儿童传染性单核细胞增多症外周血样本中免疫细胞亚群的分离

摘要

我们介绍一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选的方法，用于分离和分析外周血单个核细胞中的特定免疫细胞亚群（单核细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞和自然杀伤细胞）。利用该方法，可对磁性标记和荧光标记的细胞进行纯化与分析。

摘要

传染性单核细胞增多症（IM）是一种急性综合征，主要与初次感染爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）相关。–EB病毒（EBV）感染。主要临床症状包括不规则发热、淋巴结肿大以及外周血淋巴细胞显著增多。传染性单核细胞增多症（IM）的发病机制尚不明确，目前尚无有效的治疗方法，主要采取对症治疗。EBV免疫生物学中的主要问题是：为何只有一小部分感染者出现严重临床症状，甚至发展为EBV相关恶性肿瘤，而大多数个体终身无症状携带该病毒？

由于B细胞表面表达EB病毒受体，因此在传染性单核细胞增多症（IM）中首先被EB病毒感染。自然杀伤（NK）细胞是一类具有细胞毒性的先天性淋巴细胞，在清除EB病毒感染细胞过程中发挥重要作用。在急性EB病毒感染期间，CD4⁺ T细胞的比例下降，而CD8⁺ T细胞的比例则显著扩增，且CD8⁺ T细胞的持续存在对于终身控制IM至关重要。这些免疫细胞在IM中发挥关键作用，其功能需分别加以鉴定。为此，首先使用CD14磁珠、分离柱和磁力分离器，从IM患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞。

剩余的外周血单个核细胞使用别藻蓝蛋白/花青素5.5（PerCP/Cy5.5）标记的抗CD3抗体、别藻蓝蛋白/花青素7（APC/Cy7）标记的抗CD4抗体、藻红蛋白（PE）标记的抗CD8抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD19抗体、APC标记的抗CD56抗体以及APC标记的抗CD16抗体进行染色，随后利用流式细胞仪分选CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞和NK细胞。此外，对这五个亚群进行了转录组测序，以探究其在传染性单核细胞增多症（IM）中的功能及致病机制。

引言

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是一种γ-疱疹病毒，也称为人类疱疹病毒4型，在人类中广泛存在，可在超过90%的成年人群中建立终身潜伏感染¹。大多数EBV原发性感染发生在儿童期和青春期，其中部分患者表现为传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis, IM）²，其特征性免疫病理改变包括血液中CD8⁺ T细胞介导的免疫激活反应以及口咽部EBV感染B细胞的一过性增殖³。IM病程通常持续2–6周，多数患者预后良好⁴。然而，部分个体可出现持续性或反复发作的类似IM症状，伴有较高的发病率和死亡率，此类情况被归类为慢性活动性EB病毒感染（chronic active EBV infection, CAEBV）⁵。此外，EBV是一种重要的致癌病毒，与多种恶性肿瘤密切相关，包括上皮源性和淋巴组织源性恶性肿瘤，如鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤（HL）以及T/NK细胞淋巴瘤⁶。尽管EBV已被研究超过50年，但其致病机制以及诱导淋巴细胞增殖的具体机制尚未完全阐明。

多项研究已通过转录组测序探讨了EBV感染免疫病理学的分子特征。Zhong等对....

方案

采集传染性单核细胞增多症患者（n = 3）、健康EBV携带者（n = 3）以及EBV未感染儿童（n = 3）的血液样本。志愿者来自首都医科大学附属北京儿童医院，所有研究均获得伦理批准。伦理批准由首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会授予（批准编号：[2021]-E-056-Y）。由于本研究仅使用临床检测后剩余的样本，因此豁免了患者的知情同意。所有数据均经过彻底去标识化和匿名化处理，以保护患者隐私。

1. 从外周血中分离PBMCs

1. 采用标准静脉穿刺法，从传染性单核细胞增多症（IM）患者体内采集新鲜外周血（2 mL）至含K₃EDTA的采血管中。
   注意：操作过程需迅速，以维持细胞活性。
2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将外周血稀释至原体积的两倍，然后缓慢叠加于15 mL离心管中的人淋巴细胞分离液（密度：1.077 ± 0.001 g/mL）之上。
   注意：血液、PBS与分离液的体积比为1:1:1。将血液缓慢加至分离液液面上方，并立即离心，防止血液沉入分离液中。
3. 在室温下以800 × g 离心20分钟。吸取中间层（富含PBMCs）转移至另一支15 mL离心管中。
   注意：离心后，离心管底部为红细胞，中间层为分离液，上层为血浆，血浆层与分离液层之间即为PBMC层（包括淋巴细胞和单核细胞）。
4. 用10 m....

结果

门控策略参考
用于分选四种淋巴细胞亚群的门控策略如图1所示。简而言之，首先在显示颗粒度（SSC-A）与细胞大小（FSC-A）的散点图上选取出淋巴细胞（P1）。接着，在显示细胞大小（FSC-A）与前向散射光（FSC-H）的散点图上选出单细胞（P2），排除双联体细胞。CD3⁺ T细胞和CD19⁺ B细胞在显示CD3 PerCP-Cy5.5-A与CD19 FITC-A的散点图上分别进行选择（图1B）。CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞则从P3门中，在显示CD8 PE-A与CD4 APC-Cy7-A的散点图上分别选出。CD16⁺/CD56⁺ NK细胞从P4门中，在显示CD56/CD16 APC-A与SSC-A的散点图上进行选择（图1C）。

通.......

讨论

本方案提供了一种高效分选外周血免疫细胞亚群的方法。本研究选取传染性单核细胞增多症（IM）患者、健康EBV携带者以及EBV未感染儿童的静脉血样本作为研究对象。本工作主要利用IM患者的外周血，通过多色流式细胞术分析并确定不同细胞亚群的比例。转录组测序主要用于检测和分析某一淋巴细胞亚群，但不足以对处于相同疾病状态的IM患儿不同免疫细胞亚群的分子特征和功能进行系统性与特异性的全面比较。因此，从外周血中分选出多种类型的细胞，并对其进行转录组测序以比较这些免疫细胞在基因表达及功能上的差异，可为研究IM的发病机制提供重要的数据支持。

FACS 分选的额外优势在于能够处理活的、分选后的细胞，用于进一步的 体外 或 体内 实验¹⁴。保持细胞活力对于后续实验至关重要。我们已优化了分选步骤以提高本方案中的细胞活力——实验操作均在冰上或4 °C冰箱中进行。适当的离心速度和时间对于细胞分离也至关重要。分选后细胞的得率是本方法的主要限制因素，而在分选过程中使用FBS包被的试管可显著减少细胞黏附于管壁造成的损失。为FACS分选仪.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 抗人 CD16	Biolegend	302012	荧光抗体
APC 抗人 CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	荧光抗体
APC/Cyanine7 抗人 CD4	Biolegend	344616	荧光抗体
自动细胞计数仪	BIO RAD	TC20	细胞计数
BD FACSAria 荧光激活 流式 细胞 分选仪-细胞计数仪（BD FACSAria II）	贝克顿·迪金森公司	644832	细胞分选
CD14 微珠，人源	Miltenyi Biotec	130-050-201	微珠
细胞计数载玻片	BIO RAD	1450016	细胞计数
离心管	Falcon	35209715	15 mL 离心管
EDTA（≥99%，BioPremium）	Beyotime	ST1303	EDTA
乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管	贝克顿·迪金森公司	367862	EDTA 抗凝管
FITC 抗人 CD19	Biolegend	302206	荧光抗体
Gibco 胎牛血清	赛默飞世尔科技	16000-044	胎牛血清
高速 离心机	Sigma	3K15	用于 15 mL 离心管的细胞离心
高速 离心机	Eppendorf	5424R	用于 1.5 mL Eppendorf（EP）管的细胞离心
人淋巴细胞分离液	达科为	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS 分离 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	分离 柱
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL 微量离心管
MidiMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-302	磁珠分离器
PE 抗人 CD8	Biolegend	344706	荧光抗体
PerCP/Cyanine5.5 抗人 CD3	Biolegend	344808	荧光抗体
磷酸盐缓冲液（PBS）	BI	02-024-1ACS	PBS
聚苯乙烯圆底管	Falcon	352235	用于流式细胞仪的 5 mL 管
TRIzol 试剂	Ambion	15596024	裂解细胞用于 RNA 提取
台盼蓝染色细胞活力检测试剂盒	Beyotime	C0011	台盼蓝染色