ATAC-Seq 在癌症表观遗传学研究中的优化

摘要

ATAC-seq 是一种DNA测序方法，利用高活性突变型转座酶Tn5来绘制由转录因子介导的染色质可及性变化图谱。ATAC-seq有助于揭示癌细胞表型改变背后的分子机制。本方案概述了在上皮细胞类型（包括癌细胞）中进行ATAC-seq的优化步骤。

摘要

利用高通量测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）通过高活性Tn5转座酶来探测脱氧核糖核酸（DNA）的可及性。Tn5在可及的染色质区域切割DNA并连接适用于高通量测序的接头。在真核细胞中，基因组DNA被包装成染色质，即由DNA、组蛋白及其他蛋白质组成的复合物，该结构对转录机制构成物理屏障。响应外界信号时，转录因子会招募染色质重塑复合物，使转录机制能够接触DNA，从而激活基因表达。因此，在监测癌症进展等生物学过程中增强子和基因启动子活性时，鉴定开放染色质区域具有重要意义。由于该实验方案操作简便且所需细胞数量少，ATAC-seq已被广泛用于定义多种细胞类型（包括癌细胞）中的开放染色质区域。为了成功获取数据，在构建ATAC-seq文库时需考虑多个参数。其中，细胞裂解缓冲液的选择、Tn5酶的滴定以及起始细胞体积对癌细胞ATAC-seq文库的制备尤为关键。优化这些条件对于获得高质量数据至关重要。本文详细描述了针对上皮细胞类型的ATAC-seq优化方法。

引言

染色质可及性是全基因组范围内基因表达调控的关键前提¹染色质可及性的改变通常与多种疾病状态相关，包括癌症。^2,3,4多年来，研究人员已开发出多种技术，通过绘制染色质可及性区域来探究染色质景观。其中一些技术包括 DNase-seq（DNase I 超敏感位点测序）⁵FAIRE-seq（甲醛辅助分离调控元件）⁶，MAPit（单个模板甲基转移酶可及性检测方法）⁷，以及本文的重点 ATAC-seq（转座酶可及染色质检测）⁸DNase-seq 利用 DNase 的一个关键特性来绘制可及区域图谱，即优先消化不含组蛋白及其他蛋白质（如转录因子）的裸露 DNA。⁵FAIRE-seq 与 ChIP-seq 类似，均利用甲醛交联和超声处理，但无需进行免疫沉淀，而是通过酚-氯仿抽提分离无核小体区域。⁶MAPit 方法利用 GC 甲基转移酶在单分子分辨率下探测染色质结构⁷ATAC-seq 依赖于....

方案

1. 实验开始前的准备工作

1. 配制裂解缓冲液储备液。
   注意：不同细胞类型所需的最适核分离缓冲液可能有所不同。我们建议使用台盼蓝染色法，对原始文献⁸中所述的低渗缓冲液和CSK缓冲液^12,13在每种细胞类型中进行测试。
   1. 配制低渗缓冲液（Greenleaf缓冲液）：混合10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM NaCl、3 mM MgCl₂ 和 0.1% NP-40。
   2. 配制CSK缓冲液：混合10 mM PIPES（pH 6.8）、100 mM NaCl、300 mM蔗糖、3 mM MgCl₂ 和 0.1% Triton X-100。
2. 确保细胞培养条件处于最佳状态；在光学显微镜下观察细胞，确认无明显程度的凋亡现象。
3. 开启离心机，使其温度降至4 °C。

2. 细胞收获

1. 从细胞培养物中吸除培养基 <80% 汇合度。根据所需细胞数量、处理条件等因素，细胞通常培养于 35 mm 或 60 mm 培养皿中。

结果

为了获得成功且高质量的ATAC-seq数据，优化实验条件至关重要。ATAC-seq文库构建可分为五个主要步骤（图1），即细胞裂解、标签化（Tn5介导的片段化和接头插入）、基因组DNA纯化、PCR扩增以及数据分析。作为初始步骤，必须针对每种细胞类型首先优化细胞裂解（细胞核分离）缓冲液。在裂解乳腺癌细胞时，可使用原始ATAC-seq论文中描述的低渗缓冲液⁸或CSK缓冲液^12,13。台盼蓝染色可用于确认细胞核的分离效果¹⁸。在MDA-MB-231、T47D、MCF7和A375等人源癌细胞系的ATAC-seq文库构建中，多个研究团队均采用了CSK缓冲液^12,13,19,.......

讨论

ATAC-seq 已被广泛用于绘制开放和活跃的染色质区域。癌细胞的进展通常由遗传改变和表观遗传重编程驱动，导致染色质可及性和基因表达发生改变。这种重编程的一个例子是在上皮-间质转化（EMT）及其逆向过程间质-上皮转化（MET）中观察到的现象，这些过程被认为是肿瘤转移期间关键的细胞重编程事件³⁰。另一个例子是在管腔型乳腺肿瘤中，常观察到对激素治疗产生耐药性³¹。ATAC-seq 有助于在染色质水平上监测此类细胞表型变化，并可用于预测肿瘤起源细胞及癌症亚型⁴。

为了精确测量ATAC-seq中的染色质重塑，必须建立一种可重复且一致的实验方案。本文描述了一种ATAC-seq文库优化的标准策略。以MDA-MB-231和NMuMG细胞系的ATAC-seq数据为例，展示了优化过程。NMuMG细胞已被用于研究上皮-间质转化（EMT），而MDA-MB-231细胞则被用于研究其逆向过程——间质-上皮转化（MET）。这些细胞模型此前已被用于研究EMT和MET过程.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5500	天然色
10 µL XL TipOne 吸头	USA Scientific	1120-3810	带滤芯且低吸附
100 µL XL TipOne RPT 吸头	USA Scientific	1182-1830	带滤芯且低吸附
100 µL XL TipOne 吸头	USA Scientific	1120-1840	带滤芯且低吸附，斜面级
15 mL 圆锥形离心管	Corning	352096
20 µL TipOne RPT 吸头	USA Scientific	1183-1810	带滤芯且低吸附
200 µL TipOne RPT 吸头	USA Scientific	1180-8810	带滤芯且低吸附
50 mL 离心管	Fisherbrand	06-443-19
琼脂糖	ThermoFisher Scientific	YBP136010	遗传分析级
本研究中使用的所有细胞系均购自 ATCC	ATCC
Allegra X-30R 离心机	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63881	磁珠纯化试剂盒
CellDrop 细胞计数仪	DeNovix	CellDrop FL	细胞计数仪
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra 级，无水，≥99%（滴定法）
EGTA	MilliporeSigma	E3889
100% 乙醇	ThermoFisher Scientific	AC615100020	无水；Fisher Scientific - Decon Labs 消毒产品
胎牛血清 - 经 TET 检测	R&D Systems	S10350	三重 0.1 µm 过滤
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4.5 g/L D-葡萄糖；[+] L-谷氨酰胺；[-] 丙酮酸钠
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Gibco 胰蛋白酶-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	（0.25%），含酚红
甘油	IBI Scientific	56-81-5
甘氨酸	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit 荧光计	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004	DNA 纯化试剂盒
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra 级，≥98%（酸量法），颗粒状（无水）
NEBNext 高保真 2x PCR 预混液	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA 样本制备试剂盒	Illumina	FC-121-1030	含 2x TD 和 Tn5 转座酶
NP-40（IGEPAL CA-630）	MilliporeSigma	I8896	分子生物学级
PCR 检测系统	BioRad	1855484	CFX384 实时系统，C1000 Touch 梯度 PCR 仪
PIPES	MilliporeSigma	P1851	经 BioPerformance 认证，适用于细胞培养
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen；核酸定量试剂盒
Qubit 检测管	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
醋酸钠	自制	-	pH 5.2
蔗糖	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Green Supermix，1.25 mL	BioRad	1708882
T100 梯度 PCR 仪	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8联管条	USA Scientific	1402-4700	无弹性，天然聚丙烯
TempPlate 384孔 PCR 板	USA Scientific	1438-4700	单缺口，天然聚丙烯
Tris 碱	MilliporeSigma	648311	ULTROL 级
Triton X-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq 双端索引测序引物试剂盒	Illumina	PE-121-1003	双端测序
台盼蓝染液	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra 级，黏稠液体
水	MilliporeSigma	W3500	经无菌过滤，BioReagent 级，适用于细胞培养