En Face 小鼠胚胎心内膜垫平面形态发生分析的制备

摘要

传统上，小鼠胚胎瓣膜原基的内皮细胞层通常通过横断面、冠状面或矢状面切片进行分析。我们提出了一种新的方法，可在瓣膜形成区域对内皮细胞层进行en face（表面）二维成像，从而实现对瓣膜发育过程中内皮细胞平面极性及细胞重排的分析。

摘要

研究哺乳动物心脏发育过程中细胞与分子机制对于理解人类先天性心脏病至关重要。原始心脏瓣膜的发育涉及心房心室管（AVC）和心室流出道（OFT）区域的心内膜细胞在局部诱导性心肌和心内膜信号作用下发生上皮-间质转化（EMT）。当这些细胞脱离并侵入位于心内膜与心肌之间的细胞外基质（即心胶质）后，原始心内膜垫（EC）即形成。此过程意味着心内膜必须填补脱离细胞所留下的空隙，并沿某一轴向进行汇聚（变窄）或延伸（延长）以完成自身重组。目前研究表明，平面细胞极性（PCP）通路参与调控该过程中相关因子的亚细胞定位。传统上，心脏瓣膜发育的初始阶段主要通过胚胎心脏的横切面或体外培养模型进行研究。 离体 在胶原凝胶上培养的房室管（AVC）或心动脉球（OFT）外植体。这些方法可用于分析细胞的顶-基底极性，但无法用于研究上皮细胞平面内的细胞行为或迁移细胞的形态学变化。本文展示了一种实验方法，可将瓣膜发生区域的内皮细胞层以平面细胞群的形式进行可视化观察。该实验方法为研究心动脉球和房室管内皮细胞在瓣膜发育过程中平面细胞极性（PCP）、平面拓扑结构及细胞间通讯提供了可能。解析参与心脏瓣膜形态发生的新型细胞机制，有助于理解与内皮垫发育缺陷相关的先天性心脏病。

引言

心脏是哺乳动物胚胎中第一个具有功能的器官。在小鼠胚胎发育约第7.5天（E7.5）时，位于腹侧的双侧心脏前体中胚层细胞形成心月结构¹。心月结构包含两类心脏前体细胞，分别生成心肌层和心内膜²。约在E8.0时，心脏前体细胞在中线处融合，形成原始心管，其由两层上皮组织构成：外层为心肌层，内层为心内膜，后者是一种特化内皮，两者之间由一种名为心胶质的细胞外基质分隔。随后在E8.5时，心管发生向右弯曲的环化过程。环化后的心脏具有不同的解剖区域，各区域具有特定的分子特征，例如流出道（OFT）、心室以及房室管（AVC）³。尽管最初心管通过细胞增殖在其流入端不断扩张⁴，但在E9.5时，强烈的心脏细胞增殖导致心腔膨出，并形成小梁网络结构⁵。瓣膜的形成发生在房室管（未来形成二尖瓣和三尖瓣）以及流出道（未来形成主动脉瓣和肺动脉瓣）。

心内膜在瓣膜发育过程中发挥着关键作用。心内膜细胞在房室管（AVC）和动脉干（OFT）中经历上皮-间质转化（EMT），形成心内膜垫，这一结构在瓣膜发育起始时出现。不同的信号通路可激活该过程；在小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5），心肌来源的BMP2可激活心内膜中的NOTCH信号，进而通过激活TGFβ2和SNAIL（SNAI1）促进AVC和OFT区域心内膜细胞的侵袭性EMT。SNAIL可直接抑制血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）的表达，而VE-cadherin是黏附连接（AJs）的一种跨膜组分^6,7,8。在OFT中，Fgf8和Bmp4激活心内膜以启动EMT过程，而它们的表达受NOTCH信号调控^9,10,11,12。

上皮-间质转化（EMT）的进程涉及细胞动态变化，包括细胞形态改变、与邻近细胞间连接的断裂与重建、脱离上皮层以及开始迁移¹³。这些变化包括黏着连接（AJ）的重塑和逐步解体^14,15、平面细胞极性（PCP）信号通路、顶-基底极性（ABP）的丧失、顶端收缩以及细胞骨架的重组^16,17。ABP是指细胞内蛋白质沿前-后轴方向的分布。在心脏发育过程中，心肌细胞中ABP的调控对心室的发育至关重要¹⁸。PCP是指细胞内蛋白质在组织平面内的极性分布，可调控细胞的空间排布；具有稳定几何结构的上皮由六边形细胞构成，其顶点处仅汇聚三个细胞^19,20,21,22。在上皮形态发生过程中，不同的细胞过程（如细胞分裂、邻近细胞交换或脱离）会导致汇聚于同一顶点的细胞数量增加，以及单个细胞所拥有的邻近细胞数量增多²²。这些与PCP相关的细胞行为可受到不同信号通路、肌动蛋白动态变化或细胞内运输过程的调控²³。

研究小鼠瓣膜发育所获得的数据来自E8.5和E9.5胚胎心脏的横断面、冠状面或矢状面切片，其中内皮细胞层显示为一条细胞线，而非细胞区域——实际上内皮层覆盖了心脏管的整个内表面²⁴。胚胎切片无法实现对小鼠胚胎内心内膜细胞平面细胞极性（PCP）的分析。我们提出的新实验方法可实现内皮细胞分布、黏附连接（AJ）各向异性以及单个细胞形态的分析，如代表性结果所示。此类数据是进行PCP分析所必需的，还需结合本报告未展示的其他与PCP相关分子的描述。通过整体免疫荧光染色、特定的样品制备方法以及使用基因修饰小鼠，可在小鼠瓣膜发育起始阶段对其内皮层进行平面极性分析。

方案

动物实验已获国家心血管研究中心（Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, CNIC）动物实验伦理委员会以及马德里自治区（编号：PROEX 155.7/20）批准。所有动物实验操作均符合欧盟关于实验和科学用途动物保护的指令2010/63/EU和建议书2007/526/EC，这些法规已通过西班牙皇家法令Real Decreto 1201/2005纳入西班牙法律体系。

1. 获取房室管和/或流出道（改编自 Xiao 等人²⁵）

1. 下午进行雌性个体的杂交实验 mTmG 和雄性 VE-钙黏蛋白-Cre-ERT/+.
2. 次日早晨，检查阴道栓。若发现阴道栓，记为半天（E0.5）。根据实验需求，计数8天或9天。
3. 在解剖前24小时，通过口服灌胃向妊娠雌性小鼠给予50 µL用玉米油稀释的5 mg/mL 4-OH-他莫昔芬。
   ​注意：该剂量将诱导有限程度的CRE介导的重组，可通过GFP阳性克隆的存在来检测。每批新的4-OH-他莫昔芬均需确定合适的剂量。
4. 在E8.5或E9.5时通过颈椎脱位处死妊娠雌鼠。
5. 使用剪刀打开孕鼠腹部，用剪刀和精细镊子取出含有胚胎的子宫。
6. 将子宫置于含有冰冻的含0.1%吐温-20（PBT）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
7. 在解剖显微镜下用精细镊子将各个蜕膜从子宫中分离取出。
8. 使用精细镊子在蜕膜的白色部分做切口，此处为胚胎所在位置，轻柔取出胚胎，避免牵拉，并用剪去尖端的P1000移液枪将胚胎转移至含有新鲜PBT的新培养皿中，移液枪头剪裁后的直径应足够大，以确保胚胎顺利通过而不破损。
9. 用于基因分型时，取一小块卵黄囊（0.5 mm）²）或尾部一段组织（从尾端开始，向头部方向数5到10个体节），并在100 µL适当缓冲液中进行消化。
10. 在通风橱内，将胚胎转移至含有冰上预冷的4%多聚甲醛（4% PFA）的无菌过滤PBS溶液中，置于微量离心管（2 mL）内，于4 °C条件下固定。在4 °C下使用旋转仪固定胚胎，时间从2小时至过夜（O/N）。
11. 在通风橱内，从微量离心管中移除4% PFA固定液，避免触碰胚胎。将废弃的PFA液体倒入适当的废液容器中。
12. 将胚胎在冷的PBT中于室温（RT）下洗涤5次，每次10分钟。
13. 使用精细镊子取出心脏，并转移至新的1.5 mL微量离心管中 用新鲜的PBT。

2. 小鼠胚胎心脏的全组织免疫荧光染色

1. 用 PBSTr（含 0.4% Triton X-100 的 PBS）替换 PBT，于室温在轨道摇床上孵育样本，每次 5 分钟，共洗 3 次。
2. 用封闭液（含 10% 热灭活牛血清的 PBSTr）替换 PBSTr，于 4 °C 在轨道摇床上孵育 2 小时至过夜。
3. 将封闭液更换为含有适当浓度一抗的封闭液（对于抗 GFP 或抗 VE-Cadherin 抗体，使用 1:1000 稀释度），于 4 °C 在轨道摇床上过夜孵育。
4. 在 4 °C 过夜孵育后，于室温在轨道摇床上继续孵育 1.5 小时。此步骤对提高信噪比至关重要。
5. 回收一抗溶液并保存于 4 °C，可用于后续最多三次实验（为最佳保存效果，加入叠氮化钠至终浓度为 0.02%）。
6. 用 PBSTr 洗涤胚胎 3 次，每次 3 分钟。
7. 在 4 °C 下，于轨道摇床上用 PBSTr 洗涤胚胎 3 次，每次 30 分钟。
8. 最后一次洗涤后，加入 1 mL 含有 1:1000 稀释的荧光标记二抗（针对一抗宿主物种）的封闭液，同时加入 1:3000 稀释的 DAPI，于 4 °C 在轨道摇床上过夜孵育胚胎。
9. 在 4 °C 过夜孵育后，于室温在轨道摇床上继续孵育 1.5 小时。此步骤对提高信噪比至关重要。
10. 用 PBSTr 洗涤胚胎 3 次，每次 3 分钟。
11. 在室温下，于轨道摇床上用 PBSTr 洗涤胚胎 3 至 5 次，每次 30 分钟。

3. 小鼠胚胎房室管或心球的包埋

1. 将心脏置于含有 PBS 的培养皿（35 mm）中。
2. 使用钨丝和精细镊子分离房室管（AVC）或动脉干（OFT），并沿纵向切开²⁶。
3. 准备盖玻片（22 mm × 22 mm）、载玻片（60 mm × 24 mm）、镊子、P200 移液枪及配套枪头、纸巾，以及不含 DAPI 的水性甘油封片剂（用于荧光成像）。
4. 参照 Xiao, C. et al.²⁵ 的方法，在载玻片上粘贴两条胶带，间距为 0.3–0.6 cm，以形成一个三维空间，使样品在不被压扁的情况下保持原有形态。
5. 使用剪去尖端的 P200 枪头，以最小体积缓冲液将样品小心滴加至胶带之间的载玻片上。使用解剖显微镜以提高操作准确性。
6. 用精细镊子将样品放置于载玻片上，确保其内皮层朝上（心肌层朝下贴附于载玻片）。
7. 用纸巾吸除多余的 PBS（避免接触样品），然后在室温下干燥 1–2 分钟，使样品牢固粘附于载玻片。
8. 在组织上加入 40 µL 水性封片剂。
9. 将盖玻片置于两条胶带之上，并用针或镊子缓慢放下，使其覆盖组织。避免产生气泡。
10. 在盖玻片的每个顶角处滴加一滴指甲油，以密封盖玻片。
11. 待指甲油干燥后，用吸水纸巾轻轻擦去盖玻片边缘多余的封片剂，注意避免移动盖玻片。
12. 沿盖玻片四周边缘涂抹指甲油，彻底密封，防止封片剂蒸发。
13. 使用正置或倒置共聚焦显微镜，以 10× 物镜获取整体视野图像，以 63× 物镜结合 3× 放大倍数获取高分辨率细节图像。

结果

使用本方案生成的数据表明，可以对房室管（AVC）的心内膜进行en face成像。第一个目标是在细胞分辨率水平上分析瓣膜形成过程中心内膜细胞的形态（图1）。为了在E9.5阶段突出显示单个心内膜细胞，我们使用了两种转基因小鼠品系。（1）ROSA^mT/mG是一种双色荧光Cre报告等位基因（tdTomato/mT和EGFP/mG），其荧光信号位于细胞膜。在无Cre介导激活的情况下，该转基因表达tdTomato（mT）；而在Cre介导的激活后，特定细胞及其克隆后代中的tdTomato表达被EGFP荧光表达（mG）所取代²⁷。（2）Cdh5CreERT2/+小鼠品系在血管内皮钙黏蛋白启动子（Cdh5）的调控下表达他莫昔芬可诱导的CRE重组酶（CreERT2），该启动子在胚胎发育阶段于血管内皮和心内膜中表达^28...

讨论

心内膜是一层上皮单细胞层，覆盖整个胚胎心脏管的内表面。在瓣膜发育过程中，未来形成瓣膜区域的心内膜细胞经历上皮-间质转化（EMT），从而改变其细胞骨架结构，从心内膜脱离并迁移到心胶质中。我们及其他研究者通过分析E8.5和E9.5胚胎心脏的横切面，获得了有关瓣膜发育的相关数据，在这些切面中，心内膜表现为一排细胞^6,8,24,32。该方法使得研究人员能够分析参与瓣膜发育的信号通路及其他分子的表达情况，但无法分析前瓣膜区心内膜的空间特征。

AVC 或 OFT 外植体主要用于在三维胶原凝胶上研究转化中的内皮细胞。外植体适用于上皮-间质转化的定量分析、转化能力的评估，或在培养数天后测试药物效果^6,7,<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-羟基他莫昔芬	Sigma Aldrich	H-6278
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	157-10	用水稀释至4%
抗GFP抗体	Aves Labs	FGP-1010
抗VECadherin抗体	BD Biosciences	555289
山羊抗鸡IgG，Alexa Fluor 488标记	Thermo Fisher Scientific	A-11039
山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 647标记	Jackson ImmunoResearch	115-605-174
DAPI	AppliChem	A4099,0005
Superfrost PLUS载玻片	VWR	631-0108	25 mm × 75 mm × 1.0 mm
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Tween 20	A4974,0500	AppliChem
Vectashield封片剂	Vector Laboratories	H-1000-10