小鼠骨髓造血干细胞和祖细胞以及基质生态位细胞的流式细胞术分析

摘要

在这里，我们描述了一种简单的方案，用于将小鼠骨髓细胞分离和染色为表型造血干细胞和祖细胞以及支持生态位内皮和间充质干细胞。还包括富集位于内膜和中央骨髓区域的细胞的方法。

摘要

骨髓（BM）是在骨骼中发现的软组织，造血是产生新血细胞的过程，主要发生于此。因此，它含有造血干细胞和祖细胞（HSPC），以及有助于维持和调节HSPC的支持基质细胞。 血液学和其他BM疾病通过直接影响造血细胞和/或通过改变BM生态位来破坏造血。在这里，我们描述了一种通过流式细胞术对小鼠BM HSPC和基质生态位群体进行表型分析来研究健康和恶性肿瘤造血的方法。我们的方法详细介绍了在内膜和中枢BM组分中富集BM细胞所需的步骤，以及适当的门控策略，以确定参与HSPC调节的两种关键生态位细胞类型，内皮细胞和间充质干细胞。这里提出的表型分析可以与小鼠突变体，疾病模型和功能测定相结合，以表征HSPC区室及其生态位。

引言

流式细胞术是表征和前瞻性分离免疫细胞和造血细胞的宝贵方法。它也越来越多地用于分析不同组织的基质和上皮群体。造血干细胞（HSC）具有自我更新和多能性的独特特性。在成年哺乳动物中，HSC主要存在于骨髓（BM）中，在那里它们接收来自周围微环境或生态位的静止和生存^信号1。HSC根据功能测定²正式定义。然而，一些具有里程碑意义的论文已经证明了流式细胞术在鉴定HSCs方面的有用性。通过使用有限的细胞表面标志物，可以区分HSC³中高度富集的造血群体。因此，流式细胞术是干细胞领域的中心方法。它已被广泛用于评估推定的生态位细胞类型和生态位因子对HSC的影响。通过将流式细胞术与成像和功能测定相结合，已经表明HSC得到了血管周围间充质干细胞（MSCs）和内皮细胞（ECs）的关键支持。BM MSCs是一个异质性群体，具有不同的细胞因子贡献⁴，但众所周知，瘦素受体（LepR）⁺ MSCs是关键的生态位细胞¹。BM EC也是高度异质的，可以是正弦波，小动脉和H型/^{过渡血管的一部分}5。不同的研究表明，这些不同的ECs的细微贡献。例如，内硬性正弦 EC 在空间上更接近静态 HSC⁶，而活性氧水平较低的非迁移性 HSC 位于小动脉^{EC 7} 附近。壁龛的内膜与中心位置也非常重要。H型内膜血管与血管周围基质细胞有关，血管周围基质细胞随着年龄的增长而丢失，导致HSC^丢失8。在急性髓系白血病中，中枢EC扩张，而内膜血管和内硬性HSC^丢失9。

该领域的大多数研究都集中在造血本身和细胞对HSC的外在调节上。然而，人们越来越认识到，有必要更好地表征调节其他祖细胞（即多能祖细胞（MPP））的生态位，特别是考虑到它们是稳态造血的主要驱动因素¹⁰。与固定的分层结构相比，最近的研究表明，造血是一个连续体，其中HSC在早期分化为有偏差的^MPP11。MPPs以不同的分类方案命名¹²，但国际实验血液学会（ISEH）最近的一篇共识论文提出，MPPs被区分为早期MPP，并根据其淋巴（MPP-Ly），巨核细胞和红系（MPP-Mk/E）和骨髓（MPP-G/M）偏差¹³。流式细胞术的使用对于进一步研究BM生态位在这些群体调节中的重要性至关重要。目前的流式细胞术方法使用可变门控策略来区分HSPC，并使用不一致的标记物鉴定基质细胞，即EC。当前方法的目标是提供一种简单且可重现的BM染色工作流程，以鉴定HSPC亚群，异质EC组和LepR ⁺ MSC。我们认为，尽管该技术与先前报道的方法（参见例如参考^文献14）相当，但为两个功能性骨髓区域的造血细胞（内硬膜和中央BM^8，15）以及BM基质生态位细胞的表型分析提供了一种更新且易于实施的方案。

方案

该协议中使用的动物在12小时明暗循环和温度受控环境中，在特定无病原体条件下饲养在i3S动物设施中。免费提供标准的啮齿动物食物和水。所有动物都根据欧洲实验动物科学协会联合会概述的实验动物护理和处理标准（欧盟指令2010/63 / EU）接受了人道护理。对动物进行的实验程序（安乐死）得到了i3S动物伦理委员会（参考文献DD_2019_15）和Direção-Geral de Alimentação e Veterinária的批准。本协议中使用的材料的详细信息可以在 材料表中找到。

1. 溶液制备和混合染色

1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）:将五片PBS片溶解到1升蒸馏水中。在室温 （RT） 下储存。
2. PBS 2% 胎牛血清 （FBS）:将 10 mL FBS 加入 500 mL PBS 中。储存在4°C。
3. 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液 （1x）:将 50 mL 的 10x RBC 裂解缓冲液加入 450 mL 去离子水中。储存在4°C。
4. 胶原酶 IV 和分散酶 II 溶液:将 30 mg 胶原酶 IV 和 60 mg 分散酶 II 溶解在 30 mL HBSS 中，以获得 1 mg/mL 胶原酶 IV 和 2 mg/mL 分散酶 II 溶液。使用前准备新鲜的。
5. Fc受体阻断液:将10μL纯化的抗小鼠CD16/32抗体加入490μLPBS 2%FBS中。新鲜或前一天准备。储存在4°C直至使用。
6. 荧光细胞活力染料染色溶液:将 2 μL 荧光细胞活力染料加入 1 mL PBS 中。使用前准备新鲜的。
7. 生物素谱系混合物:混合 100 μL 以下每种抗体:生物素抗小鼠 CD3ε、生物素抗小鼠 CD4、生物素抗小鼠 CD8a、生物素抗小鼠/人 CD11b、生物素抗小鼠/人 CD45R/B220、生物素抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C （Gr-1） 和生物素抗小鼠 TER-119/红系细胞。储存在4°C直至使用。
8. HSC 初级染色混合物:将 10 μL 生物素谱系混合物、10 μL 免疫荧光标记的 510 抗小鼠 CD150 （SLAM）、10 μL 藻红蛋白 （PE） 抗小鼠 Flk2 （CD135）、10 μL 佩氏氨酸-叶绿素蛋白 （PerCP） 抗小鼠 Ly-6A/E （Sca-1）、10 μL PE/花青素 7 抗小鼠 CD48 和 10 μL 别藻蓝蛋白 （APC）/花青7 抗小鼠 CD117 （c-kit） 加入 940 μL PBS 2% FBS。新鲜或前一天准备。储存在4°C避光直至使用。
9. 基质原代染色混合物:将 5 μL 小鼠瘦素 R 生物素化抗体、6.7 μL PE 抗小鼠内粘蛋白抗体、10 μL PerCP 抗小鼠 Ly-6A/E （Sca-1）、4 μL PE/花青素7 抗小鼠 CD31、10 μL APC/花青素 7 抗小鼠 CD45 和 10 μL APC/花青素 7 抗小鼠 TER-119/红系细胞加入 954 μL PBS 2% FBS 中。新鲜或前一天准备。储存在4°C避光直至使用。
10. HSC/基质二次染色溶液:将 1 μL APC 链霉亲和素加入 1 mL PBS 2% FBS 中。新鲜或前一天准备。储存在4°C避光直至使用。
11. ECs染色鸡尾酒:将10 μL PE抗小鼠内切粘素抗体，10 μL PerCP抗小鼠Ly-6A / E（Sca-1），10 μL PE / Cyanine7抗小鼠CD31，10 μLAlexa Fluor 647抗小鼠CD54 / ICAM-1，10 μL APC / Cyanine7抗小鼠CD45和10 μL APC / Cyanine7抗小鼠TER-119 /红系细胞添加到940μL PBS 2%FBS中。新鲜或前一天准备。储存在4°C避光直至使用。
12. DAPI 染色溶液:将 1 滴 DAPI 试剂加入 500 μL PBS 中。使用前准备新鲜的。

2. 样品提取

1. 通过颈椎脱位对动物实施安乐死（用于产生本研究中提供的数据的动物的详细信息可在 补充表1中找到）。将动物腹部朝上放在培养皿上，并喷洒70%乙醇。用剪刀在腹部上方切开，将皮肤一直拉到脚踝。
2. 抓住一条腿，用剪刀切开它的底部（腿和臀部之间的关节所在），将其与动物分开。这一步也将作为安乐死的二级确认方法。通过切割脚踝将脚从腿上移开。将腿放入冰冷的PBS 2%FBS中。如果需要，用另一条腿重复该步骤。
3. 抓住髋骨，用剪刀剪在髋骨后面，将其与动物分开。将髋骨放入冰冷的PBS 2%FBS中。如果需要，对另一块髋骨重复该步骤。
4. 将腿和髋骨放入培养皿中，并使用无菌手术刀清洁骨头。用手术刀切开膝盖，将胫骨和股骨分开。将干净的骨头放入冰冷的PBS 2%FBS中。

3. 用于分析总骨髓中造血细胞群的样品处理

1. 将股骨或胫骨放入装有冰冷的PBS 2%FBS的研钵中，并使用研杵将其轻轻按压在研钵壁上来压碎骨头。BM细胞被释放到砂浆中所含的溶液中。
2. 使用 10 mL 移液器上下移取所得细胞悬液，使其均质化并通过放置在管顶部的 40 μm 细胞过滤器转移到 50 mL 管中。
3. 如果此时碎骨看起来不白，则向研钵中加入更多的PBS 2%FBS并重复粉碎，然后上下移液并通过相同的40μm细胞过滤器将溶液转移到相同的50 mL管中。
4. 用更多的PBS 2%FBS冲洗砂浆，并通过相同的40μm细胞过滤器将溶液转移到相同的50 mL管中。将50mL管在4°C下以500× g 离心5分钟。
5. 弃去上清液，并通过上下移液数次在室温下将细胞沉淀重悬于 5 mL 红细胞裂解缓冲液 （1x） 中。在室温下孵育 2 分钟后，加入 15 mL PBS 2% FBS。
6. 将50mL管在4°C下以500× g 离心5分钟。 如果细胞沉淀看起来仍然发红，请返回步骤3.5。如果没有，则弃去上清液，将沉淀重悬于 200 μL PBS 中，并将细胞悬液转移到 96 孔 V 底板的孔中进行染色。
7. 在4°C下以500× g 离心板3分钟。 通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于200μL荧光染料染色溶液中。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
8. 在4°C下以500× g 离心板3分钟。 通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于200μLPBS 2%FBS中以洗涤。
9. 在4°C下以500× g 离心板3分钟，通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于100μLFc受体封闭溶液中。将板在4°C避光孵育10分钟。
10. 加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟，通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于100μLHSCs初级染色混合物中。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
11. 加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟，通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于100μLHSCs二次染色溶液中。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
12. 加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟，并通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液。
13. 将沉淀重悬于 250 μL PBS 2% FBS 中，并通过 40 μm 细胞过滤器将细胞悬液转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。在冰上避光，直到流式细胞术分析。
    注意:如果有兴趣确定造血细胞群的绝对数量，请在细胞仪¹⁶中分析之前将钙碧珠添加到聚苯乙烯管中。

4. 用于分析总骨髓中基质细胞群的样品处理

1. 将股骨或胫骨放入装有冰冷的PBS 2%FBS的研钵中，并使用研杵将其轻轻按压在研钵壁上来压碎骨头。用剪刀剪下 P1000 吸头的尖端，并用它来将研钵的所有内容物转移到 50 mL 管中（不要穿过细胞过滤器）。
2. 在4°C下以500× g 离心50mL管5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于3mL胶原酶IV和分散酶II溶液中。将管在37°C孵育40分钟。
3. 用 PBS 2% FBS 将试管加满至 25 mL，然后涡旋混合。通过 100 μm 细胞过滤器将 50 mL 管的内容物转移到新的 50 mL 管中。将 15 mL PBS 2% FBS 加入旧的 50 mL 管中，并通过相同的细胞过滤器将溶液转移到相同的新 50 mL 管中。在4°C下以500×g离心5分钟。
4. 弃去上清液，并通过上下移液数次在室温下将细胞沉淀重悬于 5 mL 红细胞裂解缓冲液 （1x） 中。在室温下孵育 2 分钟后，加入 15 mL PBS 2% FBS。
5. 将50mL管在4°C下以500× g 离心5分钟。 如果细胞沉淀看起来仍然发红，请返回步骤4.4。如果没有，则弃去上清液，将沉淀重悬于200μL PBS 2%FBS中，并将细胞悬液转移到96孔V底板的孔中进行染色。在4°C下以500× g 离心板3分钟。
6. 如果进行基质染色，请继续执行步骤4.7。如果进行EC染色，请继续执行步骤4.12。
7. 通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 μL 基质初级染色混合物中。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
8. 加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟，通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于100μL基质二次染色溶液中。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
9. 加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟。 通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液。
10. 将沉淀重悬于 250 μL PBS 2% FBS 中，并通过 40 μm 细胞过滤器将细胞悬液转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。放在冰上避光。
11. 在进入细胞仪之前，将 35 μL DAPI 染色溶液添加到含有细胞悬液的管中以进行流式细胞术分析，并将管在室温下在黑暗中孵育 5 分钟。孵育后，保持冰上避光，直到流式细胞术分析。
12. 通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 μL ECs 染色鸡尾酒中。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
13. 加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟。
14. 通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液。将沉淀重悬于 250 μL PBS 2% FBS 中，并通过 40 μm 细胞过滤器将细胞悬液转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。放在冰上避光。
15. 在进入细胞仪之前，将 35 μL DAPI 染色溶液添加到含有细胞悬液的管中以进行流式细胞术分析，并将管在室温下在黑暗中孵育 5 分钟。孵育后，保持冰上避光，直到流式细胞术分析。
    注意:如果有兴趣确定基质和内皮细胞群的绝对数量，请在细胞仪¹⁶中分析之前将钙碧珠添加到聚苯乙烯管中。

5. 用于分析粉碎和冲洗BM中造血细胞群的样品处理

1. 将股骨放在培养皿上，并使用无菌手术刀切割骨头的末端。
2. 使用无死体积 0.5 mL 胰岛素注射器从每侧将 100 μL PBS 2% FBS 从骨内部穿过一次，并将溶液收集在含有 1 mL PBS 2% FBS 的微量离心管中，冲洗骨的中心部分（骨干）。随后，将细胞悬液转移到标记为冲洗BM的50 mL管中，该管含有4 mL PBS 2% FBS。继续在冰上。
3. 将骨头的末端放入装有冰冷的PBS 2%FBS的研钵中，并使用研杵将其轻轻压在砂浆壁上压碎。使用 10 mL 移液器上下移取所得细胞悬液，以均质化并通过 40 μm 细胞过滤器转移到标记为粉碎 BM 的 50 mL 管中。
4. 如果此时碎骨看起来不白，请在研钵中加入更多的PBS 2%FBS并重复粉碎。然后上下移液，并通过相同的40 μm细胞过滤器将溶液转移到相同的50 mL管（压碎的BM）中。
5. 用更多的PBS 2%FBS冲洗砂浆，并通过相同的40μm细胞过滤器将溶液转移到相同的50 mL管（压碎的BM）中。
6. 在4°C下以500× g 离心对应于冲洗和粉碎样品的50mL管3分钟。
7. 按照步骤3.5至3.13（第3节）处理冲洗和压碎的BM样品。

6. 制备用于流式细胞术分析的单色质控品（SCC）

1. 按照步骤3.1至3.6（第3节），从其中一只未用于主要分析的动物身上获得额外的骨头，将最终细胞悬液转移到含有1mL PBS 2%FBS的微量离心管中，而不是96孔V底板的孔中。
2. 将 100 μL 细胞悬液转移到 96 孔 V 底板的 8 孔中，将 100 μL 转移到含有 100 μL 标记为 DAPI SCC 的 PBS 2% FBS 的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，剩余的细胞悬液转移到含有 100 μL 标记为未染色的 PBS 2% FBS 的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。将管子放在冰上避光。
3. 在4°C下以500× g 离心板3分钟，并通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液。
4. 将一个沉淀重悬于 100 μL 荧光染料染色溶液中，其余沉淀重悬于 100 μL PBS 2% FBS 中。
5. 向PBS 2% FBS中细胞悬液的每个孔中加入0.5 μL以下抗体，除了添加2 μL的谱系抗体混合物和添加0.3 μL的PECy7 CD31抗体外（每孔一个抗体，主分析组合中使用的相同抗体或具有相似荧光强度和表位丰度的相同荧光团抗体）: 生物素谱系混合物，免疫荧光标记的510抗小鼠CD150（SLAM），PE抗小鼠Flk2（CD135），PerCP抗小鼠Ly-6A / E（Sca-1），免疫荧光标记的647抗小鼠CD54 / ICAM-1，PE / Cyanine7抗小鼠CD48和APC / Cyanine7抗小鼠CD117（c-kit）。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
6. 向每个孔中加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟，并通过将板翻转到吸收纸上来弃去上清液。
7. 重悬除与180μLPBS 2%FBS中的抗体谱系混合物孵育的细胞相对应的细胞外的所有沉淀，并通过40μm细胞过滤器将细胞悬液转移到5mL聚苯乙烯圆底管中。在冰上避光，直到流式细胞术分析。
8. 将与抗体谱系混合物一起孵育的细胞重悬于 100 μL HSC/基质二次染色溶液中。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。
9. 加入 100 μL PBS 2% FBS，上下移液几次进行洗涤。在4°C下以500× g 离心板3分钟。
10. 将沉淀重悬于 180 μL PBS 2% FBS 中，并通过 40 μm 细胞过滤器将细胞悬液转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。在冰上避光，直到流式细胞术分析。
11. 在进入细胞仪之前，将 35 μL DAPI 染色溶液加入 DAPI SCC 管中，并在室温下在黑暗中孵育管 5 分钟。孵育后，保持冰上避光，直到流式细胞术分析。

结果

健康年轻成年C57Bl/6小鼠HSC和MPP的流式细胞术分析代表性图如图 1所示。门控策略遵循ISEH¹³提出的最新协调命名法。在分析干扰（例如感染或癌症）的影响时，使用对照小鼠作为正常门的参考非常重要。荧光负一（FMO）控制对于描绘门的边界特别有用，但应该注意的是，盲目地基于FMO设置门限可能会省略靶细胞或包括非靶细胞。例如，CD48集的强度越低，静态长期HSC¹⁷的富集就越高。此外，某些种群的不同性质取决于特定标志物的强度。例如，表达较高CD150水平的HSC更偏向骨髓¹⁸。

应用于总共四只动物的造血细胞群分析中获得的频率和绝对数如 表1所示。

图2显示了EC和MSC流式细胞术分析的代表性图。大多数造血细胞在 Ter119/CD4...

讨论

虽然所描述的协议简单易行，但应特别注意具体步骤。例如，当获得冲洗的BM（步骤5.2）时，不应超过使PBS 2%FBS通过骨中央部分内部的指示体积或次数，因为这可能导致冲洗的样品被内膜细胞群严重污染。

可以对协议进行更改，以方便研究者执行协议。在样品提取（第2节）中，腿和/或骨骼可以在4°C下储存在PBS 2%FBS中长达24小时，然后再进行样品处理和分析。但是，应尽可能缩短此时间。在用HSC初级染色混合物（步骤3.10）和二次染色混合物（步骤3.11）孵育期间，虽然指示在室温下孵育15分钟，但可以将其交换为在4°C下孵育30分钟。

这同样适用于用基质一级染色混合物（步骤4.7）、基质二次染色溶液（步骤4.8）、ECs染色混合物（步骤4.12）和用鳞状细胞癌抗体孵育（步骤6.5）孵育;当指示在室温下孵育15分钟时，可以将其交换为在4°C下孵育30分钟。

最近描述了通过离心小鼠长骨进行BM分离的另一种方案²¹。虽然该协议具有更快...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD54/ICAM-1 抗体	BioLegend	116114
APC 链霉亲和素	BioLegend	405207
APC/Cyanine7 抗小鼠 CD117 （c-kit） 抗体	BioLegend	105826
APC/Cyanine7 抗小鼠 CD45 抗体	BioLegend	103116
APC/Cyanine7 抗小鼠 TER-119/红细胞抗体	BioLegend	116223
生物素抗小鼠 CD3&ε;抗体	BioLegend	100304
生物素抗小鼠 CD4 抗体	BioLegend	100404
生物素抗小鼠 CD8a 抗体	BioLegend	100704
生物素抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C （Gr-1） 抗体	BioLegend	108404
生物素抗小鼠 TER-119/红细胞抗体	BioLegend	116204
生物素抗小鼠/人 CD11b 抗体	BioLegend	101204
生物素抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体	BioLegend	103204
Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD150 （SLAM） 抗体	BioLegend	115929
Calibrite 2 色珠	BD Biosciences
胶原酶 IV	默克生命科学	C1889
分散酶 II	默克生命科学	D4693
胎牛血清，合格，热灭活，欧盟批准，南美洲原产	ThermoFisher Scientific	10500064
Hanks 平衡盐溶液 （HBSS）	ThermoFisher Scientific	14175095
小鼠瘦素 R 生物素化抗体	R&D 系统	BAF497
NucBlue 固定细胞试剂 （DAPI）	ThermoFisher Scientific	R37606	DAPI 试剂
PE 抗小鼠内粘蛋白抗体	ThermoFisher Scientific	12-5851-82
PE 抗小鼠 Flk2 （CD135）	ThermoFisher Scientific	12-1351-82
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD31 抗体	BioLegend	102524
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD48 抗体	BioLegend	103424
PerCP 抗小鼠 Ly-6A/E （Sca-1） 抗体	BioLegend	108122
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 片	默克生命科学	P4417
纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体	BioLegend	101302
RBC 裂解缓冲液 10x	BioLegend	420302
Zombie Violet Fixable Viability 染料	BioLegend	423114	荧光染料