用于癌症表观遗传学研究的ATAC-Seq优化

摘要

ATAC-seq是一种DNA测序方法，它使用过度活跃的突变转座酶Tn5来绘制由转录因子介导的染色质可及性的变化。ATAC-seq能够发现癌细胞表型改变的分子机制。该协议概述了上皮细胞类型（包括癌细胞）中ATAC-seq的优化程序。

摘要

转座酶可接近染色质的高通量测序 （ATAC-seq） 测定使用高活性 Tn5 转座酶探测脱氧核糖核酸 （DNA） 可及性。Tn5切割和连接接头，用于在可访问的染色质区域内进行高通量测序。在真核细胞中，基因组DNA被包装成染色质，染色质是DNA，组蛋白和其他蛋白质的复合物，其作为转录机制的物理屏障。为了响应外在信号，转录因子招募染色质重塑复合物，以便能够进入转录机制进行基因激活。因此，在监测生物事件（如癌症进展）期间的增强子和基因启动子活性时，识别开放的染色质区域是有用的。由于该协议易于使用且细胞输入要求低，因此ATAC-seq已广泛用于定义各种细胞类型（包括癌细胞）中的开放染色质区域。为了成功进行数据采集，在准备ATAC-seq库时需要考虑几个参数。其中，细胞裂解缓冲液的选择、Tn5酶的滴定和细胞的起始体积对于癌细胞中的ATAC-seq文库制备至关重要。优化对于生成高质量数据至关重要。在这里，我们详细介绍了上皮细胞类型的ATAC-seq优化方法。

引言

染色质可及性是在全基因组范围内调节基因表达的关键要求¹。染色质可及性的变化通常与几种疾病状态有关，包括癌症²，^3，4。多年来，已经开发了许多技术，使研究人员能够通过绘制染色质可及性区域来探测染色质景观。其中一些包括DNase-seq（DNase I超敏位点测序）⁵，FAIRE-seq（甲醛辅助分离调控元件）⁶，MAPit（单个模板的甲基转移酶可及性协议）⁷，以及本文的重点ATAC-seq（转座酶可接近染色质的测定）⁸。DNase-seq通过采用DNase的一个关键特征来绘制可访问的区域，即优先消化不含组蛋白和其他蛋白质（如^{转录因子）}的裸DNA。FAIRE-seq与ChIP-seq类似，利用甲醛交联和超声处理，但不涉及免疫沉淀，并且通过苯酚-氯^{仿提取分离}无核小体区域6。MAPit方法使用GC甲基转移酶以单分子分辨率⁷探测染色质结构。ATAC-seq依赖于过度活跃的转座酶Tn5⁸。Tn5转座酶优先结合开放的染色质区域，并将测序接头插入可访问的区域。Tn5通过DNA介导的"剪切和粘贴"机制起作用，其中预加载有适配器的转座酶与打开的染色质位点结合，切割DNA，并连接接头⁸。Tn5结合区域通过使用退火到这些接头的引物进行PCR扩增来回收。FAIRE-seq 和 DNase-seq 在测序⁹ 之前需要大量的起始材料（~100，000 个细胞至 225，000 个细胞）和单独的文库制备步骤。另一方面，ATAC-seq协议相对简单，需要少量细胞（<50，000个细胞）¹⁰。与FAIRE-seq和DNase-seq技术不同，ATAC-seq的测序文库制备相对容易，因为分离的DNA样品已经被Tn5用测序接头标记。因此，只需使用适当引物的PCR扩增步骤即可完成文库制备，无需执行末端修复和接头连接等先前的处理步骤，从而节省时间¹¹。其次，ATAC-seq 避免了使用 MAPit⁷ 所需的区域特异性引物进行亚硫酸氢盐转化、克隆和扩增的需要。由于这些优点，ATAC-seq已成为定义开放染色质区域的一种非常流行的方法。尽管ATAC-seq方法很简单，但需要优化多个步骤才能获得高质量和可重现的数据。本文讨论了标准ATAC-seq文库制备的优化程序，特别强调了三个参数:（1）裂解缓冲液组成，（2）Tn5转座酶浓度和（3）细胞数。此外，本文还提供了使用癌性和非癌性贴壁上皮细胞的优化条件的示例数据。

方案

1. 实验开始前的准备工作

1. 准备裂解缓冲液原液。
   注意:每种细胞类型的最佳核隔离缓冲液可能不同。我们建议使用台盼蓝染色检测原始论文⁸ 中使用的低渗缓冲液和每种细胞类型的CSK缓冲液^12，13 。
   1. 为了制备低渗缓冲液（绿叶缓冲液），混合10 mM Tris-HCl pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MgCl₂和0.1%NP-40。
   2. 要制备CSK缓冲液，请混合10 mM PIPES pH 6.8，100 mM NaCl，300 mM蔗糖，3 mM MgCl₂和0.1%Triton X-100。
2. 确保细胞培养条件最佳;在光学显微镜下检查细胞，以确保细胞凋亡水平没有升高。
3. 打开离心机使其达到4°C。

2. 细胞收获

1. 以 <80% 汇合度从细胞培养物中吸出培养基。细胞通常在 35 mm 或 60 mm 培养皿中生长，具体取决于所需的细胞数量、处理等。
2. 用 1 mL 或 3 mL PBS 洗涤细胞。
3. 加入 0.5 mL 或 1 mL 胰蛋白酶并孵育 2-3 分钟（取决于细胞类型）。小心地使用 1 mL 移液器充分混合。
4. 向板中加入 1 mL 或 2 mL 培养基并充分混合。转移到 15 mL 锥形管中。将细胞在 15 mL 管中以 300 x g 离心 3 分钟 。
   注意: 建议使用水平吊斗转子，以最大程度地减少电池损失。
5. 吸出培养基并将细胞重悬于 1 mL 或 2 mL 培养基中。
   注意:制备均质单细胞溶液至关重要。对于组织，Dounce 均质机可用于均质组织并最大限度地减少大细胞团块或聚集体。一些组织需要过滤（例如，细胞过滤器）和/或FACS细胞分选以分离活细胞并获得单细胞溶液。
6. 使用细胞计数器计数细胞。
   注意:在本研究中，使用了自动细胞计数器（材料表）。
7. 在室温（RT）下以300×g离心所需的细胞体积（例如，基于细胞计数的包含1 x 10⁶个细胞的体积）3分钟。
8. 将含有 1 x 10⁶ 个细胞的细胞沉淀重悬于 1 mL 冷 PBS 中。
   注意:如果细胞数量小于1 x 10 6个细胞，请减少冷PBS体积以制备相同浓度（1 x 10⁶个细胞/ mL）的细胞溶液。

3. 细胞裂解

1. 将 25 μL（= 2.5 x 10⁴ 个细胞）转移到新的 1.7 mL 微量离心管中。在4°C下以500× g 离心5分钟，小心地弃去上清液
   注意: 建议使用水平吊斗转子，以最大程度地减少电池损失。留下约3μL上清液以确保细胞不被丢弃。
2. 加入 25 μL 裂解缓冲液，通过轻轻上下移液重悬细胞。在冰上孵育5分钟
3. 在4°C下以500× g 离心5分钟，小心地弃去上清液。
   注意: 建议使用水平吊斗转子，以最大程度地减少电池损失。留下约3μL上清液以确保细胞不被丢弃。

4. Tn5标签

1. 立即将沉淀重悬于25μL的Tn5反应混合物中。Tn5 反应混合物如下:12.5 μL 2x 标记 DNA 缓冲液（TD 缓冲液）、1.25-5 μL Tn5转座酶和 11.25-7.5 μL 无核酸酶水。
   注意:Tn5 的标准浓度为 2.5 μL，适用于 2.5 x 10⁴ 个细胞。
2. 在37°C孵育30分钟。
   注意:每10分钟混合一次溶液。

5. 脱氧核糖核酸纯化

注意:扩增前需要纯化。DNA纯化使用MinElute PCR纯化试剂盒（材料表）完成。

1. 加入 5 μL 3 M 乙酸钠 （pH 5.2）。
2. 立即加入 125 μL 缓冲液 PB 并充分混合。
3. 遵循从步骤 2 开始的 PCR 纯化试剂盒方案。
   1. 将离心柱放入 2 mL 收集管中。
   2. 将样品施加到离心柱上，并在室温下以17，900× g 离心1分钟。
   3. 丢弃流通物并将离心柱放回同一收集管中。
   4. 向离心柱中加入 750 μL 缓冲液 PE，并在室温下以 17，900 x g 离心 1 分钟。
   5. 丢弃流通物并将离心柱放回同一收集管中。
   6. 将离心柱离心5分钟以使膜完全干燥。
   7. 丢弃流通物并将离心柱放入新的 1.7 mL 微量离心管中。
   8. 用 10 μL 缓冲液 EB 洗脱 DNA 片段。
   9. 让柱子在室温下静置1分钟。
   10. 在室温下以17，900 x g 离心1分钟以洗脱DNA。

6. PCR扩增

注意:转座（标记）DNA的PCR扩增对于测序是必要的。本例中使用了Nextera套件适配器（材料表）。本研究中使用的引物列于 表1中。

1. 在 200 μL PCR 管（每个样品 50 μL）中设置以下 PCR 反应。PCR反应混合物如下:10 μL 洗脱 DNA（步骤 5.）、2.5 μL 25 mM 适配器 1、2.5 μL 25 mM 适配器 2、25 μL 2x PCR 预混液和 10 μL 无核酸酶水
2. 执行PCR扩增程序第1部分（表2）。
   注意:对于初始扩增，使用标准热循环仪的所有样品使用相同的条件。
3. 实时 qPCR（每个样品总计 14.5 μL）
   1. 使用来自PCR扩增部分1（步骤6.2.）的5μL产物，设置以下反应，这次包括SYBR金并在实时PCR机中进行检测。
   2. 按如下方式制备PCR反应混合物:步骤6.2.中的5μLPCR产物，0.75μLSYBR金（1000倍稀释），5μL2xPCR预混液和3.75μL无核酸酶水。
      注意:每个样品在达到饱和之前文库扩增的精确循环数由qPCR（表3）确定，以减少PCR¹⁰中的GC和大小偏差。SYBR黄金用无核酸酶水稀释。为了制备稀释溶液，将 1 μL SYBR 金（储备浓度 10，000x）加入到 999 μL 无核酸酶水中。 表3 中提到的RT-qPCR的运行时间约为60分钟。
4. 使用步骤6.3中的运行参数确定所需的额外PCR循环次数。
   1. 循环次数 = 1/4 最大（饱和）荧光强度（通常为 3 或 4 个 PCR 循环）
5. PCR扩增程序第2部分（体积= 45μL; 表4）:确定循环次数后，使用步骤6.4.1计算的其他循环设置PCR。例如，如果计算的周期数为 3，请在下面的程序中设置 3 个周期。总周期为 8（步骤 6.2 中为 5，加上步骤 6.5 中的 3 个额外周期）。

7. 磁珠纯化

注意:这里使用了AMPure XP（材料表）珠子。

1. 向上一步中扩增的PCR产物中，在室温下加入150 μL磁珠。
   注意:在此过程中可以使用自制的AMPure珠¹⁴ 。
2. 在室温下孵育15分钟。
3. 将试管放在磁性支架上5分钟。
4. 小心地除去上清液。
5. 用 200 μL 80% 乙醇洗涤珠子。
   注意:80%乙醇应新鲜制备。
6. 重复步骤 7.4。
7. 完全除去乙醇。
8. 在室温下风干样品10分钟。
9. 用 50 μL 洗脱缓冲液 （10 mM Tris-HCL pH 8.0） 重悬。
10. 重复磁珠纯化（步骤7.1.-7.9），以进一步减少引物污染。

8. DNA浓度和质量检查

1. 使用核酸定量试剂盒测量DNA浓度（材料表）。
2. 使用SYBR Gold（0.5x TBE，1.5%琼脂糖凝胶）或自动电泳系统（例如，TapeStation，生物分析仪）通过凝胶电泳检查扩增的DNA片段。

9. 排序

1. 使用扩增的DNA样品^12，13进行高通量测序。
   注意:扩增的DNA样品可用于高通量测序。为了保留核小体DNA片段信息，建议使用配对末端测序而不是单端测序。DNA片段的两端指示转座酶结合的位置。对于绘制开放染色质区域的图谱，3000万次读取/样本通常就足够了。

10. 数据分析

1. 基于基本呼叫质量的数据筛选:将最低平均基本质量分数设置为 20（准确率为 99%）。
2. 适配器修整:使用适当的工具删除适配器序列。
   注:修剪包装工具（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）用于删除适配器序列。对于由Illumina Tn5准备的ATAC-seq库，以下序列用作适配器序列:CTGTCTCTTATACACATCT。识别适配器污染的最小序列长度设置为 5。
3. 基因组图谱:使用以下参数"-I 0 -X 2000 -m 1"¹⁵，将读数映射到带有Bowtie的适当基因组。MDA-MB-231基底乳腺癌细胞质量图谱示例如下:
   至少报告一个对齐的读数:52.79%
   无法对齐的读取:13.10%
   由于 -m 而抑制对齐的读取:34.11%
4. 重复数据删除:使用皮卡德工具标记 PCR 重复项¹⁶.
5. 生成用于数据可视化的基因组覆盖文件:将重复数据删除的配对端读取转换为单端读取片段。基因组覆盖跟踪是使用来自bedtools¹⁷的genomeCoverageBed获得的。

结果

为了获得成功和高质量的ATAC-seq数据，优化实验条件非常重要。ATAC-seq文库制备可分为五个主要步骤（图1），即细胞裂解、标记（通过Tn5片段化和接头插入）、基因组DNA纯化、PCR扩增和数据分析。作为初始过程，必须首先针对每种细胞类型优化细胞裂解（核分离）缓冲液。原始ATAC-seq论文⁸或CSK缓冲液^12，13中描述的低渗缓冲液用于裂解乳腺癌细胞。台盼蓝染色可用于确认细胞核分离¹⁸。对于人癌细胞系（如MDA-MB-231、T47D、MCF7和A375细胞）中的ATAC-seq文库制备，CSK缓冲液已被多个组¹²，^13，19，

讨论

ATAC-seq已被广泛用于绘制开放和活性染色质区域的图谱。癌细胞进展通常由遗传改变和表观遗传重编程驱动，导致染色质可及性和基因表达改变。在上皮到间充质转化（EMT）及其反向过程间充质到上皮转化（MET）期间可以看到这种重编程的一个例子，已知这是肿瘤转移期间的关键细胞重编程过程³⁰。另一个例子是在管腔乳腺肿瘤³¹中经常观察到对激素疗法的耐药性的获得。ATAC-seq可用于监测染色质水平的这种细胞表型改变，并可用于预测起源细胞和癌症亚型⁴。

为了通过ATAC-seq精确测量染色质重塑，有必要建立一个可重复且一致的方案。本文描述了ATAC-seq文库优化的标准策略。来自MDA-MB-231和NMuMG细胞系的ATAC-seq数据用作优化过程的示例。NMuMG细胞已被用于研究EMT，MDA-MB-231细胞已被用于研究其反向过程MET。这些细胞模型以前已用于研究EMT和MET^13，

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µL XL TipOne 吸头	USA Scientific	1120-3810	过滤和低吸附
100 &微量;L XL TipOne RPT 吸头	USA Scientific	1182-1830	过滤和低吸附
100 &微量;L XL TipOne 吸头	USA Scientific	1120-1840	过滤和低吸附。斜面级
15 mL 锥形离心管	Corning	352096
20 µL TipOne RPT 吸头	USA Scientific	1183-1810	过滤和低吸附
200 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	过滤和低吸附
50 mL 离心管	Fisherbrand	06-443-19
琼脂糖	ThermoFisher Scientific	YBP136010	遗传分析级
本研究中使用的所有细胞系均来自 ATCC	ATCC
Allegra X-30R 离心机	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP 珠子	Beckman Coulter	A63881	珠子纯化试剂盒
CellDrop 细胞计数器	DeNovix	CellDrop FL	细胞计数器
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra，无水，≥99%（滴定法）
EGTA	MilliporeSigma	E3889
乙醇 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	无水;Fisher Scientific - Decon Labs 灭菌产品
胎牛血清 - TET 测试	R&D Systems	S10350	三重 0.1 &m 过滤
的 Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4.5 g/L D-葡萄糖;[+]L-谷氨酰胺;[-]丙酮酸钠
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Gibco 胰蛋白酶-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	（0.25%），酚红
甘油	IBI Scientific	56-81-5
甘氨酸	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit 荧光计	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004	DNA 纯化试剂盒
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra， ≥98%（酸性测定），沉淀（无水）
NEBNext 高保真 2x PCR 预混液	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA 样品制备试剂盒	Illumina	FC-121-1030	2x TD 和 Tn5 转座酶
NP - 40 （IGEPAL CA-630）	MilliporeSigma	I8896	用于分子生物学
PCR 检测系统	BioRad	1855484	CFX384 实时系统。C1000 Touch 热循环仪
PIPES	MilliporeSigma	P1851	生物性能认证，适用于细胞培养
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen;核酸定量试剂盒
Quibit 检测管	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
乙酸钠	自制		pH 5.2
蔗糖	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold，ThermoFisher	Scientific	S11494
SYBR Green超混合液，1.25 mL	BioRad	1708882
T100 热循环仪	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8 联排管	USA Scientific	1402-4700	无弹性、自然色聚丙烯
TempPlate 384 孔 PCR 板	USA Scientific	1438-4700	单缺口。天然聚丙烯
Tris 碱	MilliporeSigma	648311	ULTROL 级
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq 双索引测序引物试剂盒	Illumina	PE-121-1003	双端
台盼蓝染色	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra，粘稠液体
水	MilliporeSigma	W3500	无菌过滤，生物试剂，适用于细胞培养