儿童传染性单核细胞增多症外周血样本中免疫细胞亚群的分离

摘要

我们介绍一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选的方法，用于分离和分析外周血单个核细胞中的特定免疫细胞亚群（单核细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞和自然杀伤细胞）。利用该方法，可对磁性标记和荧光标记的细胞进行纯化与分析。

摘要

传染性单核细胞增多症（IM）是一种急性综合征，主要与初次感染爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）相关。–EB病毒（EBV）感染。主要临床症状包括不规则发热、淋巴结肿大以及外周血淋巴细胞显著增多。传染性单核细胞增多症（IM）的发病机制尚不明确，目前尚无有效的治疗方法，主要采取对症治疗。EBV免疫生物学中的主要问题是：为何只有一小部分感染者出现严重临床症状，甚至发展为EBV相关恶性肿瘤，而大多数个体终身无症状携带该病毒？

由于B细胞表面表达EB病毒受体，因此在传染性单核细胞增多症（IM）中首先被EB病毒感染。自然杀伤（NK）细胞是一类具有细胞毒性的先天性淋巴细胞，在清除EB病毒感染细胞过程中发挥重要作用。在急性EB病毒感染期间，CD4⁺ T细胞的比例下降，而CD8⁺ T细胞的比例则显著扩增，且CD8⁺ T细胞的持续存在对于终身控制IM至关重要。这些免疫细胞在IM中发挥关键作用，其功能需分别加以鉴定。为此，首先使用CD14磁珠、分离柱和磁力分离器，从IM患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞。

剩余的外周血单个核细胞使用别藻蓝蛋白/花青素5.5（PerCP/Cy5.5）标记的抗CD3抗体、别藻蓝蛋白/花青素7（APC/Cy7）标记的抗CD4抗体、藻红蛋白（PE）标记的抗CD8抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD19抗体、APC标记的抗CD56抗体以及APC标记的抗CD16抗体进行染色，随后利用流式细胞仪分选CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞和NK细胞。此外，对这五个亚群进行了转录组测序，以探究其在传染性单核细胞增多症（IM）中的功能及致病机制。

引言

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是一种γ-疱疹病毒，也称为人类疱疹病毒4型，在人类中广泛存在，可在超过90%的成年人群中建立终身潜伏感染¹。大多数EBV原发性感染发生在儿童期和青春期，其中部分患者表现为传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis, IM）²，其特征性免疫病理改变包括血液中CD8⁺ T细胞介导的免疫激活反应以及口咽部EBV感染B细胞的一过性增殖³。IM病程通常持续2–6周，多数患者预后良好⁴。然而，部分个体可出现持续性或反复发作的类似IM症状，伴有较高的发病率和死亡率，此类情况被归类为慢性活动性EB病毒感染（chronic active EBV infection, CAEBV）⁵。此外，EBV是一种重要的致癌病毒，与多种恶性肿瘤密切相关，包括上皮源性和淋巴组织源性恶性肿瘤，如鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤（HL）以及T/NK细胞淋巴瘤⁶。尽管EBV已被研究超过50年，但其致病机制以及诱导淋巴细胞增殖的具体机制尚未完全阐明。

多项研究已通过转录组测序探讨了EBV感染免疫病理学的分子特征。Zhong等对患有传染性单核细胞增多症（IM）或慢性活动性EBV感染（CAEBV）的中国儿童外周血单个核细胞（PBMCs）进行了全转录组分析，发现CD8⁺ T细胞扩增主要出现在IM组⁷，表明 CD8⁺ T细胞可能在IM中发挥重要作用。类似地，另一项研究发现EBV特异性细胞毒性T细胞和CD19⁺ B细胞和更高比例的CD8⁺ 由原发性EBV感染引起传染性单核细胞增多症的患者，其T细胞水平高于由EBV再激活及其他病原体引起的传染性单核细胞增多症患者⁸B细胞因表面表达EBV受体而首先参与传染性单核细胞增多症（IM）。Al Tabaa等发现，B细胞发生多克隆活化并分化为浆母细胞（CD19⁺CD27⁺ 和 CD20⁻，以及 CD138⁻ 细胞）和浆细胞（CD19⁺CD27⁺ 和 CD20⁻，以及 CD138⁺) 在IM期间⁹此外，Zhong 等人发现 单核细胞标志物CD14和CD64在慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）中呈上调，提示单核细胞可能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和过度活跃的吞噬作用，在CAEBV的细胞免疫应答中发挥重要作用⁷. Alka 等人对磁珠分选的CD56^暗淡 CD16⁺ 来自四名IM或HL患者的NK细胞，发现IM和HL患者的NK细胞中先天免疫和趋化因子信号通路相关基因均下调，这可能是NK细胞低反应性的原因¹⁰此外，Greenough 等人分析了分选后的 CD8⁺ 来自10份传染性单核细胞增多症（IM）患者外周血单个核细胞（PBMCs）的T细胞。他们报道，CD8的很大一部分⁺ IM中的T细胞具有病毒特异性，处于活化状态，正在进行分裂，并已准备发挥效应功能。¹¹T细胞介导的EBV特异性应答和NK细胞介导的非特异性应答在原发性EBV感染过程中均发挥重要作用。然而，这些研究仅分析了免疫细胞混合物的转录组结果，或仅针对某一淋巴细胞亚群，尚不足以全面比较处于相同疾病状态的传染性单核细胞增多症患儿中不同免疫细胞亚群的分子特征与功能。

本文介绍了一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于分离和分析外周血单个核细胞（PBMC）中特定的免疫细胞亚群（单核细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞和NK细胞）。利用该方法，可通过磁力分离器和FACS纯化带有磁性标记和荧光标记的细胞，或通过流式细胞术进行分析。可从纯化的细胞中提取RNA用于转录组测序。该方法将有助于表征传染性单核细胞增多症（IM）患者在相同疾病状态下不同免疫细胞的基因表达，从而加深我们对EBV感染免疫病理机制的理解。

方案

采集传染性单核细胞增多症患者（n = 3）、健康EBV携带者（n = 3）以及EBV未感染儿童（n = 3）的血液样本。志愿者来自首都医科大学附属北京儿童医院，所有研究均获得伦理批准。伦理批准由首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会授予（批准编号：[2021]-E-056-Y）。由于本研究仅使用临床检测后剩余的样本，因此豁免了患者的知情同意。所有数据均经过彻底去标识化和匿名化处理，以保护患者隐私。

1. 从外周血中分离PBMCs

1. 采用标准静脉穿刺法，从传染性单核细胞增多症（IM）患者体内采集新鲜外周血（2 mL）至含K₃EDTA的采血管中。
   注意：操作过程需迅速，以维持细胞活性。
2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将外周血稀释至原体积的两倍，然后缓慢叠加于15 mL离心管中的人淋巴细胞分离液（密度：1.077 ± 0.001 g/mL）之上。
   注意：血液、PBS与分离液的体积比为1:1:1。将血液缓慢加至分离液液面上方，并立即离心，防止血液沉入分离液中。
3. 在室温下以800 × g 离心20分钟。吸取中间层（富含PBMCs）转移至另一支15 mL离心管中。
   注意：离心后，离心管底部为红细胞，中间层为分离液，上层为血浆，血浆层与分离液层之间即为PBMC层（包括淋巴细胞和单核细胞）。
4. 用10 mL PBS洗涤PBMCs，在室温下以800 × g 离心20分钟，小心弃去上清液。
5. 重复洗涤与离心步骤（步骤1.4）2次。用1 mL PBS将PBMCs重悬于1.5 mL微量离心管中，并使用基于台盼蓝染色的自动细胞计数仪进行细胞计数。

2. CD14的分离 ⁺ 使用CD14磁珠从PBMCs中分离单核细胞

1. 配制含有0.5%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA的PBS缓冲液（pH 7.2）。将缓冲液保持低温（2−8 °C）。
   注意：使用前需对缓冲液进行脱气处理，以防气泡堵塞层析柱。保持细胞低温，以防止细胞表面抗体发生帽化及非特异性细胞标记。
2. 将PBMC在室温下以300 × g 离心10分钟。小心弃去上清液。用80 µL缓冲液重悬细胞。向细胞悬液中加入20 µL CD14磁珠。
   注意：若PBMC数量 ≤10⁷，使用上述指定体积；若PBMC数量 >10⁷，则所有试剂体积和总体积应按比例增加。
3. 在1.5 mL微量离心管中充分混匀CD14磁珠与细胞，于4 °C冰箱中孵育15分钟。用1 mL缓冲液洗涤PBMC，室温下以300 × g 离心10分钟。完全弃去上清液。用500 µL缓冲液重悬细胞。
   注意：若PBMC数量 ≤10⁸，使用上述指定体积；若PBMC数量 >10⁸，则缓冲液体积应按比例增加。
4. 使用层析柱进行磁性分离：
   1. 将层析柱置于磁珠分选器上，用3 mL缓冲液洗涤层析柱。将细胞悬液（来自步骤2.3）加入层析柱中。
   2. 收集穿过层析柱的未标记细胞至15 mL离心管中，并用3 mL缓冲液洗涤层析柱。重复洗涤3次，每次3 mL。将全部流出液收集至同一15 mL离心管中。
   3. 将层析柱转移至新的15 mL离心管中。向层析柱中加入5 mL缓冲液。用力将推杆插入层析柱，立即冲洗出磁性标记的细胞至15 mL离心管中。
   4. 将磁性标记的细胞以300 × g 离心5分钟，弃去上清液。在1.5 mL微量离心管中用500 µL PBS重悬细胞，用于后续转录组测序。

3. 通过荧光标记抗体染色和流式细胞术从外周血单个核细胞中分离淋巴细胞亚群

1. 将未标记的细胞（步骤 2.4.2）在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清液。在 1.5 mL 微量离心管中，用 100 µL PBS 重悬细胞。
2. 向 100 µL 细胞悬液中加入每种标记抗体（CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD56）各 2 µL（抗体的体积及偶联荧光染料信息见表 1），冰上孵育 30 分钟，并避光。
3. 加入 1 mL PBS，于室温下以 300 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞两次。在 1.5 mL 微量离心管中用 500 µL PBS 重悬细胞。在流式细胞分选仪上检测前，轻轻涡旋混匀细胞悬液。

4. 流式细胞术参数设置

1. 根据需要取100 µL细胞悬液（见第1部分）至1.5 mL微量离心管中，分别设置阴性对照样本、CD3单染样本、CD4单染样本、CD8单染样本、CD19单染样本以及CD56/CD16染色样本。
2. 每100 µL细胞悬液中加入2 µL相应的荧光标记抗体，涡旋混匀。冰上避光孵育30分钟。300 × g离心5分钟 g 吸弃上清液。用500 µL PBS重悬沉淀，并涡旋振荡。
3. 使用荧光微球校准分选液流并延迟液滴，步骤如下：
   1. 打开细胞分选系统，运行 开机程序，安装 85 µm喷嘴，并打开 分选流. 设置 分选电压 到 4,500 V，以及 频率 到 47.
   2. 主要通过调整参数来调节 主流液滴断裂点 和 液滴延迟 根据制造商的说明¹². 设置第一个液滴断点位置（Drop1）至 275，且 间隔 到 8 在 断裂 窗口。打开 最佳点 自动分选模式，以允许流式细胞仪自动确定 液滴振幅值 以稳定液流。
   3. 调节 液滴延迟 到 30.31 在 侧流 通过加载荧光微珠来校准窗口，确保微珠产生侧向流动偏转 >99% 的初始或精细调节模式。
4. 参考所示的设门策略 图1 进行如下设门操作：
   1. 使用前向散射面积（FSC-A）/侧向散射面积（SSC-A）散点图，圈选 多边形门（P1） 以鉴定 完整淋巴细胞 群体
   2. 使用FSC-A/FSC-高度（FSC-H）散点图，绘制多边形门（P2) 以鉴定 单个细胞 并排除双联体（doublets）图1A).
   3. 使用CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A散点图，绘制矩形门（P3) 以选择 CD3⁺ T细胞 和 CD19⁺ B细胞 (图1A，B).
   4. 使用CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A点图，绘制一个 矩形门 选择 CD4⁺ T细胞 和 CD8⁺ T细胞 （分别对这些标记物具有高荧光强度的细胞）
   5. 使用CD56/CD16 APC-A/SSC-A散点图，圈选 矩形门控 选择 CD56⁺/CD16⁺ NK细胞 (图1C).
5. 使用阴性对照样本调整仪器参数：
   1. 将阴性对照管安装到加载端口，然后单击 加载 在 数据采集仪表盘. 选择 细胞仪设置 在软件中。
   2. 在检查器窗口中，单击 参数 选项卡，并调整FSC、SSC和不同荧光染料的电压； FSC：231，SSC：512，PE：549，APC：615，APC-Cyanine 7：824，FITC：555，PerCP-Cyanine 5.5：663.
6. 使用单染样本调节补偿¹³.
   1. 依次将单染色管上机至流式细胞仪并选择 细胞仪设置 在软件中。单击 补偿 按 Tab 键以调整补偿。
      ​注意：流式细胞术的补偿参照如图所示 表2.

5. 细胞分选与数据收集  通过 流式细胞术

1. 在将试管放入流式细胞仪前，轻轻涡旋混匀细胞悬液（按第1–3节分离的PBMCs），以重悬细胞。其余试管保持在冰上。
2. 向四个收集用流式管中各加入200 µL胎牛血清（FBS），以防止分选后的细胞黏附于管壁，并将这些试管放入流式细胞仪的收集室中。
3. 从传染性单核细胞增多症（IM）患者样本中，分别收集CD3⁺CD4⁺ T细胞、CD3⁺CD8⁺ T细胞、CD3⁻CD19⁺ B细胞以及CD3⁻CD56⁺/CD16⁺ NK细胞至四个流式管中（图2A）。
4. 将分离的细胞以300 × g 离心5分钟，弃去上清液。向细胞沉淀中加入200 µL RNA提取试剂，用于转录组测序。
5. 按照上述步骤，分别分离健康EBV携带者和EBV未感染儿童样本中的免疫细胞亚群（图2B、C）。

结果

门控策略参考
用于分选四种淋巴细胞亚群的门控策略如图1所示。简而言之，首先在显示颗粒度（SSC-A）与细胞大小（FSC-A）的散点图上选取出淋巴细胞（P1）。接着，在显示细胞大小（FSC-A）与前向散射光（FSC-H）的散点图上选出单细胞（P2），排除双联体细胞。CD3⁺ T细胞和CD19⁺ B细胞在显示CD3 PerCP-Cy5.5-A与CD19 FITC-A的散点图上分别进行选择（图1B）。CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞则从P3门中，在显示CD8 PE-A与CD4 APC-Cy7-A的散点图上分别选出。CD16⁺/CD56⁺ NK细胞从P4门中，在显示CD56/CD16 APC-A与SSC-A的散点图上进行选择（图1C）。

通...

讨论

本方案提供了一种高效分选外周血免疫细胞亚群的方法。本研究选取传染性单核细胞增多症（IM）患者、健康EBV携带者以及EBV未感染儿童的静脉血样本作为研究对象。本工作主要利用IM患者的外周血，通过多色流式细胞术分析并确定不同细胞亚群的比例。转录组测序主要用于检测和分析某一淋巴细胞亚群，但不足以对处于相同疾病状态的IM患儿不同免疫细胞亚群的分子特征和功能进行系统性与特异性的全面比较。因此，从外周血中分选出多种类型的细胞，并对其进行转录组测序以比较这些免疫细胞在基因表达及功能上的差异，可为研究IM的发病机制提供重要的数据支持。

FACS 分选的额外优势在于能够处理活的、分选后的细胞，用于进一步的 体外 或 体内 实验¹⁴。保持细胞活力对于后续实验至关重要。我们已优化了分选步骤以提高本方案中的细胞活力——实验操作均在冰上或4 °C冰箱中进行。适当的离心速度和时间对于细胞分离也至关重要。分选后细胞的得率是本方法的主要限制因素，而在分选过程中使用FBS包被的试管可显著减少细胞黏附于管壁造成的损失。为FACS分选仪...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 抗人 CD16	Biolegend	302012	荧光抗体
APC 抗人 CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	荧光抗体
APC/Cyanine7 抗人 CD4	Biolegend	344616	荧光抗体
自动细胞计数仪	BIO RAD	TC20	细胞计数
BD FACSAria 荧光激活 流式 细胞 分选仪-细胞计数仪（BD FACSAria II）	贝克顿·迪金森公司	644832	细胞分选
CD14 微珠，人源	Miltenyi Biotec	130-050-201	微珠
细胞计数载玻片	BIO RAD	1450016	细胞计数
离心管	Falcon	35209715	15 mL 离心管
EDTA（≥99%，BioPremium）	Beyotime	ST1303	EDTA
乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管	贝克顿·迪金森公司	367862	EDTA 抗凝管
FITC 抗人 CD19	Biolegend	302206	荧光抗体
Gibco 胎牛血清	赛默飞世尔科技	16000-044	胎牛血清
高速 离心机	Sigma	3K15	用于 15 mL 离心管的细胞离心
高速 离心机	Eppendorf	5424R	用于 1.5 mL Eppendorf（EP）管的细胞离心
人淋巴细胞分离液	达科为	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS 分离 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	分离 柱
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL 微量离心管
MidiMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-302	磁珠分离器
PE 抗人 CD8	Biolegend	344706	荧光抗体
PerCP/Cyanine5.5 抗人 CD3	Biolegend	344808	荧光抗体
磷酸盐缓冲液（PBS）	BI	02-024-1ACS	PBS
聚苯乙烯圆底管	Falcon	352235	用于流式细胞仪的 5 mL 管
TRIzol 试剂	Ambion	15596024	裂解细胞用于 RNA 提取
台盼蓝染色细胞活力检测试剂盒	Beyotime	C0011	台盼蓝染色