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利用等温滴定量热法测定DNA适配体与四环素结合的热力学和动力学参数

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DOI：

10.3791/64247

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2022年8月23日

 ,  , 
1Aptagen LLC

本文内容

摘要

本实验方案描述了使用等温滴定 calorimetry（ITC）分析DNA适配体与四环素结合的结合与解离动力学，包括样品制备、标准品与样品的运行以及结果数据的解析。

摘要

确定适配体与其靶标之间的结合亲和力和结合行为，是选择和应用适配体过程中最关键的步骤。由于适配体与小分子之间存在显著差异，科研人员需要投入大量精力来表征其结合特性。等温滴定 calorimetry（ITC）是实现这一目标的有力方法。ITC 不仅能够测定解离常数（Kd），还能提供溶液中两个分子相互作用的焓变和结合化学计量比。该方法采用无标记分子进行连续滴定，并记录每次滴定引发的结合事件所随时间释放的热量，因而可灵敏地检测大分子与其小分子靶标之间的结合过程。本文介绍了一种利用 ITC 测定特定适配体与小分子靶标四环素结合的逐步操作流程。此实例验证了该技术的通用性及其在其他应用中的潜力。

引言

适配体是通过体外筛选进化过程获得的单链DNA或RNA片段，能够以高亲和力和特异性结合特定靶标1,2，可作为先进的识别元件或化学抗体使用3,4,5。因此，适配体与其靶标之间的结合亲和力和特异性在其筛选与应用中起着关键作用，而等温滴定 calorimetry（ITC）已被广泛用于此类表征。目前已有多种方法用于测定适配体的亲和力，包括ITC、表面等离子共振（SPR）、比色滴定法、微尺度热泳法（MST）以及生物膜干涉技术（BLI）。其中，ITC是近年来用于测定溶液中两种分子间热力学和动力学结合参数的先进技术之一。该方法利用无标记分子进行连续滴定，并实时记录每次滴定过程中因结合事件所释放的热量6,7。与其他方法不同，ITC可同时提供结合亲和力、结合位点数以及热力学和动力学结合参数 （图1A）。基于这些初始参数，可通过以下关系式计算吉布斯自由能变化和熵变：

ΔG = ΔH-TΔS

这意味着等温滴定量热法（ITC）可提供分子相互作用的完整热力学特征，以阐明结合机制（图1B）。由于适配体与靶标分子之间的尺寸差异显著，测定小分子与适配体之间的结合亲和力具有较大难度。与此同时，ITC能够在无需标记或固定分子的情况下实现高灵敏度测量，从而可在测量过程中保持适配体和靶标分子的天然结构。凭借上述优势，ITC可作为表征适配体与小分子靶标之间结合相互作用的标准方法。

经Gu课题组筛选后，该适配体已整合到多种平台中，包括电化学适配体生物传感器、竞争性酶联适配体分析法和微孔板，可实现对四环素的高通量检测8,9,10。然而，目前对其结合特性了解尚不充分，难以选择合适的检测平台8；因此，值得采用等温滴定量热法（ITC）来表征该适配体与四环素之间的结合特性。

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方案

注意：图2展示了等温滴定量热法（ITC）实验的主要步骤，用于测定DNA适配体与四环素之间的热力学和动力学结合特性。

1. 样品制备

注意：进行等温滴定量热法（ITC）实验时，适配体和配体的样品必须使用相同的缓冲液配制，以避免样品池与注射器中不同缓冲液混合时产生热量释放。通常通过将所有材料透析至同一缓冲液中来实现。缓冲液置换采用基于3 kDa分子量截断值（MWC）浓缩管说明书的方案，并稍作修改，具体如下：

  1. 使用制造商提供的 1× PBS 缓冲液（pH 7.4）活化透析柱（3 kDa 分子量截断值，MWC）的膜，具体步骤如下：加入 1× 缓冲液（PBS），在室温下平衡 10 分钟，然后在 5,000 × g 条件下离心 15 分钟。
  2. 弃去缓冲液，将 500 µL 适配体样品加入柱中，在 5,000 × g 条件下离心，重复此步骤 4 次，以将原始缓冲液置换为 1× PBS。当缓冲液通过膜时，所有分子量小于 3 kDa 的分子将穿过膜，而适配体则保留在膜的上层。
  3. 使用移液器收集透析后的 DNA 适配体，并转移至新的 1.5 mL 离心管中。
  4. 收集最后一次的穿流缓冲液用于溶解四环素。四环素粉末纯净且分子量小，因此无需透析。但应使用之前用于 DNA 透析的同一缓冲液溶解靶标，以确保注射器中实验所用缓冲液与参比池中的缓冲液一致。
  5. 再次使用紫外-可见分光光度计测定适配体浓度，并用最后一次置换的缓冲液将浓度调整为 40 µM 四环素和 2 µM 适配体。
  6. 通过以下程序对 DNA 适配体进行折叠：90 °C 加热 10 分钟，4 °C 冷却 10 分钟，然后恢复至室温并孵育 20 分钟。
  7. 将折叠后的适配体和透析后的四环素置于脱气站或在 25 °C 下以 600 mmHg 的真空泵脱气 25 分钟，以去除溶解的气体。

2. 清洗仪器并运行测试试剂盒

  1. 清洗溶剂端口，确保整个样品通路畅通无阻。通过弃去废液，并向各端口加入纯甲醇、水和缓冲液进行清洗。每个端口需加入超过250 mL溶液，以确保有足够的清洗液量。
    注意：清洗过程由用户可编程的ITC控制软件自动完成。
  2. 通过使用缓冲液滴定缓冲液（例如，1x PBS滴定1x PBS）运行ITC，测试仪器的洁净程度。
    注意：在微小的缓冲液对缓冲液注射峰之间应可见正常的噪声基线。当滴定注射器和套管充分清洁且完全干燥时，基线将保持稳定；基线的上升或下降表明仪器污染或仪器内部存在气泡，需在运行实际样品前予以纠正。
  3. 使用包含EDTA和CaCl2的标准试剂盒（图3），按照制造商提供的说明并采用默认程序，测试仪器的准确性。

3. 运行样品以确定适配体与四环素之间的结合

  1. 设置运行参数：搅拌速率为 200 rpm，温度为 25 °C，使用 2 µM 适配体和 40 µM 四环素，共进行 30 次注射，每次 2.0 µL，延迟时间为 180 s。
  2. 使用运行程序计算器检查所需体积。根据此运行参数，将 230 µL 浓度为 40 µM 的四环素加入 ITC 注射器，将 485 µL 浓度为 2 µM 的适配体加入 ITC 样品池，进行 ITC 测量。
  3. 使用移液器将透析后的四环素加入注射器样品板，并将折叠好的适配体加入样品池，注意避免产生气泡。
  4. 点击软件上的开始按钮，启动 ITC 仪器运行。
    ​注意：在手动填充参比池和滴定剂样品板后，ITC 仪器的运行过程完全自动化。

4. 使用软件分析数据

  1. 双击打开数据分析软件，开始分析数据。
  2. 打开已保存的原始数据路径，了解结合趋势。
  3. 打开建模选项卡，使用不同的结合模型拟合数据曲线，找到最佳匹配模型。随后，软件将自动计算等温滴定量热（ITC）热谱图及多种热力学参数，包括焓变（ΔH）、熵变（ΔS）、自由能（ΔG）、平衡结合常数（Ka）和化学计量比。
  4. 收集由数据和拟合模型确定的热力学参数及相关模型信息。
  5. 生成报告，包括等温滴定量热（ITC）热谱图和各项热力学参数的图表，如图4和表1所示。

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结果

等温滴定量热法（ITC）可提供双分子相互作用的精确解离常数（Kd）、结合化学计量比以及热力学参数6。在此示例中，Kim 等人9,11筛选出的适配体与四环素结合，其结合亲和力分别为 Kd 1 = 13 µM，Kd 2 = 53 nM。有趣的是，该结合常数通过平衡透析法测定，报道的 Kd 值为 63.3 nM，与优势结合位点（位点 2）的数值相差不大。ITC 的拟合模型和化学计量比结果表明，该适配体通过 2:1 的结合比例和连续结合模型与四环素结合（图 4，表 1）。

通过ITC测量确定的位点2的热力学参数（ΔH = -1200 kcal/mol，-TΔS = 99.75 ...

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讨论

本文所述方法根据TA Instruments的说明进行了修改，已足以确定本中心多种选定适配体与靶标之间的结合亲和力及热力学参数。该实验流程中的关键步骤包括：更换缓冲液以使靶标与配体相匹配，使用合适的参数运行样品，以及选择适当的结合拟合模型来分析数据。持续记录放热过程需要消除所有噪声热源，例如缓冲液不匹配、样品池和注射器不洁净，以及样品内部存在气泡等问题。在缓冲液置换步骤中，最好使用透析膜或离心柱的最后一次透析缓冲液或穿流缓冲液来溶解配体，因为直接置换小分子的缓冲液成本较高。

大多数其他结合亲和力测定方法均假设适配体与配体之间存在1:1的结合比例。然而，由于结合行为以及小分子与适配体之间尺寸差异显著，1:1结合模型并不总是准确的14,15。在这方面，等温滴定量热法（ITC）可提供有关结合化学计量比的数据，从而确定结合位点的数量，并揭示结合行为的信息7,15

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究得到了Aptagen LLC提供的研发资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG
C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG
TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'		Integrated DNA Technologies, Inc该序列源自Gu的研究，该研究未使用等温滴定量热法（ITC）测定Kd值（参见参考文献8和9）
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold CellsTA Instruments61000.901等温滴定量热系统
CaCl2Avantor (VWR)E506-100ML氯化钙水溶液，1 M，生物技术级，无菌
离心机Eppendorf5417REppendorf 5417R在安全性、可靠性和易用性方面表现卓越。采用无刷电机，最高转速可达16,400 RPM，最大相对离心力可达25,000 × g，维护极为简便。
Complete Degassing Station (110/230V)TA Instruments6326该脱气装置提供一个独立的搅拌平台、真空室、真空接口、温度控制和电子计时器，用于正确的样品制备。
EDTATekNovaE0375EDTA 500 mM，pH 7.5
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计ThermoFisherND-ONE-W紫外-可见分光光度计
Nanosep、Nanosep MF 和 NAB 离心浓缩装置Pall LaboratoryOD030C34截留分子量为3 kDa的浓缩管
PBS pH 7.4IBI ScientificIB70165缓冲液，含磷酸钠、氯化钠、磷酸钾和氯化钾，超纯级，经0.2 µm滤膜过滤除菌，并在121 °C下高压灭菌超过20分钟。
Posi-Click 1.7 mL 大盖微量离心管labForce (a Thomas Scientific Brand)1149K01
四环素盐酸盐EMD Millipore CorperationCAS64-75-5

参考文献

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