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方法文章

研究气管的应力松弛与失效响应

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DOI：

10.3791/64245

⸱

2022年10月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Widener University, 2Drexel University College of Medicine, 3School of Biomedical Engineering, Science and Health Systems, Drexel University, 4Rosetree Media School District

本文内容

摘要

本实验方案旨在测定猪气管的拉伸应力松弛特性及失效特性。通过此类方法获得的结果有助于加深对气管黏弹性及失效阈值的理解，并推动肺系统计算模型的进一步发展。

摘要

气管的生物力学特性直接影响气流，并对呼吸系统的生物学功能起重要作用。理解这些特性对于阐明该组织的损伤机制至关重要。本实验方案描述了一种研究猪气管应力松弛行为的方法，实验中将气管预拉伸至0%或10%应变并维持300秒，随后进行机械拉伸加载直至组织断裂。本研究详细介绍了实验设计、数据采集、分析方法以及猪气管生物力学测试的初步结果。通过本方案提供的详细步骤以及用于数据分析的MATLAB代码，后续研究可进一步探讨气管组织的时变黏弹性行为，这对于理解其在生理、病理及创伤条件下的生物力学响应具有重要意义。此外，对气管生物力学行为的深入研究将有助于改进相关医疗器械的设计，例如在手术中广泛使用的气管内植入物。

引言

尽管气管作为肺部疾病中最重要的气道结构，但有关其黏弹性特性的研究仍然有限1。深入理解气管的时间依赖性黏弹性行为对于呼吸力学研究至关重要，因为了解特定气道的材料特性有助于推动肺部疾病（在美国是第三大死因）的损伤预防、诊断以及临床干预的科学发展2,3,4。

现有的组织表征研究已报道了气管的刚度特性5,6,7,8。尽管时间依赖性力学响应在组织重塑中具有重要意义，且病理状态会改变这一过程，但相关研究仍十分有限9,10。此外，缺乏时间依赖性响应数据也限制了肺力学计算模型的预测能力，目前这些模型只能依赖通用的本构关系。因此，有必要通过开展应力松弛研究来弥补这一空白，以获取必要的材料特性参数，为气管的生物物理研究提供依据。本研究详细介绍了用于探究猪气管应力松弛行为的测试方法、数据采集及数据分析过程。

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方案

所有所述方法均经德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有尸体动物均来自位于美国宾夕法尼亚州的美国农业部（USDA）批准的农场。本研究使用了一具雄性约克夏猪（3周龄）的尸体。

1. 组织采集

  1. 从经批准的农场获取猪的尸体，并在安乐死后2小时内完成实验。在组织取材完成前，将尸体保存在冰上，以确保新鲜组织的生物力学特性得以保留。
    注意：在已发表的文献中，动物新鲜组织的测试通常在安乐死后2小时内进行。详情请参见参考文献11,12,13,14,15,16,17,18,19。
  2. 将尸体置于仰卧位，沿颈部做一条垂直正中切口，暴露从舌骨至胸骨上切迹的甲状软骨、环状软骨和气管。
  3. 使用#10刀片切除喉部及全长气管（图1A）。
  4. 将气管样本与喉部分离，然后使用#10刀片沿一侧全长纵向切开气管管壁（图1B）。
  5. 利用获取的横截面图像（使用ImageJ20获得，见材料表）测量气管厚度（图1C）。在数据分析过程中，使用测得的组织厚度计算横截面积。
  6. 将气管切成两段周向条状样本（近端），宽度约为5 mm，以及两段纵向条状样本（远端），宽度也约为5 mm，所有条状样本的最小长度应为25 mm（图1D）。
  7. 获取四个样本（即切割后的气管条）与标尺并列的图像。使用ImageJ对样本宽度进行数字化测量（图1E）。随后在数据分析过程中，利用该测得的宽度计算样本的横截面积。
  8. 在整个研究过程中，确保所有组织样本均使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）保持湿润。测试前将样本保存在PBS浸湿的纱布中。测试前立即将组织浸入PBS中，以确保充分水合。

2. 生物力学测试

  1. 将每个样品固定在定制设计的夹具上（参见先前的报道11,12,13,14,15,16,17,18,19），使样品在夹具之间沿纵向被夹持（图1F）。
  2. 小心地将夹具固定在材料试验机上（见材料表），确保不引起任何拉伸，试验机的顶部作动器上装有50 N的载荷传感器（图1G）。
  3. 使用直尺测量夹具之间的距离。将该距离作为应变计算的初始组织长度。
  4. 以1%/s的应变速率对每个样品进行五次拉伸加载，完成预调处理，达到1%的应变。
  5. 在峰值伸长率为0%或10%的条件下保持300秒，以研究组织的黏弹性应力松弛响应。
  6. 在完成应力松弛测试后，立即以1%/s的速率拉伸组织，直至发生力学失效。
  7. 记录失效位置，并通过测试后确认样品仍保留在夹具内来验证未发生滑移（图1H）。

3. 数据采集

  1. 预处理过程中不得采集任何数据。
  2. 使用任意数码相机以不低于每秒30帧的速度记录应力松弛和破坏测试的视频。
  3. 在应力松弛和破坏测试期间，使用数据采集软件（见材料表）以每秒250个样本的采样率采集时间（s）、载荷（N）和位移（mm）数据。
  4. 将采集的数据保存为.csv文件，并按照第4步所述用于数据分析。
  5. 在应力松弛前、应力松弛后以及破坏后，采集夹持组织的静态图像（图2）。

4. 数据分析

  1. 数据输入
    1. 下载并安装 MATLAB 数据分析软件（参见材料表），包括“优化”和“图像处理”工具箱。
    2. 下载压缩文件夹（补充代码文件 1），其中包含 MATLAB 代码和一个样本数据集，用于解释数据分析步骤。
    3. 进入下载的压缩文件夹并解压其内容。
    4. 打开MATLAB，并将解压后的文件夹设置为工作目录。确保工作目录包含如下所述的文件夹和文件，命名方式见下文注释。确保该工作目录中不包含其他额外的文件夹或文件，以免干扰代码运行并导致错误。
      注：(1) 失效（松弛后），(2) 仅失效，(3) 松弛，(4) calc_relax_failure.m，(5) main_relax_failure.m，(6) testingDates.xlsx。
    5. 进入仅失效文件夹。
      注：此文件夹中的数据来源于本研究的对照组，即在 0% 延伸率条件下经历机械失效的气管样本的生物力学数据。
    6. 将特定测试日期的样本数据存储在一个 Microsoft Excel 文件中，文件命名格式如下：mmddyy。例如，2022 年 4 月 30 日测试的所有对照组气管样本数据必须存储在仅失效 | 043022.xlsx中。
      注：请注意，在本研究中，所有生物力学测试均在同一天完成；但如果数据来自多个测试日期，则需为每个测试日期创建一个新的 Microsoft Excel 文件，并按上述命名规则命名。
    7. 打开仅失效 | 043022.xlsx，确认其中包含多个工作表标签，每个标签包含在该特定日期（即 2022 年 4 月 30 日）进行机械失效测试的每个样本的原始数据。
    8. 确保样本按以下格式命名：[样本类型]_[样本编号]_[预拉伸应变水平]%。
      注：例如，在本研究中，对照组气管样本在轴向或周向加载下进行机械失效测试，且未经历任何预松弛过程。因此，这些样本的命名格式分别为TA_1_0%和TC_1_0%。其中“0%”表示无预拉伸。实验组气管样本首先在 10% 的固定延伸率下进行轴向或周向加载，以评估黏弹性应力松弛响应，随后进行机械失效测试。因此，这些样本的命名格式为TA_1_10%和TC_1_10%（请参见步骤 4.1.16 和步骤 4.1.23，分别代表轴向和周向加载条件）。
    9. 选择工作表标签TA_1_0%。确保原始数据的列标题与下文注释中加粗显示的内容完全一致。
      注：(1) 时间 (sec)，(2) 载荷 (N)，(3) 位移 (mm)，(4) 直径 (mm)（步骤 1.7），(5) 平均横截面积（厚度 × 宽度，mm2）（在步骤 1.5 和步骤 1.7 中获得），(6) 初始长度 (mm)（步骤 2.3）。
    10. 关闭当前 Microsoft Excel 文件仅失效 | 043022.xlsx。
    11. 返回数据分析软件的工作目录。
    12. 进入松弛文件夹。
      注：此文件夹中的数据来源于本研究的实验组，即在 10% 固定延伸率下进行 300 秒应力松弛测试的气管样本的生物力学数据。
    13. 将特定测试日期的实验组样本数据存储在一个 Microsoft Excel 文件中，命名格式如下：mmddyy。
      注：例如，2022 年 4 月 30 日测试的所有实验组气管样本数据必须存储在松弛 | 043022.xlsx中。更多细节请参见步骤 4.1.6 的注释。
    14. 打开松弛 | 043022.xlsx，确认其中包含多个工作表标签，每个标签包含在该特定日期（即 2022 年 4 月 30 日）测试的实验组中每个样本的原始载荷松弛数据。
    15. 暂停并注意，此 Microsoft Excel 文件中各工作表标签所对应的样本随后均在拉伸机械载荷下进行了机械失效测试。
      注：每个样本对应的失效数据必须存储在失效（松弛后）文件夹中，详见步骤 4.1.20。
    16. 确保样本命名方式符合步骤 4.1.8 中描述的规则。
    17. 逐一查看当前 Microsoft Excel 文件中的每个工作表标签，并参考步骤 4.1.9，确保由任一工作表标签指示的每个样本的原始载荷松弛数据格式正确。
    18. 保存并关闭当前 Microsoft Excel 文件松弛 | 043022.xlsx。
    19. 返回数据分析软件的工作目录。
    20. 进入文件夹失效（松弛后）。
    21. 确保存在与松弛文件夹中日期相同的 Microsoft Excel 文件（有关对应各测试日期的 Microsoft Excel 文件命名详情，请参见步骤 4.1.6）。
      注：当前文件夹（失效（松弛后））中的数据为经历 10% 固定延伸率下 300 秒应力松弛测试后气管样本对应的原始机械失效数据。
    22. 打开失效（松弛后）| 043022.xlsx，确认其中包含多个工作表标签，每个标签包含与松弛 | 043022.xlsx中相同样本的原始机械失效数据。
    23. 确保样本命名方式符合步骤 4.1.8 中提到的规则，并且标签与松弛 | 043022.xlsx中的标签一致。
      注：例如，当前 Microsoft Excel 文件中TA_1_10%的数据代表在 10% 固定延伸率下进行 300 秒应力松弛测试后，1 号气管样本在轴向加载下的原始机械失效数据。
    24. 逐一查看每个工作表标签，并参考步骤 4.1.9，确保每个样本的原始机械失效数据的列标题格式正确。
    25. 关闭当前 Microsoft Excel 文件失效（松弛后）| 043022.xlsx。
    26. 返回数据分析软件的工作目录。
    27. 根据需要，对其他测试日期重复执行步骤 4.1.5–4.1.26。
    28. 打开 Microsoft Excel 文件testingDates.xlsx，该文件将指导代码分析用户指定的测试日期。
    29. 在第一列中以如下格式列出测试日期：mm/dd/yy。
    30. 在第二列中使用Y（表示“是”）或N（表示“否”）标明该测试日期是否存在来自实验组（先进行应力松弛再进行机械失效）的样本。
    31. 在第三列中使用Y（表示“是”）或N（表示“否”）标明该测试日期是否存在来自对照组（直接进行机械失效）的样本。
    32. 根据需要，对其他测试日期重复执行步骤 4.1.29–4.1.31。
    33. 保存并关闭当前 Microsoft Excel 文件testingDates.xlsx。
    34. 返回数据分析软件的工作目录。
    35. 打开主脚本文件main_relax_failure.m。
    36. 点击软件界面上的大绿色箭头运行代码，或在命令窗口中输入run main_calc_relax。
    37. 当系统提示时，输入以逗号分隔的实验组固定延伸率水平（单位：%），然后点击确定。
      注：在本研究中仅使用了一种应力松弛延伸率，即输入10。无需为对照组包含 0%。但如果数据来自多个延伸率水平（例如 10% 和 20%），则输入10,20。
    38. 当系统提示时，输入以逗号分隔的实验组应力松弛测试持续时间（单位：秒），然后点击确定。
      注：在本研究中，气管样本在固定延伸率下保持 300 秒，因此输入300。但如果数据来自多个应力松弛持续时间（例如 90 秒和 300 秒），则输入90,300。
  2. 黏弹性应力松弛响应
    1. 使用代码（main_relax_failure.m）将载荷-时间数据（代码第 144 行）通过以下公式转换为名义应力-时间数据19：figure-protocol-1，其中 σ 表示应力（兆帕 [MPa]），F 表示周向或轴向载荷（牛顿 [N]），A0 表示初始横截面积（平方毫米 [mm2]）。
    2. 使用代码（main_relax_failure.m）确定在 300 秒松弛测试开始时施加 10% 固定延伸率后样本的峰值载荷和应力幅值（代码第 138 和 146 行）。
      注：这些值此后分别称为初始峰值载荷和初始峰值应力。
    3. 使用代码（main_relax_failure.m）通过以下公式计算 300 秒时应力（或载荷）的百分比下降（代码第 141 和 149 行）：figure-protocol-2，其中 Rel% 表示松弛百分比，σ(0+) 表示初始峰值应力（或初始峰值载荷）， σ(300) 表示 300 秒松弛后的记录应力（或载荷）水平。
    4. 参考代码（main_relax_failure.m）使用双项 Prony 级数指数衰减模型对黏弹性应力松弛响应进行建模（代码第 152–161 行）。该模型常用于描述多种生物组织的黏弹性行为，包括不同软骨性气道层次（气管、大支气管和小支气管）21,22。
      注：计算得到的应力值 [σ(t)] 被归一化，以生成以下简化松弛函数：figure-protocol-3 且 G(0) = 1。为比较黏弹性应力松弛响应，采用非线性最小二乘回归对 G(t) 进行曲线拟合：figure-protocol-4，其中 t 为应力松弛保持期间的时间，g 为松弛系数， τ1 和 τ2 分别表示描述组织短期（初始）和长期（平衡）行为的松弛时间（单位：秒）。
  3. 机械失效响应
    1. 使用代码（main_relax_failure.m）将拉伸试验机记录的载荷-位移数据（代码第 143–144 行）通过下文注释中提到的公式转换为名义应力-应变数据。
      注：figure-protocol-5，其中 σ 表示名义应力（MPa），F 表示周向或轴向载荷（N），A0 表示初始横截面积（mm2）；figure-protocol-6，其中 figure-protocol-7 表示结果应变，ΔL 表示位移，L0 表示样本的初始长度。对于在应力松弛保持后进行拉伸失效测试的样本，L0 表示组织的预拉伸长度。例如，样本 3（初始长度为 8 mm）被预拉伸 10%，因此在计算结果应变值时，L0 取为 8.8 mm19。
    2. 使用函数（calc_relax_failure.m）识别最大载荷（即失效载荷）及对应的失效位移，以及最大应力（即失效应力）和对应的失效应变（代码第 33 和 61–63 行）。
    3. 使用函数（calc_relax_failure.m）丢弃失效载荷之后的载荷-位移数据（第 34 行）。
    4. 使用函数（calc_relax_failure.m）绘制载荷-位移曲线，并在提示时手动选择曲线线性区域中的两个点，以估算组织刚度（N/mm）（代码第 37–58 行）。
      注：由于载荷-位移曲线通过样本的横截面积和初始长度归一化后得到应力-应变曲线，代码利用用户在载荷-位移曲线上选择的 x 和 y 坐标，通过以下公式计算弹性模量（MPa）19：figure-protocol-8，其中 E 表示弹性模量，x 和 y 表示在载荷-位移曲线上选择的坐标，A0 表示横截面积，L0 表示机械失效开始时样本的长度，Δσ 和 Δfigure-protocol-9 分别表示失效响应线性区域内的应力和应变变化量。
    5. 对每个样本重复执行步骤 4.3.4。
  4. 数据输出
    1. 代码成功运行后，确保计算结果以 Microsoft Excel 文件形式保存在数据分析软件的工作目录中，文件命名格式如下：relax_failure_results_mmddyy.xlsx，其中mmddyy将被代码运行日期替换。

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结果

图1显示了夹持部位附近的组织失效情况以及夹具内部存在的组织，证实了在拉伸测试过程中未发生滑移。图2展示了在测试样本的拉伸试验中观察到的各种断裂位置，包括上端或下端夹持处，或沿组织长度方向的断裂。数据分析结果总结于图3-4及表1-2中。气管样本在轴向或周向预拉伸至10%应变后的应力松弛响应如图3所示。根据这些松弛曲线，计算了初始峰值载荷和应力、在300秒保持期间应力下降的百分比，以及两参数Prony级数松弛函数中的时间常数t1和t2。这些黏弹性参数列于表1中。在无预拉伸或10%预拉伸条件下，气管样本在轴向或周向载荷作用下进行破坏测试的应力-应变响应如图4

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讨论

极少有研究报道气管的应力松弛特性21,23。目前仍需开展更多研究以进一步加深对气管组织时间依赖性响应的理解。本研究提供了开展此类研究的详细步骤；然而，为确保测试结果可靠，必须严格保证以下关键步骤：（1）保持组织充分水合，（2）环向和纵向样本中组织类型（软骨环数量和肌肉）分布相似，（3）夹持样本时不施加预拉伸，（4）利用样本厚度和宽度估算横截面积，用于在生物力学拉伸测试中计算组织应力，（5）正确夹持组织样本，（6）使用夹持样本的标距长度设定1%/s的应变率进行拉伸测试，以及（7）测试后检查夹具内是否存在组织残留，以确认无滑脱现象。此外，若需排除故障，可能需要重新启动数据采集软件，以重新建立与测试设备控制器的通信。

本研究还详细描述了用于研究气管应力松弛行为的测试方法、数据分析过程以及定制的 MATLAB 代码（补充代码文件 1）。此前尚无研究提供如此全面的信息。此外，在教育方面，本研究中所述方法可轻松整合为工程课程中应力松弛实验的教学...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究的资助来自美国国立卫生研究院尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所，项目编号为 R15HD093024，以及美国国家科学基金会职业奖，编号为 1752513。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
一次性安全手术刀Fine Science Tools Inc10000-10
eXpert 7600ADMET Inc.N/ANorwood, MA
镊子 Fine Science Tools Inc11006-12 和 11027-12 或 11506-12
Gauge SafeADMET Inc.N/A免费下载
Image JNIHN/A开源
编程软件 - MATLAB MathworksN/A版本 2018A
剪刀 Fine Science Tools Inc14094-11 或 14060-09
无菌磷酸盐缓冲液 Millipore, Thomas ScientificMFCD00131855

参考文献

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