大肠杆菌 导致新生儿在出生前后摄入该细菌后发生败血症。所涉及的过程包括 E. coli的 从肠道进入血液的能力尚不明确。 体外 模型评估了……的能力 E. coli 菌株穿过肠上皮细胞。
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摘要
摘要
新生儿摄入母体 E. coli 在分娩前后定植于其肠道的菌株。 E. coli 具有穿越肠道能力的菌株可侵入新生儿血液，导致危及生命的菌血症。本文所述方法利用在半透性插入培养装置上培养的极化肠上皮细胞，评估新生儿菌株的跨细胞转运（transcytosis）能力。 E. coli 菌血症分离株 体外该方法利用已建立的T84肠上皮细胞系，该细胞系能够生长至汇合状态，并形成紧密连接和桥粒。当细胞达到汇合后，成熟的T84单层细胞会形成跨上皮电阻（TEER），可通过伏特计进行定量检测。TEER值与细胞旁通透性呈负相关，即TEER值越低，表明包括细菌在内的胞外成分通过肠上皮单层的细胞旁途径通透性越高。另一方面，细菌的跨细胞转运（转胞吞作用）则不一定影响TEER的测量值。在本模型中，可在感染后6小时内连续定量检测细菌穿越肠上皮单层的情况，并重复测定TEER以监测细胞旁通透性的动态变化。此外，该方法便于结合免疫荧光染色等技术，用于研究细菌在极化上皮中进行转胞吞时，紧密连接及其他细胞间黏附蛋白的结构变化。该模型的应用有助于阐明新生儿病原体穿越肠上皮屏障的分子机制。 E. coli 穿过肠上皮细胞以产生菌血症。
引言
Escherichia coli 是新生儿早发性败血症最常见的病因1,2,3。新生儿 E. coli 菌血症的死亡率可高达 40%，且可能并发脑膜炎，导致严重的神经发育障碍2。新生儿摄入母体来源的 E. coli 菌株可引发新生儿菌血症；该过程已在动物模型中成功复制2,4。摄入后，致病菌从新生儿肠道腔内穿过肠屏障进入血液，引起败血症。不同新生儿侵袭性 E. coli 菌株在侵入肠上皮细胞的能力方面存在差异1,5。然而，这些菌株在侵入后穿越肠上皮的转胞吞能力尚未被完全阐明。
这种肠道转胞吞模型是一种有用的体外方法，用于模拟细菌穿过肠上皮的过程。本文所介绍方法的总体目标是比较新生儿E. coli分离株穿过肠上皮的转胞吞能力。此处描述的模型使用T84细胞，这是一种永生化的人肠腺癌细胞系
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方案
注意：为避免污染，所有 T84 细胞、细菌、培养皿和试剂的操作均须在生物安全二级（BSL-2）安全柜中进行。所有涉及无菌 T84 细胞、感染性 T84 细胞以及 E. coli 的实验操作应使用独立区域和培养箱。本研究所采用的临床 E. coli 分离株均依据本机构机构审查委员会（Institutional Review Board）的指导原则获取1,16。
1. 准备含T84细胞的跨细胞转运小室（实验前约1-2周）
- 在组织培养基（TCM + 抗生素）中培养美国模式培养物集存库（ATCC）T84 细胞，该培养基由 DMEM/F12 培养基（1:1，终浓度各为 50%）、5% 胎牛血清和 1%（100 U/mL）青霉素/链霉素双抗混合物组成。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
注意：该培养基配方的一种变体（不含青霉素/链霉素的 TCM w/o 抗生素）将用于后续步骤（第 2 节及以后）。请确保每个步骤使用正确的培养基配方。 - 在生物安全柜（BSC）内操作，将 T84 细胞接种至用于 24 孔板的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜细胞培养小室插入物中，其膜孔径为 3 µm。为每种所需的实验条件设置小室插入....
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结果
图 1：T84 细胞随时间变化的 TEER 值。 随着 T84 细胞层在插入物上逐渐成熟，单层细胞的电阻值增加。当 TEER 值达到至少 1,000 Ω·cm2 时，细胞层已充分发育，可有效减少旁细胞细菌转运，从而允许主要测量跨细胞细菌转运。误差线表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
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讨论
该方法源自胃肠病学和传染病学领域使用的技术20。体外肠道上皮屏障模型已被用于阐明管腔内容物与先天免疫这一重要组分相互作用的机制6,8。侵袭性新生儿E. coli的宿主-病原体相互作用也已通过基因分析、抗菌药物耐药性研究以及免疫学技术被分别表征1,5,16,21。然而，目前对新生儿E. coli分离株通过肠道进入血液的分子机制仍知之甚少3。
本文所展示的转胞吞作用技术有助于更详细地表征那些经肠道获得后引发败血症的新生期 E. coli 侵袭性菌株。新.......
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致谢
本工作获得了密苏里大学堪萨斯城分校医学院向 A.I. 发放的莎拉·莫里森学生资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10,000 U/mL 青霉素/链霉素混合液 | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL 无菌锥形管 | MidSci | C15B | |
| 2 mL 微型离心管 | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL 无菌聚丙烯锥形管 | Falcon | 352070 | |
| 吸液器 | 康宁 | 4930 | |
| 生物安全柜 | Labconco | 30441010028343 | 该方法中使用了其中三个：一个用于无菌组织操作，一个用于感染组织操作，另一个用于细菌操作。 |
| 离心 | Sorvall | 图注 RT | |
| 一次性接种环 | Fisherbrand | 22363605 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11965-084 | |
| 上皮细胞伏特/欧姆计 | 世界精密仪器公司 | EVOM2 | |
| 胎牛血清 | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12营养混合物 | Gibco | 11765-047 | |
| 血细胞计数板 | Sigma Aldrich，明亮线 | Z359629 | |
| 摇床培养箱 | 新不伦瑞克 | Innova 4080 | |
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 51030284 | 该方法中使用了其中三种：一种用于无菌组织培养，一种用于感染组织培养，另一种用于细菌培养。 |
| 溶原性肉汤 | Difco | 244610 | |
| 溶菌肉汤琼脂 | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R 显微镜 | 尼康 | ||
| 分光光度计 | Unico | 1100RS | |
| T84 肠道细胞 | 美国组织培养收藏中心 | CCL248 | |
| 组织培养小室，带聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，3 µ微米级孔隙， 24孔板格式 | Falcon | 353096 | |
| 24孔组织培养板 | Falcon | 353504 | |
| 台盼蓝染色 | Fisher Scientific | T10282 |
参考文献
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al.
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重印与许可
