传统上，小鼠胚胎瓣膜原基的内皮细胞层通常通过横断面、冠状面或矢状面切片进行分析。我们提出了一种新的方法，可在瓣膜形成区域对内皮细胞层进行en face（表面）二维成像，从而实现对瓣膜发育过程中内皮细胞平面极性及细胞重排的分析。
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本文内容
摘要
摘要
研究哺乳动物心脏发育过程中细胞与分子机制对于理解人类先天性心脏病至关重要。原始心脏瓣膜的发育涉及心房心室管（AVC）和心室流出道（OFT）区域的心内膜细胞在局部诱导性心肌和心内膜信号作用下发生上皮-间质转化（EMT）。当这些细胞脱离并侵入位于心内膜与心肌之间的细胞外基质（即心胶质）后，原始心内膜垫（EC）即形成。此过程意味着心内膜必须填补脱离细胞所留下的空隙，并沿某一轴向进行汇聚（变窄）或延伸（延长）以完成自身重组。目前研究表明，平面细胞极性（PCP）通路参与调控该过程中相关因子的亚细胞定位。传统上，心脏瓣膜发育的初始阶段主要通过胚胎心脏的横切面或体外培养模型进行研究。 离体 在胶原凝胶上培养的房室管（AVC）或心动脉球（OFT）外植体。这些方法可用于分析细胞的顶-基底极性，但无法用于研究上皮细胞平面内的细胞行为或迁移细胞的形态学变化。本文展示了一种实验方法，可将瓣膜发生区域的内皮细胞层以平面细胞群的形式进行可视化观察。该实验方法为研究心动脉球和房室管内皮细胞在瓣膜发育过程中平面细胞极性（PCP）、平面拓扑结构及细胞间通讯提供了可能。解析参与心脏瓣膜形态发生的新型细胞机制，有助于理解与内皮垫发育缺陷相关的先天性心脏病。
引言
心脏是哺乳动物胚胎中第一个具有功能的器官。在小鼠胚胎发育约第7.5天（E7.5）时，位于腹侧的双侧心脏前体中胚层细胞形成心月结构1。心月结构包含两类心脏前体细胞，分别生成心肌层和心内膜2。约在E8.0时，心脏前体细胞在中线处融合，形成原始心管，其由两层上皮组织构成：外层为心肌层，内层为心内膜，后者是一种特化内皮，两者之间由一种名为心胶质的细胞外基质分隔。随后在E8.5时，心管发生向右弯曲的环化过程。环化后的心脏具有不同的解剖区域，各区域具有特定的分子特征，例如流出道（OFT）、心室以及房室管（AVC）3。尽管最初心管通过细胞增殖在其流入端不断扩张4，但在E9.5时，强烈的心脏细胞增殖导致心腔膨出，并形成小梁网络结构5。瓣膜的形成发生在房室管（未来形成二尖瓣和三尖瓣）以及流出道（未来形成主动脉瓣和肺动脉瓣）。
心内膜在瓣膜发育过程中发挥着关键作用。心内膜细胞在房室管（AVC）和动脉干（OFT）中经历上皮-间质转化（EMT），形成心内膜垫，这一结构在瓣膜发育起始时出现。不同的信号通路可激活该过程；在小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5），心肌来源的BMP2可激活心内膜中的NOTCH信号，进而通过激活TGFβ2和SNAIL（SNAI1）促进AVC和O....
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方案
动物实验已获国家心血管研究中心（Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, CNIC）动物实验伦理委员会以及马德里自治区（编号：PROEX 155.7/20）批准。所有动物实验操作均符合欧盟关于实验和科学用途动物保护的指令2010/63/EU和建议书2007/526/EC，这些法规已通过西班牙皇家法令Real Decreto 1201/2005纳入西班牙法律体系。
1. 获取房室管和/或流出道（改编自 Xiao 等人25）
- 下午进行雌性个体的杂交实验 mTmG 和雄性 VE-钙黏蛋白-Cre-ERT/+.
- 次日早晨，检查阴道栓。若发现阴道栓，记为半天（E0.5）。根据实验需求，计数8天或9天。
- 在解剖前24小时，通过口服灌胃向妊娠雌性小鼠给予50 µL用玉米油稀释的5 mg/mL 4-OH-他莫昔芬。
注意：该剂量将诱导有限程度的CRE介导的重组，可通过GFP阳性克隆的存在来检测。每批新的4-OH-他莫昔芬均需确定合适的剂量。 - 在E8.5或E9.5时通过颈椎脱位处死妊娠雌鼠。
- 使用剪刀打开孕鼠腹部，用剪刀和精细镊子取出含有胚胎的子宫。<....
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结果
使用本方案生成的数据表明，可以对房室管（AVC）的心内膜进行en face成像。第一个目标是在细胞分辨率水平上分析瓣膜形成过程中心内膜细胞的形态（图1）。为了在E9.5阶段突出显示单个心内膜细胞，我们使用了两种转基因小鼠品系。（1）ROSAmT/mG是一种双色荧光Cre报告等位基因（tdTomato/mT和EGFP/mG），其荧光信号位于细胞膜。在无Cre介导激活的情况下，该转基因表达tdTomato（mT）；而在Cre介导的激活后，特定细胞及其克隆后代中的tdTomato表达被EGFP荧光表达（mG）所取代27。（2）Cdh5CreERT2/+小鼠品系在血管内皮钙黏蛋白启动子（Cdh5）的调控下表达他莫昔芬可诱导的CRE重组酶（CreERT2），该启动子在胚胎发育阶段于血管内皮和心内膜中表达28.......
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讨论
心内膜是一层上皮单细胞层，覆盖整个胚胎心脏管的内表面。在瓣膜发育过程中，未来形成瓣膜区域的心内膜细胞经历上皮-间质转化（EMT），从而改变其细胞骨架结构，从心内膜脱离并迁移到心胶质中。我们及其他研究者通过分析E8.5和E9.5胚胎心脏的横切面，获得了有关瓣膜发育的相关数据，在这些切面中，心内膜表现为一排细胞6,8,24,32。该方法使得研究人员能够分析参与瓣膜发育的信号通路及其他分子的表达情况，但无法分析前瓣膜区心内膜的空间特征。
AVC 或 OFT 外植体主要用于在三维胶原凝胶上研究转化中的内皮细胞。外植体适用于上皮-间质转化的定量分析、转化能力的评估，或在培养数天后测试药物效果6,7,<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了来自 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助的项目 PID2019-104776RB-I00 和 CB16/11/00399（CIBER CV）对 J. L. P. 的资助。J.G.-B. 获得了马德里自治区人才引进计划（2020-5ª/BMD-19729）的资助。T.G.-C. 获得了大学教师培训资助（FPU18/01054）的支持。我们感谢由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 和欧洲区域发展基金（FEDER）共同资助的 CNIC 显微镜与动态成像单元、CNIC、ICTS-ReDib（“"迈向欧洲之路"，项目编号 #ICTS-2018-04-CNIC-16）。我们还感谢 A. Galicia 和 L. Méndez 在小鼠饲养方面提供的帮助。本出版物的部分费用由欧洲区域发展基金资助。国家心血管研究中心（CNIC）由 ISCIII、MCIN 和 Pro CNIC 基金会支持，并被授予塞韦罗·奥乔亚卓越中心（grant CEX2020-001041-S），该中心由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | 用水稀释至4% |
| 抗GFP抗体 | Aves Labs | FGP-1010 | |
| 抗VECadherin抗体 | BD Biosciences | 555289 | |
| 山羊抗鸡IgG，Alexa Fluor 488标记 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| 山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 647标记 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Superfrost PLUS载玻片 | VWR | 631-0108 | 25 mm × 75 mm × 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1000-10 |
参考文献
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbou....
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重印与许可
