单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

摘要

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。

摘要

细胞膜是生物分子反应和信号传导高度拥挤的环境。然而，大多数研究蛋白质与脂质相互作用的体外（in vitro）实验采用的是裸露的双层膜体系。这类系统缺乏膜嵌入蛋白和糖类造成的拥挤效应，也未包含细胞膜表面所存在的相应空间位阻效应。此外，脂质双层通常构建在带负电荷的玻璃表面，这会阻碍跨膜生物分子的自由扩散。本文介绍一种经过充分表征的聚合物-脂质膜，可作为模拟拥挤脂质膜的模型体系。本实验方案采用聚乙二醇（PEG）修饰的脂质分子，作为在支撑性脂质双层 （SLB）中引入拥挤因子的通用方法。首先，介绍用于单分子实验的显微镜载玻片和盖玻片的清洗步骤。随后，阐述对PEG修饰的SLB进行表征的方法，并讨论利用单分子示踪和光漂白技术开展生物分子结合、扩散及组装过程的单分子实验。最后，本方案演示如何通过单分子光漂白分析，在拥挤脂质膜上监测细菌成孔毒素Cytolysin A（ClyA）的纳米孔组装过程。同时提供包含示例数据集的MATLAB代码，用于执行粒子追踪、提取扩散行为以及亚基计数等常见分析任务。

引言

细胞膜是高度拥挤且复杂的系统¹。分子拥挤可显著影响膜结合实体（如蛋白质和脂质）的扩散行为^2,3,4。类似地，脂质膜上的双分子反应（如受体二聚化或膜复合物的寡聚化）也受到拥挤效应的影响^5,6,7。拥挤分子的性质、构型和浓度可通过多种方式调控膜结合能力、扩散性以及蛋白质-蛋白质相互作用^8,9。由于在细胞膜上控制膜拥挤程度并解析其对嵌入生物分子的影响具有挑战性，研究人员已尝试建立替代的体外（in vitro）系统¹⁰。

一种构建人工拥挤膜的常用方法是将聚合物（如聚乙二醇，PEG）接枝的脂质掺入双层膜中^11,12在可视化支撑脂双层（SLBs）上蛋白质与脂质动态的过程中，这....

方案

1. 单分子实验用载玻片和盖玻片的清洗

1. 在组装成像室之前，清洁并准备好盖玻片和载玻片。使用带有金刚石涂层钻头（直径0.5-1 mm）的钻孔机在玻璃载玻片上钻出多对孔。如果使用丙烯酸板，则使用激光切割机制作精确的孔（0.5 mm），如图1所示。
   注意：每对孔将作为单个微流控腔室的流体交换入口和出口。丙烯酸载玻片上孔的代表性CAD文件见补充代码文件1。在玻璃载玻片上钻出的孔通常比钻头尺寸大1.5至2倍。
2. 用洗涤剂清洗载玻片和盖玻片，然后用去离子水彻底冲洗。将载玻片和盖玻片分别放入盛有水的染色片（Coplin）瓶中，并在浴式超声仪中进行30分钟的超声处理。所有超声步骤均使用70 W的功率设置。
3. 倒掉水，将装有玻璃载玻片和盖玻片的Coplin瓶用丙酮加满（根据瓶子体积使用50-100 mL）。若使用丙烯酸板，则使用相同体积的预混50%（v/v）丙酮溶液，否则载玻片会变得雾化。摇动Coplin瓶以确保所有载玻片和盖玻片完全浸入溶液中，并在浴式超声仪中超声30分钟。
4. 倒掉丙酮并将其弃置于废液容器中，向Coplin瓶中加入甲醇（丙烯酸载玻片使用50% v/v），并超声30分钟。丙酮和甲醇均用于去除载玻片上的有机颗粒。
5. 用大量一级水冲洗载玻片和盖玻片，并将其放入玻璃制Coplin瓶中。向瓶中加入1 M KOH....

结果

监测ClyA蛋白在聚乙二醇化膜上的结合
在步骤4.5之后，通过绘制随时间结合到膜表面的颗粒数量来估算结合动力学（视频1）。当ClyA蛋白结合至含有5 mol% PEG2000脂质的膜时，颗粒密度增加并达到饱和（图5）。对结合颗粒（青色圆圈）进行指数衰减拟合可得到膜结合的时间常数（τ_b）（值得注意的是，本例中未对初始时间点[红色圆圈]进行拟合）。

拥挤膜上DNA示踪剂的移动性
我们通常使用DNA示踪剂（通过生育酚锚定在膜上）、亲脂性示踪染料（例如DiI）或膜蛋白（例如ClyA）来表征PEG介导的拥挤环境下的膜。通过成像颗粒结合后的膜，可以监测标记示踪分子（25–100 pM）的侧向扩散。当膜中不存在任何PEG聚合物时，大多数示踪剂（尤其是那些延伸出双分子层外部的）在支撑脂双层（SLB）上表现出受限扩散（图6A）。当膜中含有少量P.......

讨论

本文展示了在支持性脂双层（SLB）上进行的单分子实验，该系统可模拟膜结合生物分子所处的拥挤环境。这种拥挤环境会产生排除体积效应，从而增强生物分子间的相互作用^1,2,39,40。在聚乙二醇-脂质（PEG-lipid）体系中，聚合物主要占据脂双层外部的空间，因此对于具有较大胞外结构域的分子而言，该效应尤为显著。因此，与亲脂性染料相比，嵌入膜内的大分子亲水性物质（如受体、糖蛋白和糖脂）的扩散会显著受限。通过使用经生育酚锚定在膜上的荧光示踪DNA（图5），我们可以识别此类拥挤效应。

此外，底侧叶中存在聚乙二醇（PEG）也会将支撑脂双层（SLB）抬离基底，从而减弱生物分子与支撑基底之间的相互作用^14,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.5 ml 注射器	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 ml 结核菌素注射器	塑料注射器
丙酮	Finar Chemicals	10020LL025
亚克力板			2 mm 厚
亚克力板	BigiMall		2 mm，透明
超声波清洗仪	Branson	CPX-1800
氯化钙
氯仿	Sigma	528730	HPLC 级
胆固醇	Avanti	700100
柯普林瓶	Duran Wheaton Kimble	S6016	8 片装载玻片瓶，带玻璃盖
盖玻片	VWR	631-1574	24 mm × 50 mm
Cy3-DNA 链	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
花菁染料（Cy3）	Cytiva Life Sciences	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	DiI 染色剂（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（'DiI'；DiIC18(3)））
DNA 连接链 1	Sigma Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA 连接链 2	Sigma Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA 生育酚链	Biomers		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）
双面胶带	3M	LF93010LE
钻头（金刚石涂层）			0.5 - 1 mm
钻孔机	Dremel	220	工作台
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
荧光微球	Invitrogen	F10720
载玻片	Blue Star		显微载玻片，PIC-1
玻璃小瓶	Sigma	854190
过氧化氢	Lobachemie	00182	30% 溶液，分析纯级
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		洗涤剂
532 nm 激光器	Coherent	Sapphire
激光切割机	Universal Laser Systems	ILS12.75
丽丝胺罗丹明 DOPE	Avanti	810150	1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明 B 磺酰基)（铵盐）
甲醇	Finar Chemicals	30932LL025
显微镜	Olympus	IX81
磷酸盐缓冲液（PBS）			1X
等离子清洗机	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱
可编程注射泵	New Era Pump Systems	NE1010	高压注射泵
PTFE 盖帽	Sigma	27141
PTFE 管	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex，内径 0.022" × 外径 0.042"
硫酸	SD Fine Chemicals		98%，分析纯级
TIRF 物镜	Olympus	UPLAPO100XOHR
真空干燥器	Tarsons
涡旋混合器	Tarsons