需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

6.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64248

⸱

2022年9月28日

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。

摘要

骨髓（BM）是存在于骨骼内的软组织，是造血作用的主要发生场所，即新血细胞生成的过程。因此，骨髓中含有造血干细胞和祖细胞（HSPCs），以及支持性的基质细胞，这些细胞共同参与HSPCs的维持与调控。血液系统疾病及其他骨髓疾病可通过直接影响造血细胞和/或改变骨髓微环境，从而破坏正常造血功能。本文介绍一种通过流式细胞术对小鼠骨髓HSPCs及基质微环境细胞群进行表型分析，以研究健康与恶性状态下造血过程的方法。本方法详细描述了从骨内膜区和中央骨髓区富集骨髓细胞所需的步骤，以及用于鉴定两种关键微环境细胞类型——内皮细胞和间充质干细胞的合理设门策略。此处提出的表型分析方法可与小鼠突变体、疾病模型及功能实验相结合，用于全面表征HSPC区室及其微环境。

引言

流式细胞术是一种用于表征和前瞻性分离免疫细胞及造血细胞的宝贵方法。该技术也越来越多地被用于分析不同组织中的基质细胞和上皮细胞群体。造血干细胞（HSC）具有自我更新和多向分化潜能的独特特性。在成年哺乳动物中，HSC主要存在于骨髓（BM）中，在那里它们从周围的微环境或生态位接收维持静息状态和存活的信号1。HSC的形式定义依据功能检测实验2。然而，多篇里程碑式的研究论文已证明流式细胞术在鉴定HSC方面的有效性。通过使用有限的细胞表面标志物，可以区分出富含HSC的造血细胞群体3。因此，流式细胞术是干细胞研究领域的一项核心方法。它被广泛用于评估假定的生态位细胞类型及生态位因子对HSC的影响。通过将流式细胞术与成像技术和功能检测相结合，研究发现HSC受到血管周围间充质干细胞（MSC）和内皮细胞（EC）的关键支持。骨髓MSC是一类异质性群体，其分泌的细胞因子各不相同4，但已有充分证据表明，表达瘦素受体（LepR）+的MSC是关键的生态位细胞1。骨髓EC同样具有高度异质性，可构成窦状血管、小动脉以及H型/过渡型血管5。不同研究揭示了这些不同类型EC的精细作用。例如，骨内膜附近的窦状血管EC在空间上更接近静息态HSC6，而活性氧水平较低且不迁移的HSC则位于小动脉EC附近7。生态位所处的骨内膜区域与中央区域的位置差异也极为重要。骨内膜处的H型血管与血管周围的基质细胞相关，而这些基质细胞会随衰老而丢失，从而导致HSC减少8。在急性髓系白血病中，中央区域的EC扩增，而骨内膜血管和骨内膜HSC则减少9。

该领域的大多数研究一直聚焦于造血过程本身以及造血干细胞（HSCs）的细胞外在调控。然而，人们日益认识到，有必要更深入地表征调控其他前体细胞的微环境，特别是多能前体细胞（MPPs），因为它们在稳态条件下是造血的主要驱动者10。与固定的层级结构不同，近期研究表明，造血是一个连续的过程 ，其中HSCs在早期阶段即分化为具有不同谱系偏向的MPPs11。MPPs曾依据不同的分类体系命名12，但国际实验血液学学会（ISEH）近期发布的一份共识文件建议将MPPs区分为早期MPPs，并根据其淋巴系偏向（MPP-Ly）、巨核系-红系偏向（MPP-Mk/E）以及髓系偏向（MPP-G/M）进行分类13。流式细胞术的应用对于进一步研究骨髓（BM）微环境在调控这些细胞群体中的作用至关重要。目前的流式细胞术方法采用不同的设门策略来区分造血干细胞和祖细胞（HSPCs），并使用不一致的标志物来鉴定基质细胞，特别是内皮细胞（ECs）。本方法的目标是提供一种简单且可重复的骨髓染色操作流程，用于识别HSPC亚群、异质性的EC群体以及LepR+ 间充质干细胞（MSCs）。我们认为，尽管该技术与先前报道的方法具有可比性（例如参见文献14），但它为两种功能性骨髓区域——骨内膜区和中央骨髓区8,15——以及骨髓基质微环境细胞中造血细胞的表型分析，提供了一种更新且易于实施的实验方案。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案中使用的动物饲养在i3S动物实验设施中，环境条件为12小时光照-黑暗循环、温度受控且无特定病原体。动物可自由获取标准啮齿类动物饲料和水。所有动物的护理均遵循欧洲实验动物科学联合会（Federation of European Laboratory Animal Science Associations）关于实验动物护理和使用的标准（欧盟指令2010/63/EU）。对动物实施的实验操作（安乐死）已获得i3S动物伦理委员会（编号：DD_2019_15）和葡萄牙国家农业与兽医局（Direção-Geral de Alimentação e Veterinária）的批准。本方案中所用材料的详细信息见《材料表》Table of Materials。

1. 溶液与染色混合液的制备

  1. 磷酸盐缓冲液（PBS）：将五片 PBS 片剂溶解于 1 L 蒸馏水中。室温（RT）保存。
  2. 含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS：向 500 mL PBS 中加入 10 mL FBS。4 °C 保存。
  3. 红细胞（RBC）裂解缓冲液（1x）：将 50 mL 10x RBC 裂解缓冲液加入 450 mL 去离子水中。4 °C 保存。
  4. 胶原酶 IV 和分散酶 II 溶液：将 30 mg 胶原酶 IV 和 60 mg 分散酶 II 溶解于 30 mL HBSS 中，配制成浓度为 1 mg/mL 的胶原酶 IV 和 2 mg/mL 的分散酶 II 溶液。使用前新鲜配制。
  5. Fc 受体封闭溶液：将 10 µL 纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体加入 490 µL 含 2% FBS 的 PBS 中。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 保存至使用前。
  6. 荧光细胞活力染料染色液：将 2 µL 荧光细胞活力染料加入 1 mL PBS 中。使用前新鲜配制。
  7. 生物素标记谱系抗体混合液：取下列每种抗体各 100 µL 混合：生物素标记抗小鼠 CD3ε、生物素标记抗小鼠 CD4、生物素标记抗小鼠 CD8a、生物素标记抗小鼠/人 CD11b、生物素标记抗小鼠/人 CD45R/B220、生物素标记抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）以及生物素标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体。4 °C 保存至使用前。
  8. 造血干细胞（HSCs）一抗染色混合液：向 940 µL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 10 µL 生物素标记谱系抗体混合液、10 µL 免疫荧光标记的抗小鼠 CD150（SLAM）510 抗体、10 µL 藻红蛋白（PE）标记抗小鼠 Flk2（CD135）抗体、10 µL 多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体、10 µL PE/氰胺 7（PE/Cyanine7）标记抗小鼠 CD48 抗体，以及 10 µL 别藻青蛋白（APC）/氰胺 7（APC/Cyanine7）标记抗小鼠 CD117（c-kit）抗体。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。
  9. 基质细胞一抗染色混合液：向 954 µL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 5 µL 小鼠瘦素受体（leptin R）生物素化抗体、6.7 µL PE 标记抗小鼠内黏蛋白（endomucin）抗体、10 µL PerCP 标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体、4 µL PE/氰胺 7 标记抗小鼠 CD31 抗体、10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 CD45 抗体，以及 10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。
  10. HSCs/基质细胞二抗染色溶液：向 1 mL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 1 µL APC 标记链霉亲和素。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。
  11. 内皮细胞（ECs）染色混合液：向 940 µL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 10 µL PE 标记抗小鼠内黏蛋白（endomucin）抗体、10 µL PerCP 标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体、10 µL PE/氰胺 7 标记抗小鼠 CD31 抗体、10 µL Alexa Fluor 647 标记抗小鼠 CD54/ICAM-1 抗体、10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 CD45 抗体，以及 10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。
  12. DAPI 染色液：向 500 µL PBS 中加入 1 滴 DAPI 试剂。使用前新鲜配制。

2. 样品提取

  1. 通过颈椎脱位处死动物（本研究中所用动物的详细信息见补充表1）。将动物仰面放置于培养皿中，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀在腹部上方剪开皮肤，并将皮肤一直剥离至踝部。
  2. 握住一条腿，用剪刀在腿部末端（即腿与髋部关节连接处）剪断，使其与动物体分离。此步骤也可作为安乐死的二次确认方法。在踝部剪断以去除足部。将腿置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。如有需要，对另一条腿重复此步骤。
  3. 握住髋骨，用剪刀在其后方剪断，使其与动物体分离。将髋骨置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。如有需要，对另一侧髋骨重复此步骤。
  4. 将腿和髋骨放入培养皿中，使用无菌手术刀清理骨骼组织。用手术刀在膝关节处剪断，分离胫骨和股骨。将清理后的骨骼置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。

3. 全骨髓中造血细胞群体分析的样品处理

  1. 将一根股骨或胫骨放入研钵中，加入预冷的含2% FBS的PBS，用研杵轻轻将其压向研钵壁以捣碎骨骼。骨髓细胞会释放到研钵中的溶液里。
  2. 使用10 mL移液器反复吹打所得细胞悬液，混匀后通过置于50 mL离心管上方的40 µm细胞筛网转移至该离心管中。
  3. 如果此时捣碎后的骨骼未呈现白色，向研钵中补充更多含2% FBS的PBS，重复研磨操作，再反复吹打并将溶液通过同一40 µm细胞筛网转移至同一个50 mL离心管中。
  4. 用额外的含2% FBS的PBS冲洗研钵，并将冲洗液通过同一40 µm细胞筛网转移至同一50 mL离心管中。将50 mL离心管在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。
  5. 弃去上清液，于室温下用5 mL红细胞裂解缓冲液（1x）重悬细胞沉淀，通过反复吹打数次使其充分悬浮。室温孵育2分钟后，加入15 mL含2% FBS的PBS。
  6. 将50 mL离心管在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。若细胞沉淀仍呈红色，则返回步骤3.5重复操作；若无明显红色，则弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL PBS中，并将细胞悬液转移至96孔V型底板的一个孔中用于染色。
  7. 将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟。将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，再将沉淀重悬于200 µL荧光染料染色液中。室温避光孵育15分钟。
  8. 将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟。将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，再将沉淀重悬于200 µL含2% FBS的PBS中进行洗涤。
  9. 将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，再将沉淀重悬于100 µL Fc受体封闭液中。4 °C避光孵育10分钟。
  10. 加入100 µL含2% FBS的PBS，轻轻吹打数次进行洗涤。 将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，弃去上清液（将板倒扣于吸水纸上），再将沉淀重悬于100 µL HSCs一抗染色混合液中。室温避光孵育15分钟。
  11. 加入100 µL含2% FBS的PBS，轻轻吹打数次进行洗涤。将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，弃去上清液（将板倒扣于吸水纸上），再将沉淀重悬于100 µL HSCs二抗染色溶液中。室温避光孵育15分钟。
  12. 加入100 µL含2% FBS的PBS，轻轻吹打数次进行洗涤。将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，并将板倒扣在吸水纸上弃去上清液。
  13. 将沉淀重悬于250 µL含2% FBS的PBS中，并通过40 µm细胞筛网将细胞悬液转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管中。置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞术分析。
    ​注意：若需测定造血细胞亚群的绝对数量，可在上机分析前向聚苯乙烯管中加入Calibrite微球16。

4. 全骨髓基质细胞群体分析的样品处理

  1. 将一根股骨或胫骨放入研钵中，加入冰冻的含2% FBS的PBS，用研杵轻轻在研钵壁上按压以研磨骨骼 。用剪刀剪去P1000吸头的尖端，用其将研钵中的全部内容物转移至一个50 mL离心管中（不要通过细胞滤网）。
  2. 在4 °C条件下，以500 × g离心50 mL离心管5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于3 mL胶原酶IV和分散酶II溶液中。将离心管在37 °C孵育40分钟。
  3. 用含2% FBS的PBS补至25 mL，涡旋混匀。将50 mL离心管中的内容物通过100 µm细胞滤网转移至一个新的50 mL离心管中。向原50 mL离心管中加入15 mL含2% FBS的PBS，并通过同一细胞滤网将溶液转移至同一新50 mL离心管中。 在4 °C以500 × g 离心 5分钟。
  4. 弃去上清液，用移液器反复吹打数次，将细胞沉淀重悬于5 mL室温的红细胞裂解缓冲液（1×）中。在室温孵育2分钟后，加入15 mL含2% FBS的PBS。
  5. 在4 °C以500 × g离心50 mL离心管5分钟。若细胞沉淀仍呈红色，则返回步骤4.4。若无明显红色，则弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL含2% FBS的PBS中，并将细胞悬液转移至96孔V型底板的一个孔中用于染色。在4 °C以500 × g离心3分钟。
  6. 若进行基质细胞染色，则进入步骤4.7；若进行内皮细胞（EC）染色，则进入步骤4.12。
  7. 将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL基质细胞一抗染色混合液中。在室温避光孵育15分钟。
  8. 加入100 µL含2% FBS的PBS，反复吹打数次进行洗涤。在4 °C以500 × g离心3分钟，将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL基质细胞二抗染色溶液中。在室温避光孵育15分钟。
  9. 加入100 µL含2% FBS的PBS，反复吹打数次进行洗涤。在4 °C以500 × g离心3分钟。将板倒扣在吸水纸上弃去上清液。
  10. 将沉淀重悬于250 µL含2% FBS的PBS中，并通过40 µm细胞滤网将细胞悬液转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管中。置于冰上并避光保存。
  11. 在上机进行流式细胞仪分析前，向含有细胞悬液的管中加入35 µL DAPI染色液，在室温避光孵育5分钟。孵育结束后，置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞仪分析。
  12. 将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL内皮细胞（ECs）染色混合液中。在室温避光孵育15分钟。
  13. 加入100 µL含2% FBS的PBS，反复吹打数次进行洗涤。在4 °C以500 × g离心3分钟。
  14. 将板倒扣在吸水纸上弃去上清液。将沉淀重悬于250 µL含2% FBS的PBS中，并通过40 µm细胞滤网将细胞悬液转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管中。置于冰上并避光保存。
  15. 在上机进行流式细胞仪分析前，向含有细胞悬液的管中加入35 µL DAPI染色液，在室温避光孵育5分钟。孵育结束后，置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞仪分析。
    ​注意：若需测定基质细胞和内皮细胞群体的绝对数量，可在上机分析前向聚苯乙烯管中加入Calibrite微球16。

5. 粉碎并冲洗骨髓中造血细胞群体分析的样品处理

  1. 将一根股骨置于培养皿中，使用无菌手术刀切除骨的两端。
  2. 用无死体积的0.5 mL胰岛素注射器，从骨的两侧分别向骨髓腔内各注入100 µL含2% FBS的PBS溶液一次，并将冲洗液收集至含有1 mL含2% FBS的PBS的微量离心管中。随后，将细胞悬液转移至一个已标记为“冲洗骨髓”（flushed BM）的50 mL离心管中，该管内预先加入4 mL含2% FBS的PBS。置于冰上保存。
  3. 将骨的两端放入预冷的含2% FBS的PBS的研钵中，用研杵轻轻沿研钵壁按压研磨。使用10 mL移液器反复吹打所得细胞悬液以混匀，并通过40 µm细胞滤网转移至标记为“研磨骨髓”（crushed BM）的50 mL离心管中。
  4. 若此时研磨后的骨组织仍未呈白色，向研钵中补充更多含2% FBS的PBS，重复研磨过程。再次用移液器反复吹打，并通过同一40 µm细胞滤网将溶液转移至同一个50 mL离心管（研磨骨髓）中。
  5. 用更多含2% FBS的PBS冲洗研钵，并通过同一40 µm细胞滤网将冲洗液转移至同一个50 mL离心管（研磨骨髓）中。
  6. 将分别对应冲洗和研磨样本的50 mL离心管在4 °C条件下以500 × g 离心3分钟。
  7. 对冲洗和研磨所得的骨髓样本，继续执行第3.5至3.13步（第3节）的操作。

6. 流式细胞术分析用单色对照（SCC）的制备

  1. 使用未用于主分析的某只动物的额外一块骨骼，重复步骤 3.1 至 3.6（第 3 节），但将最终的细胞悬液转移至含有 1 mL PBS 2% FBS 的微量离心管中，而非 96 孔 V 型底板的孔中。
  2. 将 100 µL 细胞悬液转移至 96 孔 V 型底板的 8 个孔中，另取 100 µL 加入标记为 DAPI SCC 的含有 100 μL PBS 2% FBS 的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，剩余的细胞悬液加入另一标记为未染色的含有 100 μL PBS 2% FBS 的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。将所有管置于冰上，并避光保存。
  3. 在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 3 分钟，然后将板倒置在吸水纸上弃去上清液。
  4. 将其中一个沉淀重悬于 100 µL 荧光染料染色液中，其余沉淀均重悬于 100 µL PBS 2% FBS 中。
  5. 向各含有 PBS 2% FBS 细胞悬液的孔中分别加入以下抗体：除抗体谱系混合物需加入 2 µL、PECy7 标记的 CD31 抗体需加入 0.3 µL 外，其余每种抗体均加入 0.5 µL。每孔仅加一种抗体，所用抗体应与主分析图谱中使用的抗体相同，或为具有相似荧光强度和表位丰度的同荧光素标记抗体。具体抗体包括：生物素标记的谱系混合抗体、免疫荧光标记的 510 抗小鼠 CD150（SLAM）、PE 标记的抗小鼠 Flk2（CD135）、PerCP 标记的抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）、免疫荧光标记的 647 抗小鼠 CD54/ICAM-1、PE/Cyanine7 标记的抗小鼠 CD48，以及 APC/Cyanine7 标记的抗小鼠 CD117（c-kit）。将板在室温下避光孵育 15 分钟。
  6. 向每孔加入 100 µL PBS 2% FBS，反复吹打数次进行洗涤。在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 3 分钟，然后将板倒置在吸水纸上弃去上清液。
  7. 除用抗体谱系混合物孵育过的细胞沉淀外，将所有其他沉淀重悬于 180 µL PBS 2% FBS 中，并通过 40 µm 细胞筛网将细胞悬液转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。
  8. 将用抗体谱系混合物孵育过的细胞沉淀重悬于 100 µL HSCs/基质细胞二次染色液中。将板在室温下避光孵育 15 分钟。
  9. 加入 100 µL PBS 2% FBS，反复吹打数次进行洗涤。在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 3 分钟。
  10. 将沉淀重悬于 180 µL PBS 2% FBS 中，并通过 40 µm 细胞筛网将细胞悬液转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。
  11. 在上机检测前，向 DAPI SCC 管中加入 35 µL DAPI 染色液，在室温下避光孵育 5 分钟。孵育结束后，立即置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图1展示了在健康年轻成年C57Bl/6小鼠中对造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）进行流式细胞术分析的代表性图谱。图1所示的设门策略遵循国际实验血液学会（ISEH）提出的最新统一命名规范13。在分析诸如感染或癌症等干扰因素的影响时，使用对照小鼠作为正常设门的参考至关重要。荧光减一（FMO）对照在界定设门边界时尤为有用，但需注意，盲目依据FMO结果设定门限可能会遗漏目标细胞或纳入非目标细胞。例如，CD48表达强度越低，静息态长期HSCs的富集程度越高17。此外，某些细胞群体的不同特性依赖于特定标志物的表达强度。例如，CD150表达水平较高的HSCs更倾向于髓系分化18。

对总共四只动物的造血细胞群体进行分析所获得的频率和绝对数量见表1。

图2<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

尽管所述方案简单且易于操作，但仍需特别注意某些步骤。例如，在获取冲洗骨髓（步骤5.2）时，通过骨中央部分内腔的含2% FBS的PBS冲洗体积或次数不应超过指定范围，否则可能导致冲洗样本被骨内膜细胞群体严重污染。

研究者可根据需要对实验方案进行适当调整以方便操作。在样本提取（第2节）过程中，腿部和/或骨骼可在含2% FBS的PBS中4 °C保存最多24小时，然后再进行样本处理与分析。然而，应尽可能缩短保存时间。在造血干细胞（HSCs）一抗染色混合液孵育（步骤3.10）和二抗染色混合液孵育（步骤3.11）过程中，虽然推荐在室温下孵育15分钟，但也可替换为在4 °C孵育30分钟。

上述情况同样适用于与基质细胞一抗染色混合液（步骤 4.7）、基质细胞二抗染色溶液（步骤 4.8）、内皮细胞（ECs）染色混合液（步骤 4.12）以及用于 SCCs 的抗体孵育（步骤 6.5）；虽然建议在室温下孵育 15 分钟，但也可替换为在 4 °C 下孵育 30 分钟。

最近有文献描述了通过离心法分...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

LM 获得了塔塔夫人纪念基金会（Lady Tata Memorial Trust）资助项目的资助。JR 获得了葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia，FCT；FCT 博士生奖学金编号 UI/BD/150833/2021）提供的博士生奖学金支持。ML 获得了葡萄牙科学技术基金会（FCT）提供的博士生奖学金支持（FCT 奖学金编号 2021.04773.BD）。DD 获得了美国血液学会、Pablove 基金会、葡萄牙科学技术基金会（FCT，项目编号 EXPL/MED-ONC/0522/2021）以及葡萄牙血液学会的资助。我们感谢 i3s 机构 TRACY 平台的 Catarina Meireles 博士和 Emilia Cardoso 提供的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD54/ICAM-1 抗体BioLegend116114
APC 链霉亲和素BioLegend405207
APC/Cyanine7 抗小鼠 CD117 (c-kit) 抗体BioLegend105826
APC/Cyanine7 抗小鼠 CD45 抗体BioLegend103116
APC/Cyanine7 抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体BioLegend116223
生物素标记抗小鼠 CD3ε 抗体BioLegend100304
生物素标记抗小鼠 CD4 抗体BioLegend100404
生物素标记抗小鼠 CD8a 抗体BioLegend100704
生物素标记抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) 抗体BioLegend108404
生物素标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体BioLegend116204
生物素标记抗小鼠/人 CD11b 抗体BioLegend101204
生物素标记抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体BioLegend103204
Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD150 (SLAM) 抗体BioLegend115929
Calibrite 2 色微球BD Biosciences349502
胶原酶 IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
胎牛血清，经鉴定，热灭活，符合欧盟标准，南美洲来源ThermoFisher Scientific10500064
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
小鼠 Leptin R 生物素化抗体R&D systemsBAF497
NucBlue 固定细胞试剂 (DAPI)ThermoFisher ScientificR37606DAPI 试剂
PE 抗小鼠内粘蛋白抗体ThermoFisher Scientific12-5851-82
PE 抗小鼠 Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD31 抗体BioLegend102524
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD48 抗体BioLegend103424
PerCP 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) 抗体BioLegend108122
磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂Merck Life ScienceP4417
纯化抗小鼠 CD16/32 抗体BioLegend101302
红细胞裂解缓冲液 10xBioLegend420302
Zombie Violet 可固定活力染料BioLegend423114荧光染料

参考文献

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519(2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

骨髓细胞造血干细胞骨内膜骨髓中央骨髓间充质干细胞内皮细胞表型分析
小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。