本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。
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本文内容
摘要
摘要
骨髓（BM）是存在于骨骼内的软组织，是造血作用的主要发生场所，即新血细胞生成的过程。因此，骨髓中含有造血干细胞和祖细胞（HSPCs），以及支持性的基质细胞，这些细胞共同参与HSPCs的维持与调控。血液系统疾病及其他骨髓疾病可通过直接影响造血细胞和/或改变骨髓微环境，从而破坏正常造血功能。本文介绍一种通过流式细胞术对小鼠骨髓HSPCs及基质微环境细胞群进行表型分析，以研究健康与恶性状态下造血过程的方法。本方法详细描述了从骨内膜区和中央骨髓区富集骨髓细胞所需的步骤，以及用于鉴定两种关键微环境细胞类型——内皮细胞和间充质干细胞的合理设门策略。此处提出的表型分析方法可与小鼠突变体、疾病模型及功能实验相结合，用于全面表征HSPC区室及其微环境。
引言
流式细胞术是一种用于表征和前瞻性分离免疫细胞及造血细胞的宝贵方法。该技术也越来越多地被用于分析不同组织中的基质细胞和上皮细胞群体。造血干细胞（HSC）具有自我更新和多向分化潜能的独特特性。在成年哺乳动物中，HSC主要存在于骨髓（BM）中，在那里它们从周围的微环境或生态位接收维持静息状态和存活的信号1。HSC的形式定义依据功能检测实验2。然而，多篇里程碑式的研究论文已证明流式细胞术在鉴定HSC方面的有效性。通过使用有限的细胞表面标志物，可以区分出富含HSC的造血细胞群体3。因此，流式细胞术是干细胞研究领域的一项核心方法。它被广泛用于评估假定的生态位细胞类型及生态位因子对HSC的影响。通过将流式细胞术与成像技术和功能检测相结合，研究发现HSC受到血管周围间充质干细胞（MSC）和内皮细胞（EC）的关键支持。骨髓MSC是一类异质性群体，其分泌的细胞因子各不相同4，但已有充分证据表明，表达瘦素受体（LepR）+的MSC是关键的生态位细胞1。骨髓EC同样具有高度异质性，可构成窦状血管、小动脉以及H型/过渡型血管5。不同研究揭示了这些不同类型EC的精细作用。例如，骨内膜附近的窦状血管EC在空间上更接近静息态HSC
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方案
本方案中使用的动物饲养在i3S动物实验设施中，环境条件为12小时光照-黑暗循环、温度受控且无特定病原体。动物可自由获取标准啮齿类动物饲料和水。所有动物的护理均遵循欧洲实验动物科学联合会（Federation of European Laboratory Animal Science Associations）关于实验动物护理和使用的标准（欧盟指令2010/63/EU）。对动物实施的实验操作（安乐死）已获得i3S动物伦理委员会（编号：DD_2019_15）和葡萄牙国家农业与兽医局（Direção-Geral de Alimentação e Veterinária）的批准。本方案中所用材料的详细信息见《材料表》Table of Materials。
1. 溶液与染色混合液的制备
- 磷酸盐缓冲液（PBS）：将五片 PBS 片剂溶解于 1 L 蒸馏水中。室温（RT）保存。
- 含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS：向 500 mL PBS 中加入 10 mL FBS。4 °C 保存。
- 红细胞（RBC）裂解缓冲液（1x）：将 50 mL 10x RBC 裂解缓冲液加入 450 mL 去离子水中。4 °C 保存。
- 胶原酶 IV 和分散酶 II 溶液：将 30 mg 胶原酶 IV 和 60 mg 分散酶 II 溶解于 30 mL HBSS 中....
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结果
图1展示了在健康年轻成年C57Bl/6小鼠中对造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）进行流式细胞术分析的代表性图谱。图1所示的设门策略遵循国际实验血液学会（ISEH）提出的最新统一命名规范13。在分析诸如感染或癌症等干扰因素的影响时，使用对照小鼠作为正常设门的参考至关重要。荧光减一（FMO）对照在界定设门边界时尤为有用，但需注意，盲目依据FMO结果设定门限可能会遗漏目标细胞或纳入非目标细胞。例如，CD48表达强度越低，静息态长期HSCs的富集程度越高17。此外，某些细胞群体的不同特性依赖于特定标志物的表达强度。例如，CD150表达水平较高的HSCs更倾向于髓系分化18。
对总共四只动物的造血细胞群体进行分析所获得的频率和绝对数量见表1。
图2<.......
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讨论
尽管所述方案简单且易于操作，但仍需特别注意某些步骤。例如，在获取冲洗骨髓（步骤5.2）时，通过骨中央部分内腔的含2% FBS的PBS冲洗体积或次数不应超过指定范围，否则可能导致冲洗样本被骨内膜细胞群体严重污染。
研究者可根据需要对实验方案进行适当调整以方便操作。在样本提取（第2节）过程中，腿部和/或骨骼可在含2% FBS的PBS中4 °C保存最多24小时，然后再进行样本处理与分析。然而，应尽可能缩短保存时间。在造血干细胞（HSCs）一抗染色混合液孵育（步骤3.10）和二抗染色混合液孵育（步骤3.11）过程中，虽然推荐在室温下孵育15分钟，但也可替换为在4 °C孵育30分钟。
上述情况同样适用于与基质细胞一抗染色混合液（步骤 4.7）、基质细胞二抗染色溶液（步骤 4.8）、内皮细胞（ECs）染色混合液（步骤 4.12）以及用于 SCCs 的抗体孵育（步骤 6.5）；虽然建议在室温下孵育 15 分钟，但也可替换为在 4 °C 下孵育 30 分钟。
最近有文献描述了通过离心法分.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
LM 获得了塔塔夫人纪念基金会（Lady Tata Memorial Trust）资助项目的资助。JR 获得了葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia，FCT；FCT 博士生奖学金编号 UI/BD/150833/2021）提供的博士生奖学金支持。ML 获得了葡萄牙科学技术基金会（FCT）提供的博士生奖学金支持（FCT 奖学金编号 2021.04773.BD）。DD 获得了美国血液学会、Pablove 基金会、葡萄牙科学技术基金会（FCT，项目编号 EXPL/MED-ONC/0522/2021）以及葡萄牙血液学会的资助。我们感谢 i3s 机构 TRACY 平台的 Catarina Meireles 博士和 Emilia Cardoso 提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD54/ICAM-1 抗体 | BioLegend | 116114 | |
| APC 链霉亲和素 | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 抗小鼠 CD117 (c-kit) 抗体 | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 抗小鼠 CD45 抗体 | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体 | BioLegend | 116223 | |
| 生物素标记抗小鼠 CD3ε 抗体 | BioLegend | 100304 | |
| 生物素标记抗小鼠 CD4 抗体 | BioLegend | 100404 | |
| 生物素标记抗小鼠 CD8a 抗体 | BioLegend | 100704 | |
| 生物素标记抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) 抗体 | BioLegend | 108404 | |
| 生物素标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体 | BioLegend | 116204 | |
| 生物素标记抗小鼠/人 CD11b 抗体 | BioLegend | 101204 | |
| 生物素标记抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体 | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD150 (SLAM) 抗体 | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 色微球 | BD Biosciences | 349502 | |
| 胶原酶 IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活，符合欧盟标准，南美洲来源 | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| 小鼠 Leptin R 生物素化抗体 | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue 固定细胞试剂 (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI 试剂 |
| PE 抗小鼠内粘蛋白抗体 | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE 抗小鼠 Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 抗小鼠 CD31 抗体 | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 抗小鼠 CD48 抗体 | BioLegend | 103424 | |
| PerCP 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) 抗体 | BioLegend | 108122 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂 | Merck Life Science | P4417 | |
| 纯化抗小鼠 CD16/32 抗体 | BioLegend | 101302 | |
| 红细胞裂解缓冲液 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet 可固定活力染料 | BioLegend | 423114 | 荧光染料 |
参考文献
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.
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