建立一种稳定且可重复的辐射诱导皮肤和肌肉纤维化模型

摘要

本文介绍了一种在小鼠后肢诱导辐射诱导性皮肤纤维化并进行照射后慢性功能障碍评估的实验方案。 通过 肢体活动范围和步态指数分析用于评估功能结果。该模型阐明了辐射相关性皮肤纤维化的机制，在亚临床治疗研究中具有应用价值。

摘要

放射性皮肤纤维化（RISF）可由多种情况引起，包括癌症治疗、意外暴露或恐怖袭击事件。放射性射线可穿透皮肤，影响其路径上的各种结构，包括皮肤、肌肉和内脏器官。皮肤是首先受到辐射暴露的组织，易发生慢性纤维化，且该病症治疗困难。目前，可用于缓解放射性相关皮肤纤维化的治疗手段有限，疗效仅中等。阻碍有效防治措施开发的关键因素之一，是缺乏一种便捷且可靠的模型，以实现将实验发现有效转化至人类应用。本文建立了一种稳定且可重复的小鼠后肢皮肤纤维化模型，可用于评估潜在防治药物在功能和分子水平上的恢复效果。

采用单次40 (Gray) Gy剂量照射右后肢以诱导皮肤纤维化。受试对象在早期阶段出现水肿和皮炎，随后出现明显的皮肤收缩。照射肢体在随后的数周内表现出显著降低的关节活动范围。在晚期阶段，急性副作用减轻，但慢性纤维化仍然持续。此外进行步态指数检测作为一项功能评估实验，结果表明功能损伤的发生。这些非侵入性方法提供了可靠的测量手段用于追踪纤维化进展，并得到组织学分析的支持。该模型所采用的辐射剂量、照射方式及照射后分析方法，为研究辐射诱导的皮肤纤维化以及评估治疗药物的有效性提供了一种严谨且可重复的技术方案。

引言

皮肤是人体最大的器官，覆盖并保护身体免受各种危害。皮肤可分为三个 distinct 层次：表皮、真皮和皮下组织。每一层都有其独特的功能：表皮可防止脱水和微生物侵入；真皮含有丰富的细胞网络和细胞外基质，赋予皮肤抗张强度和弹性¹；真皮层内还分布着感觉受体、毛囊、腺体以及淋巴和毛细血管网络的血管。皮下组织（又称皮下脂肪组织）富含脂肪组织，能够塑造身体轮廓并分散机械应力^2,3,4。

由事故、战争、恐怖主义或治疗应用产生的辐射以线性渐进方式穿透人体，导致皮肤成为首个接触辐射的器官。由于工业、医疗机构和军事设施中放射性材料的使用日益增加，此类事件的威胁已显著加剧⁵。临床上，皮肤辐射损伤表现为皮肤辐射综合征（CRS），这是急性辐射综合征（ARS）的四种亚综合征之一。皮肤对电离辐射的反应对于治疗及防止进一步损伤具有重要意义⁶。当辐射损伤合并烧伤和创伤等并发损伤时，临床结局将更加复杂⁷。皮肤受辐射暴露的程度与不可逆阈值相关，超过该阈值后，其他器官功能受损将导致单个或多个器官衰竭，最终引发患者死亡

方案

动物实验伦理使用已获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，该委员会依照《动物福利法》开展工作。动物饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中，并根据美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行处理。

1. 麻醉

1. 将小鼠放入小型动物麻醉系统的箱体内（图1）。向盒子中输送4%异氟烷，等待5-10分钟，随后将异氟烷浓度降低至2-3%。
2. 确认麻醉深度 通过 脚趾挤压。涂抹眼用润滑剂以防角膜干燥。将受试动物转移至含有2%异氟烷气流的鼻锥中。
3. 采用上述技术对每只小鼠进行麻醉，以进行剃毛和肢体测量实验。对小鼠进行照射前麻醉时，采用1.25 mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射。

2. 皮肤区域准备

1. 计划在照射小鼠前 2-3 天进行剃毛。使用剪毛器修剪毛发（图 2A）。
2. 涂抹脱毛膏，静置 1-2 分钟（图 2B）。用干纱布擦去脱毛膏，再用浸有磷酸盐缓冲液（PBS）的纱布擦拭皮肤（图 ....

结果

当前照射方案的建立与优化实现了在小鼠中稳定且可重复地诱导纤维化。照射当天，将小鼠的右肢置于照射区域并固定，随后给予40 Gy的辐射剂量。

通过照射后每周拍摄图像，监测皮肤功能障碍的发生情况。照片显示，优化后的方案在第40天时可诱导纤维化，置信度为95%。在图9中展示了纤维化进展的一个示例，表现为受照射皮肤出现明显的收缩。

功能障碍是放射性纤维化最显著的特征之一；随着纤维化的进展，细胞外基质的过度重塑导致皮肤收缩和增厚。此外，放射诱发的反应还会影响邻近肌肉的功能。作者建立了膝关节伸展和基于视频的脚趾伸展检测方法，以量化肢体功能。在照射后第21天，应用40 Gy照射剂量导致照射侧肢体的活动范围较对侧未照射肢体显著减小（图10）。这一早期结果主要与水肿和皮炎等急性反应相关。随着时间推移，早期反应逐渐消退，活动范围有所改善，但由于慢性反应（纤维化）的存在，仍显著低于基线水平。该分析通常在照射后最长至42天内进行（

讨论

皮肤损伤是意外或医源性辐射暴露后可能出现的结果。由于人为错误或类似切尔诺贝利和福岛的自然灾害，核反应堆存在意外泄漏的风险^26,27。癌症治疗中的治疗性辐射暴露最为常见，通常采用分次重复给药方案，但可能在治疗区域引发与辐射相关的纤维化。这种常见的慢性不良反应在高达23%的病例中均有发生^16,28。针对纤维化的治疗干预应靶向疾病不同阶段所涉及的连续性病理机制。一种经济高效、可重复且具有临床转化潜力的小型动物模型，是进一步研究的理想选择。在本方案中，我们描述了一种可呈现皮肤纤维化病理特征的辐射诱导损伤小鼠模型。

既往研究表明，辐射引起的人类与小鼠皮肤反应及表现在形态上具有相似性^16,21。由于存在多种品系以及可用于解析损伤分子机制的基因修饰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 甲醛	Fischer Scientific	23-427098
固定垫	Orfit	8333.SO1/R
毛发剪	Kent Scientific Corp.	CL8787-KIT
CO2	Various
CO2 饱和室	E-Z Systems Inc.	E-22000
脱毛膏	Church & Dwight Co., Inc.		Nair
数码相机	Wolfang	GA100
Eppendorf 管	Eppendorf	22364111
眼用润滑剂	Dechra		Puralube Ophthalmic Ointment
纱布	Covidien	682252
图像处理软件	NIH		Image J
异氟烷	Dechra		USP 吸入麻醉剂
直线加速器	Varian Medical Systems, Inc.		23EX
PBS	Cytiva	SH30256.LS
戊巴比妥	Akorn Pharmaceuticals		Nembutal
量角器	Westcott	550-1120
小动物麻醉系统	E-Z Systems Inc.	EZ-SA800	单只动物系统
电子表格软件	Microsoft		Excel
手术剪	Medline	MDS0834111
手术胶带	3M	1538-1
胶带	3M	H-1113