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方法文章

建立一种稳定且可重复的辐射诱导皮肤和肌肉纤维化模型

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DOI：

10.3791/64251

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2022年8月31日

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1Department of Plastic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Forensic Medicine and Toxicology, HBS Medical and Dental College, 3Department of Radiation Oncology, University of Pittsburgh Cancer Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在小鼠后肢诱导辐射诱导性皮肤纤维化并进行照射后慢性功能障碍评估的实验方案。 通过 肢体活动范围和步态指数分析用于评估功能结果。该模型阐明了辐射相关性皮肤纤维化的机制，在亚临床治疗研究中具有应用价值。

摘要

放射性皮肤纤维化（RISF）可由多种情况引起，包括癌症治疗、意外暴露或恐怖袭击事件。放射性射线可穿透皮肤，影响其路径上的各种结构，包括皮肤、肌肉和内脏器官。皮肤是首先受到辐射暴露的组织，易发生慢性纤维化，且该病症治疗困难。目前，可用于缓解放射性相关皮肤纤维化的治疗手段有限，疗效仅中等。阻碍有效防治措施开发的关键因素之一，是缺乏一种便捷且可靠的模型，以实现将实验发现有效转化至人类应用。本文建立了一种稳定且可重复的小鼠后肢皮肤纤维化模型，可用于评估潜在防治药物在功能和分子水平上的恢复效果。

采用单次40 (Gray) Gy剂量照射右后肢以诱导皮肤纤维化。受试对象在早期阶段出现水肿和皮炎，随后出现明显的皮肤收缩。照射肢体在随后的数周内表现出显著降低的关节活动范围。在晚期阶段，急性副作用减轻，但慢性纤维化仍然持续。此外进行步态指数检测作为一项功能评估实验，结果表明功能损伤的发生。这些非侵入性方法提供了可靠的测量手段用于追踪纤维化进展，并得到组织学分析的支持。该模型所采用的辐射剂量、照射方式及照射后分析方法，为研究辐射诱导的皮肤纤维化以及评估治疗药物的有效性提供了一种严谨且可重复的技术方案。

引言

皮肤是人体最大的器官，覆盖并保护身体免受各种危害。皮肤可分为三个 distinct 层次：表皮、真皮和皮下组织。每一层都有其独特的功能：表皮可防止脱水和微生物侵入；真皮含有丰富的细胞网络和细胞外基质，赋予皮肤抗张强度和弹性1；真皮层内还分布着感觉受体、毛囊、腺体以及淋巴和毛细血管网络的血管。皮下组织（又称皮下脂肪组织）富含脂肪组织，能够塑造身体轮廓并分散机械应力2,3,4。

由事故、战争、恐怖主义或治疗应用产生的辐射以线性渐进方式穿透人体，导致皮肤成为首个接触辐射的器官。由于工业、医疗机构和军事设施中放射性材料的使用日益增加，此类事件的威胁已显著加剧5。临床上，皮肤辐射损伤表现为皮肤辐射综合征（CRS），这是急性辐射综合征（ARS）的四种亚综合征之一。皮肤对电离辐射的反应对于治疗及防止进一步损伤具有重要意义6。当辐射损伤合并烧伤和创伤等并发损伤时，临床结局将更加复杂7。皮肤受辐射暴露的程度与不可逆阈值相关，超过该阈值后，其他器官功能受损将导致单个或多个器官衰竭，最终引发患者死亡8,9。皮肤辐射损伤包括急性期和慢性期两个阶段。急性辐射损伤在临床上表现为红斑、皮肤水肿、皮炎、水疱形成、表皮剥脱、干性或湿性脱屑、溃疡以及毛发和指甲的改变。慢性期则表现为真皮萎缩、纤维化、慢性溃疡和毛细血管扩张10,11。总体而言，急性效应主要发生在表皮，而慢性效应则在真皮中更为显著。辐射暴露后的急性反应在暴露后12小时内即导致有丝分裂活性显著下降，随后出现充血、细胞肿大、空泡化、核固缩及核碎裂等病理变化4,12。

超过40 Gy的辐射剂量会导致湿性脱屑和表皮丧失，从而增加感染易感性13。此外，皮肤受到辐射暴露会诱导细胞因子产生，引发真皮层的炎症性免疫反应。主要的炎症介质包括白细胞介素（IL-1、IL-3、IL-5、IL-6和IL-8）以及肿瘤坏死因子-α（TNFα）14。若炎症无法有效消退，最终可能导致辐射损伤部位发生纤维化15。其他物理性伤口或热损伤会进一步加剧这种纤维化反应，并延伸至肌肉层16。转化生长因子-β（TGFβ）是介导纤维化发展的关键细胞因子17。目前，有效的治疗手段极为有限，且大多数疗法可能存在患者依从性方面的挑战。进一步研究皮肤对不同辐射剂量的细胞与分子反应，将有助于深入理解辐射诱导的皮肤病理生理机制，并促进新疗法的开发。

为了促进临床前模型中关于缓解皮肤和软组织辐射损伤的研究成果向临床应用转化，设计在辐射后实施治疗干预的高度相关实验模型至关重要。两者 体外 和 体内 已描述了辐射诱导损伤的模型，包括照射的内皮细胞的细胞培养模型18,19，成纤维细胞20，或角质形成细胞19 和 体内 啮齿类、猪和非人灵长类动物模型。由于啮齿类动物对辐射损伤的反应与人类相似，且具有遗传操作的灵活性，因此在辐射研究中被广泛使用。21辐射剂量要求在啮齿类动物中高于人类，以达到相似的效应：脱屑、纤维化和坏死16,22. 评分标准的描述用于评估对辐射的反应，这进一步促进了啮齿类动物辐射性皮肤损伤模型的应用21,23.

目前临床前研究的重点是理解辐射诱导皮肤损伤的机制并开发治疗方案。因此，建立一个稳健且可重复的临床前模型，以实现具有高度临床可转化性的辐射损伤至关重要。本研究描述了一种经优化辐射剂量和递送技术的小鼠皮肤纤维化模型。该模型结合了功能、组织学和分子水平的检测方法，可有效用于研究纤维化发生机制并探索新的治疗方案。

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方案

动物实验伦理使用已获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，该委员会依照《动物福利法》开展工作。动物饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中，并根据美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行处理。

1. 麻醉

  1. 将小鼠放入小型动物麻醉系统的箱体内（图1）。向盒子中输送4%异氟烷，等待5-10分钟，随后将异氟烷浓度降低至2-3%。
  2. 确认麻醉深度 通过 脚趾挤压。涂抹眼用润滑剂以防角膜干燥。将受试动物转移至含有2%异氟烷气流的鼻锥中。
  3. 采用上述技术对每只小鼠进行麻醉，以进行剃毛和肢体测量实验。对小鼠进行照射前麻醉时，采用1.25 mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射。

2. 皮肤区域准备

  1. 计划在照射小鼠前 2-3 天进行剃毛。使用剪毛器修剪毛发（图 2A）。
  2. 涂抹脱毛膏，静置 1-2 分钟（图 2B）。用干纱布擦去脱毛膏，再用浸有磷酸盐缓冲液（PBS）的纱布擦拭皮肤（图 2C）。

3. 照射步骤

  1. 在照射前5分钟，通过腹腔注射麻醉每只小鼠。将肢体置于辐射野（25 cm x 25 cm）中，并用手术胶带固定（图3A-C）。
  2. 使用手术胶带固定小鼠身体（图3D）。放置一块1 cm厚的组织等效材料（bolus），以阻止或尽量减少辐射的深层穿透（图3E）。
  3. 计算施用器和限束器的校正因子，以向小鼠皮肤递送40 Gy剂量。在本实验中，使用直线加速器产生6 MeV电子束，设置3740监测单位（monitor units）以诱导辐射烧伤。在此条件下，采用25 cm x 25 cm辐射野，剂量率为1,000 MU/min，源皮距（SSD）为100 cm（即从辐射源到bolus表面的距离），以实现皮肤表面40 Gy的剂量。照射时间将根据所使用的直线加速器型号、射线能量和照射野大小而有所不同。应咨询放射物理师或医学物理师，计算在特定直线加速器上递送40 Gy剂量所需的监测单位数。

4. 纤维化进展的可视化监测

  1. 使用手持式数码相机记录纤维化的进展过程。使用微距模式拍摄详细的图像。
  2. 通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。
  3. 将镜头靠近皮肤进行拍摄并按下拍摄键。尽量保持照片的一致性。在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，需持续密切监护。

5. 作为纤维化功能结局的腿部伸展度测量

  1. 从照射后第三周开始，计划每周进行一次测量，持续6周。
  2. 按照上述方法诱导并维持麻醉。在鼻罩前方准备一个操作区域，并用胶带将量角器固定在中心位置（图4A）。
  3. 将小鼠转移至操作区域，轻轻将其鼻子置于鼻罩上，并使右膝对准量角器的中心（图4B）。
  4. 用左手固定膝关节，右手使用食指和拇指背屈足部（图4C，D）。
  5. 通过观察脚趾所指示的刻度记录伸展角度。对对侧未照射的腿部重复相同操作。

6. 步态功能指数的测量

  1. 3D 打印啮齿类动物行走轨道，制作一条长度为 40 cm、离地高度为 15 cm、底部透明的行走路径（图 5）。在轨道下方放置一台摄像机并开始录像。调整摄像机以尽可能高的分辨率进行拍摄，且帧率不得低于每秒 60 帧。
  2. 打开轨道一端，将小鼠放入其中，使其在轨道上自由行走。至少记录三次动物平稳行走的过程。
  3. 在记录下一只小鼠之前，检查视频质量。
  4. 将视频转移至配备有视频播放器、截图工具、图像处理程序和电子表格软件的计算机。回放录像，使用截图功能获取三个不同且清晰的足印图像（图 6）。
  5. 打开图像处理程序以进行脚趾展开度测量。从顶部面板选择文件，然后点击打开，找到并显示待分析的图像。
  6. 从顶部面板的第二行选择直线工具（图 7_1）。使用该工具标记已知宽度的参照物，然后点击分析 > 设置比例尺，输入已知距离的实际数值以校准比例尺（图 7_2-5）。
  7. 使用直线工具标记足印以进行不同参数的测量（图 6C、D；1：足长，2：外侧脚趾展开度，3：内侧脚趾展开度），选择分析 > 测量，记录测量得到的长度值（图 8）。
  8. 对经辐照和未经辐照的肢体均进行分析。使用先前发表的以下公式评估功能状态24
    静态平衡公式，用于计算散射因子的 SFI 方程，数学表达式。
    其中 SFI = 坐骨神经功能指数，E = 实验侧或损伤侧足爪，N = 正常或未损伤侧足爪，TS = 脚趾展开度，PL = 足印长度。

7. 安乐死

  1. 将受试者转移至 CO₂ 培养箱2 线连框。启动 CO2 注入气体以使腔室内浓度达到30%–70%。对于5 L的腔室，气体注入速率必须在1.5–3.5 L/min之间。
  2. 等待动物停止呼吸 5–10 分钟。通过颈椎脱位实施安乐死。 通过 固定头部于颅底位置，同时牢固牵拉尾部25.

8. 组织学与下游分析17

  1. 拉取经辐照的后肢，为切除做准备。在肢体皮肤的后侧平面选取一个 2 cm × 1 cm 的区域。
  2. 使用一把锋利的剪刀小心采集皮肤样本。沿长轴将组织切成两半，得到两个独立的组织块。
  3. 将其中一块组织置于10%中性缓冲福尔马林中固定。将固定后的组织进行处理，制备载玻片上的组织学切片。
  4. 将第二块组织转移至装有干冰的容器中，以保存蛋白质和RNA。随后迅速将组织样本转移至-80 °C超低温冰箱中冷冻保存，直至进一步处理。
  5. 对载玻片进行苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色。在显微镜下观察染色后的切片，并使用10倍物镜拍摄图像。采用图像处理软件测量上皮层厚度，具体方法同步态功能检测中所述。

9. 统计学

  1. 以均值 ± 标准差形式表示数据。采用方差分析（ANOVA）对结果进行评估，随后进行 Bonferroni 多重比较检验或 Student t 检验。

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结果

当前照射方案的建立与优化实现了在小鼠中稳定且可重复地诱导纤维化。照射当天，将小鼠的右肢置于照射区域并固定，随后给予40 Gy的辐射剂量。

通过照射后每周拍摄图像，监测皮肤功能障碍的发生情况。照片显示，优化后的方案在第40天时可诱导纤维化，置信度为95%。在图9中展示了纤维化进展的一个示例，表现为受照射皮肤出现明显的收缩。

功能障碍是放射性纤维化最显著的特征之一；随着纤维化的进展，细胞外基质的过度重塑导致皮肤收缩和增厚。此外，放射诱发的反应还会影响邻近肌肉的功能。作者建立了膝关节伸展和基于视频的脚趾伸展检测方法，以量化肢体功能。在照射后第21天，应用40 Gy照射剂量导致照射侧肢体的活动范围较对侧未照射肢体显著减小（图10）。这一早期结果主要与水肿和皮炎等急性反应相关。随着时间推移，早期反应逐渐消退，活动范围有所改善，但由于慢性反应（纤维化）的存在，仍显著低于基线水平。该分析通常在照射后最长至42天内进行（

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讨论

皮肤损伤是意外或医源性辐射暴露后可能出现的结果。由于人为错误或类似切尔诺贝利和福岛的自然灾害，核反应堆存在意外泄漏的风险26,27。癌症治疗中的治疗性辐射暴露最为常见，通常采用分次重复给药方案，但可能在治疗区域引发与辐射相关的纤维化。这种常见的慢性不良反应在高达23%的病例中均有发生16,28。针对纤维化的治疗干预应靶向疾病不同阶段所涉及的连续性病理机制。一种经济高效、可重复且具有临床转化潜力的小型动物模型，是进一步研究的理想选择。在本方案中，我们描述了一种可呈现皮肤纤维化病理特征的辐射诱导损伤小鼠模型。

既往研究表明，辐射引起的人类与小鼠皮肤反应及表现在形态上具有相似性16,21。由于存在多种品系以及可用于解析损伤分子机制的基因修饰...

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披露

作者声明不存在与本工作相关的竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

本工作由美国国防部W81XWH-19-PRMRP-DA、美国国家过敏与传染病研究所/国立卫生研究院资助项目5R21AI153971-02以及PSF/MTF资助项目603902的研究基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 甲醛Fischer Scientific23-427098
固定垫Orfit8333.SO1/R
毛发剪Kent Scientific Corp.CL8787-KIT
CO2Various
CO2 饱和室E-Z Systems Inc.E-22000
脱毛膏Church & Dwight Co., Inc.Nair
数码相机WolfangGA100
Eppendorf 管Eppendorf22364111
眼用润滑剂DechraPuralube Ophthalmic Ointment
纱布Covidien682252
图像处理软件NIHImage J
异氟烷DechraUSP 吸入麻醉剂
直线加速器Varian Medical Systems, Inc.23EX
PBSCytivaSH30256.LS
戊巴比妥Akorn PharmaceuticalsNembutal
量角器Westcott550-1120
小动物麻醉系统E-Z Systems Inc.EZ-SA800单只动物系统
电子表格软件MicrosoftExcel
手术剪MedlineMDS0834111
手术胶带3M1538-1
胶带3MH-1113

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