以防止一抗溶液扩散。PAP笔在干燥表面效果最佳，因此在样本周围创建干燥边缘至关重要。保持最靠近样本的区域不干燥，可在本步骤中保护样本。
    6. 迅速用折叠擦拭纸的角或边缘将疏水屏障内的样本周围液体吸走。操作时注意避免扰动动物尸体。
    7. 立即用移液器将20 µL一抗溶液加入疏水屏障形成的环内。移液时应轻柔倾斜操作，避免扰动尸体，切勿直接将液体滴加在任何尸体上。
    8. 轻轻倾斜切片，确保疏水屏障内的整个表面均被溶液覆盖。
      注意：疏水屏障的内径最好为1–1.5 cm，20 µL抗体溶液即可完全覆盖。屏障宽度取决于冷冻裂解步骤中尸体的分布情况。较宽的屏障可能需要更高体积的抗体溶液。如有需要，可将小块Parafilm（裁剪为18 mm × 18 mm盖玻片大小）轻轻覆盖在样本上，以确保抗体溶液完全覆盖样本并防止蒸发。
    9. 对剩余切片重复步骤3.1.3–3.1.8。
    10. 小心将切片转移至湿盒中，确保溶液保留在疏水屏障内，且切片完全水平放置。
    11. 室温下避光孵育过夜。根据抗体不同，此步骤可缩短至6小时，或在4 °C下过夜孵育，即将湿盒置于冷藏室或冰箱中。
      注意：使用湿盒和疏水屏障通常足以防止抗体溶液在长时间过夜孵育过程中蒸发。但如果出现蒸发问题，可将小块Parafilm轻轻覆盖在每个样本上以减少蒸发。这些Parafilm可在第一次洗涤步骤中去除：将每张切片浸入装有PBS-T（不含其他切片）的考普林瓶中，使Parafilm自然漂离样本。在使用同一考普林瓶处理下一张切片前，需先将其从瓶中取出。
  2. 在含有约40 mL PBS-T的考普林瓶中，室温下洗涤切片三次，每次5分钟。每次洗涤均使用新鲜PBS-T。
    1. 在洗涤过程中，用抗体稀释缓冲液稀释二抗。每张切片准备20–30 µL稀释液。通常使用1:200稀释的Alexa Fluor标记二抗。
  3. 二抗孵育
    1. 从最后一次PBS-T洗涤中取出切片。自此步骤起需快速操作，始终确保样本保持湿润，避免蒸发。
    2. 用折叠的擦拭纸擦干切片，但避免擦干疏水屏障内的区域。
    3. 迅速用折叠擦拭纸的角或边缘将疏水屏障内的样本周围液体吸走。操作时注意避免扰动动物尸体。
    4. 立即用移液器将20 µL二抗溶液加入疏水屏障形成的环内。移液时应轻柔倾斜操作，避免扰动尸体。
    5. 切勿直接将液体滴加在任何尸体上。确保疏水屏障内的整个表面均被溶液覆盖。较宽的屏障可能需要更高体积的抗体溶液。如有需要，可用小块Parafilm覆盖样本（参见步骤3.1.8下方的注释）。
    6. 小心将切片转移至湿盒中，确保溶液保留在疏水屏障内，且切片完全水平放置。盖上湿盒盖子以保持避光。
    7. 对剩余切片重复步骤3.3.1–3.3.6。
    8. 室温下避光孵育4小时。
      注意：根据抗体不同，此步骤可缩短至2小时或延长至6小时。若湿盒本身不避光，可将其放入抽屉中或用纸板箱覆盖。也可用铝箔包裹湿盒以确保切片处于黑暗环境中。
  4. 在含有约40 mL PBS-T的考普林瓶中，室温下洗涤切片三次，每次5分钟。每次洗涤均使用新鲜PBS-T。

4. 封片与成像

  1. 准备封片：将含 DAPI（2 µg/mL）的封片剂、18 mm × 18 mm 玻璃盖玻片和指甲油置于手边，方便取用。
  2. 从最后一次洗涤液中取出载玻片，用折叠的擦镜纸轻轻擦干。注意避免擦干疏水屏障内的区域。
  3. 使用折叠擦镜纸的一角，小心地从屏障内的样品区域吸去液体。此步骤应去除大部分液体，但切勿使样品完全干燥。
  4. 迅速操作，向样品中加入 8 µL 封片剂。用移液器以倾斜角度轻柔加样，避免扰动样品。切勿直接将液体滴加在样品上。
  5. 继续快速操作，小心地将玻璃盖玻片缓缓盖在样品上。
    1. 气泡会影响成像并导致样品降解。为减少气泡产生，先将盖玻片的一边边缘接触载玻片上样品旁的位置，使其以对角线方式悬于样品上方。可将盖玻片较高的一侧边缘轻轻搭在铅笔或镊子上以辅助操作。然后缓慢放下较高的一侧边缘——此动作可使封片剂从一侧边缘逐渐扩散至对侧，形成连续的液体密封层。
  6. 对剩余载玻片重复步骤 4.2–4.5。
  7. 用指甲油密封盖玻片。操作时注意不要向下按压盖玻片（以免压碎样品），也不要水平移动盖玻片（以免造成样品拖拽或涂抹）。
    1. 在盖玻片的每个角落各加一小滴指甲油（约 1 mm 宽），以帮助固定盖玻片位置。待各滴完全干燥。
    2. 待角落的指甲油完全干燥后，用指甲油沿边缘进行密封。确保指甲油完全填充盖玻片与载玻片之间的缝隙，但避免过度覆盖样品区域。最佳操作是使指甲油在盖玻片上保持约 1 mm 的重叠覆盖。仅使用必要的量，避免过多或残留多余指甲油，因其干燥时间较长，可能损坏显微镜物镜。
      注意：建议使用有色指甲油而非透明指甲油，以便更清晰地识别密封边界，并有助于避免对位于指甲油覆盖区域下的样品进行成像。
    3. 成像前必须确保指甲油完全干燥。此步骤至关重要，湿的指甲油可能严重损坏显微镜物镜。
      注意：此后应尽可能将载玻片避光保存。可在实验台干燥时用平放的纸板箱覆盖载玻片。
  8. 成像前将载玻片置于 4 °C 避光保存 1–2 周。如需长期保存，可置于 -20 °C。
  9. 使用标准荧光复合光学显微镜进行成像。
    1. 对每张载玻片，首先在 DAPI 通道下以 10x 物镜全面观察整个样品，识别出完整外翻的性腺并记录其位置。大多数实验应用中，应避免对断裂、不完整或被动物其他部分遮挡的性腺进行成像。大多数个体中，仅有一侧性腺臂完全外翻且可见。
      注意：在 DAPI 通道下以 10x 物镜拍摄整个性腺的低倍图像，有助于后续定位或识别特定细胞核的位置。
    2. 根据实验需求，可选择 40x、63x 或 100x 物镜进行成像。若需完整捕获整个性腺，应创建具有重叠边界的拼接图像。成像时请注意，性腺为中空管状结构，细胞核在顶部和底部最为密集。

结果

DAPI 与 DNA 结合能力强，即使在多种条件下染色效果依然稳定（图 3A，B）。它应存在于所有细胞核中，因此可作为有效阳性对照，用于确认载玻片上是否存在线虫组织以及显微镜是否具备荧光检测能力。当抗体存在于减数分裂细胞核内时，染色效果良好（图 3A，B）。例如，图 3A，B 显示了用 DAPI 和靶向 RAD-51 的抗体对中期粗线期细胞核进行染色的结果，其中 RAD-51 是双链断裂的标志物。KLE-2 是凝缩蛋白（condensin）的一个组分，凝缩蛋白是一种高度保守的蛋白质复合物，在有丝分裂和减数分裂前参与染色体结构的构建。kle-2/+ 突变体在染色体结构上存在轻微缺陷，表现为 DAPI 染色略微紊乱，并且双链断裂数量增加，反映为 RAD-51 焦点数量增多（图 3B）。免疫荧光实验中的一个常见错误是将样品在固定液中放置时间过长。过度固定可能导致染色失败，因为它通常会阻碍抗体扩散进入细胞核。当抗体出现在性腺的细胞质区域，但被排除在细胞核之外时，即可识别出该错误。

在生殖系中（图1），细胞核在远端末端进行有丝分裂增殖，进入过渡区后开始减数分裂，并经过粗线期（通常根据细胞核排数分为三个相等的阶段），随后进入双线期，最终到达终变期。终变期的卵母细胞根据其与受精囊的相对位置进行编号，其中-1号卵母细胞最靠近受精囊，-2号卵母细胞次之，依此类推。C. elegans 具有六条染色体，在终变期的细胞核中表现为紧凑的椭圆形结构。每一条代表一对由交叉（chiasma）连接的姐妹染色单体，也称为二价体（bivalent）（图3C）。像 spo-11 这类破坏交换（crossover）形成的突变体，无法形成交叉结构，因此终变期的细胞核中会出现12个独立的DAPI染色信号（也称为单价体，univalents），每个信号对应一条姐妹染色单体（图3D）。

秀丽隐杆线虫性腺、细胞周期阶段、荧光显微镜、有丝分裂区、粗线期、终变期。
图1：生殖系细胞核以时空有序的方式排列，反映了其在减数分裂过程中的进展。（A）经DAPI染色的整装年轻成虫雌雄同体。图中勾画出性腺及减数分裂各阶段，从远端顶端（星号）至近端区域（箭头所示的-1卵母细胞），后者包含受精囊（三角形）。比例尺为100 µm。（B）经DAPI染色的分离雌雄同体性腺的投影荧光图像。图中标注了减数分裂各阶段，插图中展示了代表性细胞核（所有插图彼此按相同比例显示）。根据细胞核在生殖系中的位置及其特征性的染色体形态，可清晰判断其阶段，依次从远端顶端（星号）的有丝分裂区，经过渡区，至粗线期、双线期和终变期。受精囊以三角形标记。本图经许可改编自Hillers等人的研究，采用CC BY 3.0许可协议28。请点击此处查看本图的放大版本。

线虫解剖方法、性腺外翻示意图、显微镜结果、实验操作流程。
图 2：解剖操作设置示意图。（A）解剖过程中的显微镜载物台。将线虫置于载片上盖玻片中的 4 µL 解剖液内进行解剖，通过移动载片使盖玻片进入视野。图中显示了持针的理想位置。持针时针尖斜面朝下，在咽部区域上方交叉，粉红色箭头表示针的剪切样运动。粉红色虚线表示理想的切割位置。（B）解剖后线虫的图像，展示了一例完整外翻和一例不完全外翻的情况。图中外翻的性腺和肠道部分已作标注。（C）展示冷冻裂解步骤的图像。一只手应牢固握住载玻片，使盖玻片一侧背离身体，另一侧边缘抵住实验台。另一只手握住剃刀。粉红色箭头指示剃刀移动方向，以轻弹方式将盖玻片从载玻片上弹离，同时稍作扭转，使盖玻片远离身体方向飞出。注意盖玻片应放置成一角悬于载玻片长边之外。（D）在玻璃胚胎染色皿中进行解剖练习的装置示意图。将线虫置于 50–200 µL 解剖液中，可避免蒸发问题并延长解剖操作时间。请点击此处查看此图的放大版本。

经DAPI和RAD-51染色的染色体结构显微镜图像；野生型与突变体对比。
图3：生殖系细胞核的代表性荧光结果。（A，B）晚期粗线期细胞核的Z轴投影图像，使用RAD-51抗体（绿色）和DAPI（红色）染色，其中（A）为野生型，（B）为kle-2/+杂合子。（C，D）单个终变期细胞核的Z轴投影图像，使用DAPI染色，其中（C）为野生型（显示六个DAPI染色结构），（D）为spo-11突变体（显示12个DAPI染色结构）。比例尺表示5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

有性生殖需要产生单倍体配子，这些配子是通过减数分裂形成的 通过 减数分裂这一特殊形式的细胞分裂。 秀丽隐杆线虫 因其光学透明性、便于观察的生殖系统结构以及强大的遗传学工具，已成为减数分裂细胞学研究的常用模型28通过将简单的生物体实验（如评估生育力和胚胎致死率）与分子遗传学方法相结合，可以在实验室或课堂教学中解答多种科学问题。例如，由于交叉互换对染色体正确分离至关重要，任何干扰其形成或解析过程的机制都会导致非整倍体配子的产生。而非整倍体将进一步引发无法存活的子代，这一现象可通过统计子代数量，或采用稍复杂的胚胎致死率测定方法进行简便评估。在细胞学层面，交叉互换的缺失会影响终变期（diakinesis）观察到的DAPI染色体结构数目。由于DAPI染色信号强且易于计数，该实验非常适于教授细胞学技术。雌雄同体生殖系中细胞核具有时空上的有序排列，可在单一时间点呈现减数分裂各阶段的完整图景。细胞核从生殖腺远端的有丝分裂区向近端移动并完成发育，整个过程约需54小时（实例参见Jaramillo-Lambert et al.）。33，Stamper 等34 和 Libuda 等人35这一成熟的减数分裂进程时间框架使得脉冲-追踪标记或DNA损伤实验得以顺利进行。

由于DAPI染色几乎总是有效，因此可作为荧光显微镜实验的一项有用的技术对照（并能为正在接受培训的显微镜操作人员带来成就感）。抗体染色结果可能更具变异性，因此可用于评估重复样本之间的可重复性。C.elegans的性腺在固定时往往难以保持一致性，因为该步骤需要在维持染色体结构完整性和允许足够抗体渗透之间取得平衡。使用甲醛固定最有利于保持染色体形态，而通过多聚甲醛安瓿新鲜配制的甲醛溶液可获得最可重复的结果。也可使用由福尔马林（37%水溶液甲醛与甲醇）配制的甲醛溶液。每种抗体所需的固定强度和时间可能需要通过实验经验来确定。替代方法包括在步骤2.4中省略甲醛固定，在冻裂后，将样品浸入-20 °C的100%乙醇中，或先在100%甲醇中浸润10分钟，再于-20 °C下浸入100%丙酮10分钟。这些固定条件有利于抗体更好地渗透，但会对组织形态产生不利影响（染色体会显得膨胀、松散）。

步骤2中所述的解剖和固定步骤的时间控制非常重要。由于解剖液的体积非常小，蒸发会影响最终的固定浓度，从而导致抗体染色结果不稳定。一位经验丰富的秀丽隐杆线虫（C. elegans）操作人员从开始（步骤2.3）到完成固定（步骤2.4）可在不到2分钟内制备好一张载玻片样品。主要的技术难点在于能否将线虫准确挑入解剖液滴中并迅速完成解剖。在较大体积液体中学习解剖操作可能更为容易。初学者可首先将线虫挑入玻璃胚胎染色皿中的50–200 µL解剖液内（图2D）；较宽广的液面提供了更大的操作空间，便于确定针头的理想位置以获得良好的性腺外翻效果，同时较大的液体体积也减轻了蒸发带来的影响。在熟练掌握解剖动作后，学习者可先尝试在染色皿中使用50 µL液体进行解剖，然后过渡到在载玻片上使用20 µL液体进行操作。一旦能够在载玻片上顺利操作，学习者便可逐步减少液体用量，直至能够在4 µL的极小体积下快速完成操作，使蒸发效应可忽略不计。

如果解剖时机难以把握，学员可在步骤 2.3 中使用 8 µL 解剖液进行解剖。随后在步骤 2.4 中加入 8 µL 固定液，轻轻吹打混匀（需密切观察，确保尸体未被破坏或吸走），并从混合液中移除 8 µL。这种替代方法将获得相同的最终体积（8 µL）和相同的最终固定浓度；该体积对于确保在步骤 2.5 的冷冻裂解过程中尸体能够同时接触盖玻片和载玻片表面至关重要。如果即使在较大体积解剖液中操作，制备每张载玻片的时机仍存在问题，Gervaise 和 Arur26 已描述了一种用于生殖系免疫荧光实验的悬浮法。

使用免疫荧光技术观察蛋白质的主要局限性 原位 获得针对特定目标蛋白的一抗是本实验的关键。然而，如果已构建了带有标签的蛋白版本，则可调整本方案以检测该标签。针对常见标签（如 FLAG、HA 或 GFP）的一抗通常易于获取。对于 GFP 等荧光标签，其荧光信号常在固定步骤中被淬灭，因此建议使用抗 GFP 的一抗进行检测，而非依赖其自身的荧光信号。本方案的另一局限性在于，它仅能捕捉某一时间点的生殖系状态（尽管样本中将包含卵子发生的所有阶段）。因此，该技术可能遗漏卵母细胞在卵子发生过程中发生的动态变化。然而，配子发生的时间进程已在模式生物中得到深入研究。 秀丽隐杆线虫；在野生型年轻成虫中，卵母细胞从生殖系远端末端（有丝分裂区）发育至双线期约需60小时33因此，通过脉冲追踪实验或照射等特定干预措施，再结合时间进程分析，可观察减数分裂不同阶段的影响。

综上所述，本实验方案描述了秀丽隐杆线虫（C. elegans）性腺解剖及随后的DAPI与抗体染色，用于荧光显微镜观察。解剖与固定（步骤2）耗时60至90分钟，具体时间取决于制备的载玻片数量。抗体染色（步骤3）主要为非操作时间，最短约7小时，最长可达1.5天，具体取决于抗体孵育时间。封片（步骤4.1–4.7）约需15分钟。该可视化生殖系染色体与性腺的通用方法，只要存在相应的抗体或荧光标记试剂，即可用于任何蛋白质的细胞学研究。在最简单的应用中，通过DAPI染色双线期细胞核，可用于筛选影响减数分裂重组的因子。当结合对后代数量、雄性子代发生率（Him表型）以及胚胎致死率等个体水平的分析时，该细胞学方法可为基于群体的分析提供单细胞层面的对应验证。

披露

作者声明无利益冲突需要披露。本稿件中的内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院或美国国家科学基金会的官方观点。

致谢

Lee 实验室的工作由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（资助号 1R15GM144861）和国家儿童健康与人类发展研究所（资助号 1R15HD104115）提供支持。DA 受马萨诸塞大学洛威尔分校肯尼迪科学学院科学学者项目资助。NW 受马萨诸塞大学洛威尔分校荣誉学院奖学金及马萨诸塞大学洛威尔分校 STEM 人才拓展项目（UMLSAMP）奖学金资助（美国国家科学基金会资助号 HRD-1712771）。我们感谢 A. Gartner 提供 RAD-51 抗体。所有 C. elegans 菌株均由 Caenorhabditis 遗传学中心提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室资助（资助号 P40 OD010440）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG 二抗Molecular Probes711-545-152
铝制加热/冷却块Millipore SigmaZ743497
蛋白胨（Bacto Peptone）GibcoDF0118 17 0
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管，5.75 英寸Fisherbrand13 678 20B用于制作线虫挑针
牛血清白蛋白（BSA）VWR97061 420
C. elegans 野生型（祖先株）Caenorhabditis 遗传中心N2（祖先株）
C. elegans kle-2 (ok1151) 突变体Caenorhabditis 遗传中心VC768该品系的完整基因型为：kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III)。该品系中 kle-2 基因由一条带有咽部 GFP 标记的平衡染色体维持。挑选非绿色个体以获得纯合的 kle-2 突变体。
C. elegans spo-11 (me44) 突变体Caenorhabditis 遗传中心TY4342该品系的完整基因型为：spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V)。该品系中 spo-11 基因由一条带有咽部 GFP 标记的平衡染色体维持。挑选非绿色个体以获得纯合的 spo-11 突变体。
无水氯化钙VWR97062 590
胆固醇Sigma Aldrich501848300
DAPILife TechnologiesD1306
EDTA 二钠二水合物盐Apex Bioresearch Products20 147
胚胎培养皿，玻璃，30 mm 腔体Electron Microscopy Services100492-980用于练习解剖；优选玻璃材质，因为解剖后的线虫容易粘附在塑料表面
Escherichia coliCaenorhabditis 遗传中心OP50
塑料食品储存容器各种品牌n/a优选具有以下特征的塑料容器：（1）底部相对平坦，以便载玻片水平放置；（2）盖子密封性好但易于打开，且不会扰动容器内容物；（3）尺寸约为长 9 英寸、宽 6 英寸
玻璃 Coplin 染色缸DWK Life Sciences Wheaton08-813E
疏水屏障 PAP 笔ImmEdgeNC9545623
Kimwipes 擦镜纸Kimtech Science06 666A
盐酸左旋咪唑Sigma AldrichL0380000
无水硫酸镁Fisher ChemicalM65 500
一次性针头，25 GBD PrecisionGlide14 821 13D蓝色，1 英寸
NGM 琼脂粉Apex Bioresearch Products20 249NGM
Parafilm 封口膜Bemis16 101
多聚甲醛（16% w/v）水溶液Electron Microscopy Sciences50 980 487
PBS 磷酸盐缓冲液（10x 溶液）Fisher BioReagentsBP399500
60 mm 培养皿Tritech ResearchNC9321999无通气孔，锐边
铂丝（90% 铂，10% 铱）Tritech ResearchPT 9010用于制作线虫挑针
氯化钾FisherBP366-500
磷酸氢二钾VWR BDH ChemicalsBDH9266 500G
磷酸二氢钾VWR BDH ChemicalsBDH9268 500G
优质盖玻片，18 mm × 18 mmFisherbrand12-548-AP厚度 0.13–0.17 mm
单边剃须刀片VWR55411 055
SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂Molecular ProbesS36937替代品：VectaShield 抗荧光淬灭封片剂（Vector Laboratories，H-1000-10）或 ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂（Thermo Fisher Scientific，P36970）。若使用 ProLong Diamond，则无需指甲油封片，但载玻片需在成像前固化 24 小时。
叠氮化钠Fisher BioReagentsBP922I 500
氯化钠Fisher ChemicalS271 500
无水磷酸氢二钠Sigma Aldrich7558 79 4
七水合磷酸氢二钠Sigma AldrichS9390
泡沫塑料箱各种品牌n/a内部尺寸约为：长 12 英寸，宽 9 英寸，深 8 英寸
Superfrost Plus 显微载玻片Fisherbrand22 037 246
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151 500
胰蛋白胨Apex Bioresearch Products20 251
Tween 20Fisher ChemicalBP337 500
酵母提取物Apex Bioresearch Products20 254

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免疫荧光染色生殖细胞挤出染色体可视化共聚焦显微镜RAD-51 焦点双链断裂
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