使用 In Vivo 成像技术在哺乳动物宿主活跃感染期间筛选 Candida albicans 突变菌株的形态发生表型

摘要

本文描述了一种用于筛选中等规模样本的方法 白色念珠菌 利用非侵入性共聚焦显微镜，在哺乳动物宿主内活动感染期间筛选与形态发生表型相关的突变体文库。

摘要

白色念珠菌 是一种重要的人类病原体。其在不同形态形式之间转换的能力是 其发病机制；这些形态学变化受复杂信号网络的调控，该网络会响应环境刺激而发挥作用。这些调控组分已被广泛研究，但几乎所有的研究都采用了多种 体外 刺激以触发菌丝形成。为了确定形态发生如何在致病过程中受到调控，我们开发了一种 体内 显微成像系统，用于获取在哺乳动物宿主内发生菌丝形成的生物体的高空间分辨率图像。本文所述方案介绍了利用该系统筛选小型样本集合的方法 C. albicans 突变菌株，使我们能够鉴定在感染部位发生形态发生过程中的关键调控因子。文中展示了代表性结果，证明某些形态发生调控因子（如转录调控因子 Efg1）具有一致的表型 体外 和 体内 而其他调控因子（如腺苷酸环化酶 Cyr1）则具有显著不同的表型 在体 与……相比 体外.

引言

白色念珠菌 是一种常见的人类真菌病原体，可引起黏膜皮肤疾病、播散性疾病和局部组织感染¹一个关键特征是 白色念珠菌 生理学上的复杂多态性生长与其作为共生菌和病原体的双重角色密切相关^2,3,4在营养丰富的条件下 体外 在30 °C时，通常以卵圆形出芽酵母形式生长。多种环境刺激，包括营养缺乏、pH变化、37 °C培养、血清暴露以及在琼脂中包埋培养，均可诱导其转变为极性生长模式，从而形成真正的菌丝和/或假菌丝。⁵极性生长的起始及由此导致的丝状生物生长被称为形态发生。

由于形态发生对生物体的毒力具有重要意义，菌丝形成的调控机制已被广泛研究^6,7。存在一个复杂的信号通路网络和转录调控机制，可触发形态发生。尽管白色念珠菌（C. albicans）的形态发生与其致病性密切相关，但大多数研究形态发生的实验均采用体外（in vitro）刺激来诱导菌丝形成。目前越来越明确的是，不同的体外（in vitro）菌丝化模型在所激活的特定调控通路上并不完全相同。此外，尚无任何体外（in vitro）培养条件能够紧密模拟宿主内的复杂环境。鉴于白色念珠菌（C. albicans）作为人类病原体的重要性，本实验方案的目标是利用中等通量的系统，在哺乳动物宿主的主动感染过程中研究其形态发生，从而允许研究人员筛选白色念珠菌（C. albicans）突变体文库。

为了促进这些研究，一种 体内 成像系统已开发出来，使我们能够获得高空间分辨率的图像 C. albicans 使用倒置共聚焦显微镜观察麻醉小鼠耳廓感染过程中的细胞变化^8,9,10由于耳廓皮肤非常薄，因此无需进行组织解剖即可获得这些图像。因此，可在宿主组织内感染活跃部位直接测量定量表型数据。本文所述方案包括将不同荧光蛋白表达盒转化至一个参考菌株和一个或多个突变菌株中^11,12表达荧光蛋白的菌株随后混合，并共同皮内注射。感染建立后，采用共聚焦成像技术定量分析菌丝形成的频率以及所形成菌丝的长度。突变菌株获得的数据均以同一组织区域内存在的参照菌株数据进行归一化处理，从而提供内部对照。该系统已使我们能够成功筛选多个系列的 C. albicans 突变菌株，其中许多存在形态发生缺陷 体外^9,10许多菌株易于形成菌丝 体内，凸显了其重要性 体内 用于研究形态发生的模型。

方案

本方案中的研究已获得爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。有关操作BSL2级生物体的设备和程序，请参阅美国疾病控制与预防中心（CDC）的指南¹³。

1. 准备白色念珠菌（Candida albicans ）菌株

1. 选择合适的参考菌株作为阳性对照。确保该菌株在谱系和遗传操作方面与实验菌株高度相似。
   注：本文所展示的代表性实验中，突变株来源于Homann等¹⁴描述的菌株，这些菌株由SN152构建而来，均为Arg^-。因此，所选参考菌株为SN250，其同样由SN152构建，且也为Arg^-。营养胁迫在酵母Saccharomyces cerevisiae的极性生长调控中至关重要¹⁵；其在C. albicans及其他真菌的菌丝形成过程中也具有重要作用^16,17,18。因此，参考菌株应尽可能与实验菌株在营养缺陷型方面相匹配，以避免营养胁迫带来的潜在干扰效应。
2. 选择荧光蛋白表达载体。在筛选多种实验菌株时，构建一个表达一种荧光蛋白的参考菌株，并使用其他荧光蛋白标记突变菌株。
   注：本文展示的代表性数据中，参考菌株使用NEON，突变菌株使用iRFP。只要荧光蛋白表达水平高、亮度相对较强，并能被所用显微镜激发和检测，任何荧光蛋白均可使用。对照实验比较了表达不同荧光蛋白的参考菌株，未发现荧光蛋白表达对形态发生有影响。
3. 将荧光蛋白表达载体转化至菌株中。
   注：许多机构要求对C. albicans操作采取生物安全二级防护措施。所有操作均应遵守当地安全法规。无论当地法规如何，操作C. albicans的研究人员必须接受该生物体安全操作的培训。
   1. 采用标准的乙酸锂法转化参考菌株和实验菌株¹⁹。
      注：本实验中使用的质粒为pENO1-NEON-NAT^R和pENO1-iRFP-NAT^R，由Robert Wheeler博士慷慨提供^11,12。质粒使用NotI⁹进行线性化。
   2. 根据菌株在诺尔斯替星（nourseothricin）或其他相应选择性培养基上的生长情况筛选转化子。
   3. 鉴定成功转化的菌株。使用牙签从每个菌落取少量细胞，混入载玻片上2.5 µL的水滴中，盖上盖玻片，在10x–40x放大倍数下观察。使用共聚焦成像系统（本方案后续步骤所用）或任何标准的宽场荧光显微镜进行观察。合适的转化子应在相应的激发和发射波长下呈现明亮的荧光信号。
      注：在代表性结果中，表达NEON的菌株使用直立式荧光显微镜观察，配备长通滤光片组，激发滤光片为472/30 nm带通，发射滤光片为520/35 nm带通，二向色镜为495 nm单边分光镜。由于iRFP肉眼不可见，表达iRFP的菌株使用用于in vivo成像的共聚焦显微系统观察，激发光源为638 nm激光，检测发射光范围为655–755 nm。
      1. 也可使用荧光体视显微镜、手持式荧光激发系统或常用于凝胶和Western blot检测的荧光检测系统评估菌落水平的宏观荧光。
      2. 为筛选出的转化子制备冻存菌种。
4. 在注射前3天，使用牙签从冻存菌种中取少量生物体接种至YPD（酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖）固体培养基，接种表达荧光蛋白的参考菌株和实验菌株。于30 °C培养2天。
5. 在注射前1天，从多个菌落中取C. albicans细胞接种至含有25 mL YPD的锥形瓶中，每种菌株分别进行。使用牙签从一个菌落中取少量生物体加入YPD中，重复数次以获取多个不同菌落的细胞。在30 °C、175 rpm的摇床培养箱中过夜培养。
   注：使用多个菌落作为接种物来源非常重要，因为C. albicans具有较高的自发遗传变异频率。在起始接种物培养时使用多个菌落，可最大程度降低所有接种物均来源于具有显著自发变异亲本的可能性。
6. 注射当天：
   1. 取1 mL培养物，以500 x g离心2分钟。
   2. 用1 mL无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS）洗涤菌体三次。最后一次洗涤后，将菌体沉淀重悬于1 mL无菌dPBS中。
   3. 将洗涤后的菌液按1:100稀释，使用血细胞计数板进行计数。
   4. 用dPBS将洗涤后菌液的密度调整至每毫升1 x 10⁸个生物体。
   5. 对于每组待注射菌株，通过等体积混合参考菌株和实验菌株（s）制备接种物。此操作可维持接种物密度为每毫升1 x 10⁸个生物体。
      ​注：每只耳朵可评估的菌株数量受限于所用显微系统能否清晰区分每种荧光蛋白的信号。
   6. 接种物制备完成后，立即进行动物注射。接种物不得在使用前储存。

2. 动物准备

1. 获得当地机构动物护理和使用委员会或相关地方管理机构的批准。
2. 从供应商或繁育项目获取 6 至 12 周龄的小鼠。在实验开始前至少 1 周，将小鼠饲养于其在整个实验期间将生活的设施中。
   注：在代表性结果中，使用了 6 周龄的雌性 DBA2/N 小鼠。
3. 在接种前至少 7 天，给动物饲喂无叶绿素饲料。

3. 脱毛与接种

1. 诱导手术麻醉深度（图1）。
   注意：吸入性麻醉剂属于危险物质，可能引起眼睛或皮肤刺激，并对神经系统产生毒性。必须遵守所有机构的政策、程序以及实验室使用吸入性麻醉剂的一般安全规范。仅允许接受过吸入性麻醉剂使用培训的人员执行这些步骤。标准操作包括佩戴手套、实验服、眼部防护装备，使用麻醉气体清除系统，并根据机构指南进行仔细的记录。
   1. 将小鼠放入预热的麻醉诱导舱中。在整个全身麻醉过程中，保持动物处于温暖环境中。可通过专为此目的设计的加热垫和预热的显微镜载物台实现。切勿使用市售加热垫，因其可能过热并导致烧伤。
   2. 向诱导舱中通入2%–3%异氟烷，直至小鼠失去翻正反射，且呼吸缓慢而稳定。清除诱导舱内的麻醉气体后，将动物转移至提供1%–2%异氟烷的非重复呼吸鼻罩。
   3. 通过脚趾夹捏反射或其他验证机制确认麻醉深度。在整个实验过程中，持续监测动物的呼吸模式和麻醉状态，并根据需要调整麻醉剂浓度。
   4. 涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。
2. 脱毛（图1C、D）
   1. 使用棉签将市售脱毛膏充分涂抹于双耳的内侧和外侧表面。
   2. 2–3分钟后（或按照产品说明书指示），用干燥的纱布轻轻擦拭耳朵，去除所有脱毛膏和毛发。再用浸有无菌水的纱布擦拭两次，彻底清除残留的脱毛膏。若未完全清除脱毛膏，将导致皮肤刺激或炎症。
3. 注射（图1E、F）
   1. 用浸有70%乙醇的纱布擦拭待注射耳部表面，随后自然晾干。
   2. 通过反复倒置或涡旋充分混匀接种物。
   3. 用胰岛素注射器吸取20–30 µL接种物。持注射器使针头朝上，轻弹针筒，确保筒内空气位于顶部。小心将空气和多余接种物排回接种管或废液管中，使活塞位于10 µL刻度处。
   4. 将非惯用手的指端或拇指戴上指套，用指套包裹固定耳朵以稳定耳部。或者，将市售双面皮肤胶带（时装胶带）贴于小型锥形或圆底塑料管上，再将耳朵搭在胶带上。操作时注意不要移位麻醉鼻罩。可将鼻罩用胶带固定于工作台面以助稳定。
      注：可根据操作者的舒适度选择耳部内侧或外侧进行注射。若用于显微成像，应确保将小鼠放置成注射侧耳面朝向物镜。
   5. 保持注射器针头几乎与皮肤完全平行，避开较大的静脉，将针尖刺入皮肤最外层，直至斜面刚好没入皮肤。
   6. 缓慢进行皮内注射。成功的皮内注射会在皮肤下形成一个小鼓包。注射后保持针头在原位15–20秒再拔出，以尽量减少渗漏。
      1. 若动物耳部下方变得湿润，说明针头过深，已穿透耳部。此时应在耳部另一区域重新注射。
   7. 使用动物的另一只耳朵重复上述过程。可使用相同的C. albicans菌株进行重复实验，也可使用不同的C. albicans菌株组合。
   8. 若不立即进行成像，将动物置于预热的恢复舱中。观察动物直至其从麻醉中恢复，然后将其放回饲养笼中。
   9. 根据机构规程，应在笼具上清晰标注生物危害标识，并注明笼内动物感染了Candida albicans。
   10. 完成与动物麻醉相关的所有必要记录，以及机构要求的其他所有记录工作。
   11. 在动物设施中饲养时，应采取动物生物安全二级（ABSL-2）防护措施。

4. 定量分析 体外 形态发生，用于比较 体内 结果

1. 使用制备接种物时所用的相同洗涤培养物，将生物体以1:50的比例稀释于RPMI1640 + 10%热灭活胎牛血清中，并在37 °C下旋转孵育4小时。或者，也可使用其他可诱导形态发生的培养基 体外 可以使用。
2. 将样品在500 × g条件下离心5分钟 g 用0.5 mL dPBS重悬。
3. 将样品按1:10的比例稀释，取2.5 µL稀释后的样品置于显微镜载玻片上，盖上盖玻片。
4. 使用荧光显微镜观察样品。每种菌株至少计数100个细胞，记录酵母状细胞和丝状细胞的数量。在本研究展示的代表性结果中，丝状细胞定义为长度超过母细胞长度两倍的任何细胞。
   ​注意：定量分析 体外 形态发生可在动物接种的当天进行。可以在此时启动 体外 在制备接种物进行注射的同时开展形态发生实验，并在4小时孵育期内完成动物接种。若所有动物实验操作在4小时孵育期结束前已完成，则直接进入观察阶段 体外 刺激后的细胞。或者，可将细胞在步骤4.2中重悬于含3.7%甲醛的dPBS中，并于4 °C保存数天。固定后的生物样本可根据时间安排后续进行定量分析。动物接种不得因此而延迟 体外 定量检测

5. 准备工作 体内 成像

1. 准备显微镜（图2A）。
   1. 打开所有显微成像设备，并启动成像软件。
      1. 如有预设的成像参数，加载这些成像设置。
      2. 激活用于检测所用荧光蛋白的激光器和探测器。
   2. 打开加热显微镜载物台，并使其升温至37 °C。
      注意：也可使用带有完全封闭环境培养箱的显微镜，而非加热载物台。
   3. 设定z轴参考点，使焦平面位于盖玻片的上表面。  可通过将盖玻片用胶带固定在载物台开口上方，并在盖玻片上滴加一滴水来实现。  使用低倍率（10倍）“干”物镜对准水滴边缘进行聚焦，然后设定z轴参考点。  在从载物台上取下盖玻片前，使用一块吸水纸巾吸干盖玻片上的水分。
   4. 将工作距离极长的物镜旋转到位，并在镜头上滴加一滴浸油。降低物镜位置，以避免放置盖玻片时可能造成的损坏。
   5. 在载物台开口上方放置一片#1.5盖玻片，并用胶带固定。确保胶带完全覆盖盖玻片的所有边缘，以防止液体渗入盖玻片下方进入显微镜。将物镜抬升至z轴参考点 ，使浸油同时接触物镜和盖玻片。
   6. 预先准备好多段压敏胶带，以便在定位鼻罩和小鼠时随时使用。
2. 按照前述方法（步骤3.1）对需成像的小鼠实施全身麻醉。
3. 定位小鼠（图2B-D）。
   1. 将麻醉用鼻罩固定在显微镜载物台上，调整鼻罩位置，使其在小鼠处于成像位置时能完全覆盖其鼻部。此操作由两名研究人员协作完成更为方便：由第一位研究人员将麻醉后的小鼠鼻部插入鼻罩，并在持续固定鼻罩覆盖小鼠鼻部的同时，将小鼠移至成像位置；由另一位研究人员用胶带将鼻罩及其导管固定，确保其稳定地位于小鼠鼻部上方。鼻罩一旦固定，整个成像过程中应保持原位不动。
   2. 确定鼻罩的最佳位置后，标记其位置。在后续的成像实验中，可在将动物带至显微镜前预先将鼻罩固定在载物台上。
   3. 在物镜上方的盖玻片上滴加一滴无菌水。
   4. 将小鼠放置在显微镜载物台上，确保耳部位于水滴上方，并紧贴盖玻片。
   5. 使用第二片（上方）盖玻片压平耳部。
      1. 将盖玻片边缘与小鼠身体平行放置，使其边缘接触小鼠头部与耳部连接处。
      2. 以铰链式动作将盖玻片的自由边缘缓慢放下至显微镜载物台。当盖玻片接触载物台时，会自然压平耳部。操作时注意避免在耳部形成褶皱或隆起。
      3. 牢固地用胶带固定上方盖玻片，使其施加的压力恰好足以保持耳部平整。注意避免将小鼠的毛发或胡须粘入胶带中。
   6. 除非使用带有环境控制舱的显微镜，否则应用无菌手术单松散覆盖小鼠身体，以维持其正常体温环境。
4. 确定感兴趣区域。
   1. 确保物镜位于z轴参考点。
   2. 使用白光/宽场成像，调节焦平面进入耳部组织。一种有效策略是聚焦于血管：若能观察到红细胞在血管中流动，则表明焦平面已位于组织内部。
   3. 若显微镜配备宽场荧光成像功能，可使用该模式识别感兴趣区域；否则使用共聚焦成像。通常，使用宽场显微镜识别感兴趣区域速度更快，且对耳部组织的光照射更少。
      1. 使用适用于检测参考菌株表达的荧光蛋白的滤光片组，寻找一个来自参考菌株的荧光信号明显的视野。需注意，离焦光信号可能妨碍对单个生物体的清晰聚焦。此步骤的目的是确定一个用于共聚焦成像的感兴趣区域。
      2. 切换至可检测实验菌株表达的荧光蛋白的滤光片组，确认实验菌株在选定视野中的存在。

6. 成像

1. 确定设置。
   1. 在成像软件处于共聚焦实时模式时，随着焦平面沿 z 轴移动，观察目标区域。选择一个来自所有所用荧光蛋白的信号均较强的 z 轴平面。
   2. 调整激光功率和/或成像速度，以获得足够强的信号，从而能够确定视野中所有细胞的形态。为避免组织损伤，应使用尽可能低的激光功率。
      注意：与所有成像一样，激光功率、采集速度和分辨率之间需要权衡。应确定一组参数，既能清晰识别生物体形态，又能平衡速度与激光功率，以最小化对耳部组织的照射。由于成像是透过表皮外层进行的，所需的激发激光功率高于通常在载玻片上固定的传统样本共聚焦成像所需水平。幸运的是，形态学分析所需的分辨率并不极端，因此在不造成组织损伤的前提下，获得足以确定生物体形态的强信号图像是完全可行的。
   3. 一旦确定了这些参数，在整个成像过程中应保持使用这些设置，并作为后续成像会话的起点。因此，建议保存成像设置。
      注意：感染区域在组织内的深度可能有所不同，较深的区域可能需要提高激光功率。由于本实验依赖于信号的空间分布而非其强度，因此可根据需要在不同视野之间调整成像设置。
2. 获取图像。
   1. 选择一个视野，其中参考菌株具有清晰的菌丝结构，并且大多数生物体分布足够分散，以便能够确定其形态。
   2. 设定 z 层扫描的顶部和底部焦平面。无需覆盖整个感染区域的深度，但需注意，位于成像体积顶部或底部的生物体通常会被排除在分析之外。
   3. 采集 z 层图像，对每个通道进行伪彩着色以区分不同菌株，并将各通道叠加。保存图像。
   4. 对其他视野重复上述步骤。形态发生可能因位置而异，因此从每只耳朵获取并分析至少三个视野至关重要。

7. 手动二维分析：菌丝形成频率

1. 使用成像软件将 z 轴层叠图像进行最大强度投影，生成二维图像。此处提供的操作说明适用于 FIJI/ImageJ。
   1. 使用 ImageJ 软件打开显微镜图像。
   2. 如有必要，为每个通道应用伪彩色，以便于直观区分不同的 C. albicans 菌株。具体操作为：点击 Image > Lookup Table > LUT Color ，然后选择所需的伪彩色。
   3. 将堆叠文件转换为最大强度投影的二维图像：
      1. 选择 z 轴堆叠文件，点击 Image > Stacks > Z Projection。
      2. 设置顶部和底部层面，并选择投影类型为 Max Intensity。
2. 根据菌株类型（通过通道颜色区分）和形态，对最大投影图像中观察到的每个微生物个体进行计数。
   1. 显著重叠的微生物或微生物密度极高的区域难以准确计数。应将这些区域排除在计数之外，但需注意避免对更易发生重叠的丝状形态产生偏倚。
   2. 沿 z 轴方向垂直伸入或伸出成像平面的丝状结构在最大投影图像中会呈现为小的圆形物体。同样，被图像边界截断的微生物可能因丝状部分超出视野而被误判为酵母形态。因此，二维分析总会高估酵母形态所占的比例。由于这种情况在对照菌株和实验菌株中均会同等发生，因此应始终将实验结果与对照菌株进行比较。
3. 根据实验设计要求，对结果进行统计学比较。

8. 手动二维分析：丝状结构长度

1. 对于 C. albicans，异常菌丝形成可能由以下原因导致：a) 较少的"母代"酵母细胞发生形态转变，b) 菌丝生长速率较慢，或 c) 菌丝生长虽被启动但无法持续。为评估这些可能性，可量化最大投影图像中每根菌丝的曲线路径长度，以此作为真实三维长度的替代指标（如下所述）。
   1. 当母细胞上正在形成芽体时，无法判断其将发育为菌丝还是酵母细胞。为确保本分析仅包含菌丝状细胞，仅测量子代细胞长度至少为母细胞两倍的个体。
2. 打开在步骤7中生成的最大投影图像。
3. 在 ImageJ 工具栏中，右键单击直线/分段线工具，并选择选项分段线。分段线工具允许用户沿弯曲路径测量菌丝长度，这对于具有高度可塑性的 C. albicans 菌丝而言是必要的。
4. 从芽颈开始测量至菌丝生长末端的长度。在芽颈处左键单击，指针将变为一个小方块；沿菌丝长度方向进行追踪，在菌丝出现弯曲、转折或长轴方向改变的位置，每次均点击菌丝中心，最后在菌丝尖端双击。
5. 按下Control + M，将弹出一个窗口，列出面积、平均值、最小值、最大值和长度等测量数据。每次测量完一根菌丝后，再次按下Control + M，将当前测量值添加至测量数据表中。
6. 当所有菌丝均完成测量后，将长度测量数据复制并粘贴至数据分析文件中。
7. 进行统计分析，以评估参考菌株与突变菌株中菌丝长度的分布情况。

9. 手动三维分析

1. 为了更精确地测量形态发生过程，避免对酵母形态的高估，并可能区分假菌丝与菌丝，可手动上下滚动 z 轴层叠图像，同时在三维空间中评估每个生物体的形态。
2. 或者，构建每个 z 轴层叠图像的三维图像，并在旋转图像的同时分析每个生物体的形状。

10. 自动化分析

1. 使用成像软件，在二维或三维条件下自动计数生物体并分析其形态。
   注意：某些用于区分形态类型的算法可能引入偏差。因此，自动化策略需根据实验设计进行仔细验证。设计良好且经过验证的自动化图像分析可提高分析步骤的通量。

结果

本文所示结果基于已发表的文献报道^9,10本分析的目的是定量评估突变体的能力 C. albicans 菌株在活跃感染期间经历形态发生。在三维复杂环境中生长的生物体中，区分假菌丝与菌丝的典型参数可能难以评估 体内 环境。在观察共聚焦成像所产生的二维截面时，这一特点尤为明显。因此，本筛选分析的重点在于鉴定以丝状体形式生长的生物与酵母形态生长的生物。对于后续需要更深入分析（包括三维重建）的研究，可对该方法进行调整，以区分酵母、菌丝和假菌丝。

在参考菌株或突变菌株中荧光蛋白的表达 C. albicans 可简便检测菌株形态 体内 (图3 和 图4）。通常情况下，定量光镜分析应在图像中极少或没有像素饱和时进行效果最佳。然而，在本实验方案中，图像的饱和往往有助于简化分析。荧光蛋白在细胞内的定位并非均匀分布，通常在母细胞酵母中的信号强于菌丝部分。幸运的是，在研究形态发生时，信号的空间分布而非其强度决定了实验结果。因此，在本检测中，获取大量像素饱和的图像反而有助于更准确地量化形态发生过程。

为了说明评估形态发生的重要性 体内，展示了参考菌株（SN250）及两种突变株的代表性结果：一种缺失转录因子Efg1，另一种缺失腺苷酸环化酶Cyr1。 体外，这两种菌株均不以菌丝形式生长^20,21. 当培养时 体外 在添加10%血清的RPMI培养基中，参考菌株迅速形成菌丝，而 efg1ΔΔ 和 cyr1ΔΔ菌株不会图3 和 图4）。在这些条件下， efg1ΔΔ突变体表现出一定程度的极性生长，子代细胞相较于母代细胞略有伸长。这凸显了明确界定丝状生长的重要性。任何此类定义本质上都具有一定的任意性，但为表型的一致评估所必需。在本研究中，丝状生长模式被定义为子代细胞的最长维度超过母代细胞两倍以上的生长状态。根据此定义，伸长的 efg1ΔΔ细胞不具丝状结构。

与其一致 体外 表型，该 efg1ΔΔ 表现出显著的丝状化缺陷 体内约 9% efg1ΔΔ细胞以丝状形式生长 体内 (图3）。相比之下，53%的 cyr1ΔΔ突变细胞以丝状形式生长 体内 (图4）。尽管数量 cyr1发生丝状化的ΔΔ突变细胞 体内 显著低于参照菌株，该菌株的 cyr1ΔΔ突变体形成菌丝 体内 与完全缺乏形态发生的情况相比，代表了显著的变化 体外在形态上，由...形成的丝状结构 cyr1ΔΔ突变体似乎比参考菌株更短。为了进行定量评估，使用丝状细胞的二维投影来测量其曲线路径长度 体内 图像（图4E）。中位长度 cyr1ΔΔ菌株的菌丝比参考菌株短29%。

图1：麻醉与接种。（A）使用诱导室进行麻醉诱导。（B）通过鼻罩维持麻醉，以便根据需要调整小鼠体位。（C）使用棉签涂抹脱毛膏。已涂抹眼用润滑凝胶以保护麻醉期间的眼睛。（D）右侧耳部脱毛效果良好，与未经处理的左侧耳部形成对比。（E）将C. albicans皮内注射至小鼠耳部。使用两端贴有双面胶带（时尚胶带）的锥形管尖端固定耳部。（F）皮内注射的特写。皮肤上形成苍白的隆起水泡，表明皮内注射成功。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：成像前准备。（A）显微镜载物台已准备就绪，用于成像。麻醉鼻罩已固定到位。盖玻片用胶带固定在载物台上，覆盖物镜开口。另有备用胶带。加热载物台已预热至 37 °C（图中未显示）。（B）将麻醉后的小鼠放入麻醉鼻罩中。（C）轻微旋转小鼠，使其接种侧耳朵朝向底部盖玻片/物镜方向。然后将耳朵压平贴紧底部盖玻片，并通过在耳朵上方放置第二块盖玻片将其固定。（D）用胶带将上方的盖玻片固定在载物台上，以确保耳朵相对于显微镜载物台保持稳定位置。请点击此处查看该图的放大版本。

图3: 体外 和 体内 形态 efg1ΔΔ突变菌株 (A) WT 和 efg1ΔΔ 突变株之后 体外 在RPMI + 10% 血清培养基中于37 °C培养细胞4小时以诱导菌丝形成。比例尺表示10 µm。使用图像编辑软件调整图像对比度以方便观察。B) 菌丝形成百分比 体外 在野生型（WT）和 efg1ΔΔ突变菌株。Und = 未检出（未观察到菌丝）。柱高表示三次独立实验中菌丝状细胞百分比的中位数，每次实验至少统计100个细胞。误差线表示标准差（结果通过学生t检验进行比较） t-检验， p < 0.001). (C共聚焦显微镜图像显示野生型（绿色）和 efg1ΔΔ突变体（红色）生长 体内 接种后24小时。箭头指示示例 efg1ΔΔ突变细胞，符合我们对“丝状”的定义。比例尺代表50 µm。D) 菌丝形成百分比 体内 在野生型（WT）和 efg1ΔΔ 突变菌株。柱高表示两次独立实验中丝状细胞百分比的中位数。误差线表示标准差（结果通过学生t检验进行比较） t-测试， p < 0.001). 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4: 体外 和 体内 形态 cyr1ΔΔ突变菌株 (A宽场图像的 cyr1ΔΔ 突变株之后 体外 在RPMI + 10%血清培养基中于37 °C培养细胞4小时以诱导菌丝形成。比例尺为10 µm。使用图像编辑软件调整图像对比度以方便观察。B) 菌丝形成百分比 体外 在野生型（WT）和 cyr1ΔΔ突变菌株。Und = 未检出（未观察到菌丝）。柱高表示三次独立实验中菌丝状细胞百分比的中位数，每次实验至少统计100个细胞。误差线表示标准差（结果通过学生t检验进行比较） t-测试， p < 0.001). (C) 野生型（绿色）和突变型的共聚焦显微图像（绿色）及 cyr1ΔΔ突变体（红色）生长 体内 接种后24小时。比例尺为50 µm. (D) 菌丝形成百分比 体内 在野生型（WT）和 cyr1ΔΔ 突变菌株。柱高表示两次独立实验中丝状细胞百分比的中位数。误差线表示标准差（结果通过学生t检验进行比较） t-测试， p < 0.001). (E) 丝状结构长度分布 体内，通过z轴堆叠图像的二维投影中的曲线路径长度来测量。每个点代表一条丝状结构的长度。以酵母形态生长的细胞未被纳入此分析。条形表示丝状结构长度的中位数。使用Mann-Whitney U检验分析时，长度分布具有显著差异（p < 0.001). 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

该模型利用共聚焦显微镜获取图像 C. albicans 生物体在哺乳动物宿主组织内生长时的形态发生表型，从而能够在活跃感染过程中评估形态发生表型。形态发生过程在 C. albicans 发病机制，并已通过多种方法被广泛研究 体外 检测方法^2,3,4。然而，没有 体外 该检测方法能够完全模拟宿主复杂的生物化学和结构环境。

本方案重点介绍此方法的使用 体内 成像系统用于筛选一系列/文库 C. albicans 突变体以鉴定感染过程中参与形态发生的基因。利用 C. albicans 表达不同荧光蛋白的菌株使我们能够定量分析 体内 形态发生 C. albicans 与参考菌株相比，突变菌株的形态发生情况在相同感染区域进行比较，可确保生物体处于相同的环境条件下。这使得我们能够对发生菌丝化的细胞百分比以及菌丝化程度进行定量测量。将突变菌株的测量结果相对于参考菌株进行归一化处理，有助于更准确地比较不同突变菌株之间的表型差异。

此处展示的代表性结果表明，in vitro 与 in vivo 表型之间可能存在显著差异。C. albicans efg1ΔΔ 突变株通常被用作形态发生实验的阴性对照，因其在几乎所有 in vitro 条件下均无法形成菌丝²⁰。尽管 in vivo 结果与 in vitro 结果非常相似，但即使是这种严重受损的菌株，偶尔也能在宿主组织环境中形成菌丝（图 3）。这凸显了宿主环境在诱导形态发生方面的强大作用。

相比之下， cyr1ΔΔ突变菌株表现出显著的不一致性 体外 和 体内 生长；尽管没有一种突变细胞发生丝状化 体外大约一半的细胞以丝状形式生长 体内 (图4)^10,21有趣的是，这些丝状结构明显短于参考菌株形成的丝状结构，表明 CYR1 有助于影响菌丝生长速率或维持丝状表型的能力。为便于分析菌丝长度，采用图像的二维投影测量菌丝的曲线路径长度。对于在三维空间中生长的菌丝的二维投影，任何沿非平行于成像平面轴向生长的菌丝 xy 平面投影中的长度将短于其真实长度。由于参照菌株也会出现相同的缩短效应，因此对二维投影中丝状结构长度分布的评估仍可实现参照菌株与突变菌株之间的定量比较。相较于三维分析，二维条件下的丝状结构长度分析所需图像处理工作量更小，因此可在普通台式计算机上相对较快地完成。采用这种简化的分析方法，可将丝状结构长度分布纳入筛选流程，从而在不显著降低通量的前提下，更细致地评估各突变株进行形态发生的潜力。

此处展示的代表性研究使用了DBA2/N小鼠，该品系小鼠的补体系统存在缺陷，导致无法将中性粒细胞募集至炎症部位 C. albicans 感染²²这些研究的目的是探讨调控机制 C. albicans 在宿主组织内的菌丝形成。因此，选用DBA2/N小鼠以避免因特定品系对中性粒细胞的易感性或抗性而干扰实验结果。随着中性粒细胞的抗C. albicans 反应可能影响丝状化过程²³，中性粒细胞向感染部位的募集可能会影响形态发生实验的结果。如果某菌株具有形成菌丝的能力 体内 但当中性粒细胞存在时，菌丝形成会受到强烈抑制，因此在DBA2/N小鼠中可检测到菌丝形成，而在具有完整中性粒细胞趋化功能的小鼠中则难以观察到该现象。因此，选用作为宿主的小鼠品系是使用本方案时的一个重要因素。

观察到的现象是 efg1ΔΔ突变菌株无法形成菌丝 体内 不太可能与宿主中性粒细胞反应相关，因为该菌株同样无法形成菌丝 体外观察到的丝状化现象 体内 与 cyr1ΔΔ突变株与其无法形成菌丝的现象不一致 体外斑马鱼模型的数据 C. albicans 感染表明，响应的中性粒细胞在抑制形态发生过程中具有重要作用²⁴因此，使用缺乏中性粒细胞反应的DBA2/N小鼠不太可能解释菌丝形成增加的现象 cyr1ΔΔ 体内 与……相比 体外然而， 体内 环境显然正在影响形态发生过程 cyr1ΔΔ菌株；因此，对该菌株的进一步研究可能提供有关调控机制的重要信息 C. albicans 活性感染期间的形态发生。此处描述的方案设计为一种筛选实验，用于鉴定诸如 cyr1ΔΔ突变株可用于未来的研究。

使用低流量气体麻醉系统对此方案非常有帮助（图1A、B）。在本方案的初期开发阶段，小鼠采用氯胺酮与赛拉嗪混合的注射麻醉剂进行麻醉。尽管使用该麻醉方法可进行有限的成像，但麻醉持续时间难以预测，必须快速结束成像过程，以避免小鼠在成像期间从麻醉中苏醒。传统的吸入式麻醉系统体积庞大，且需要高流量的麻醉气体，通常必须在通风橱内使用。因此，在共聚焦显微镜有限的空间条件下，使用传统吸入式麻醉系统极为困难，且可能无意中使研究人员暴露于麻醉剂中。采用低流量吸入式麻醉系统可在为动物提供稳定麻醉的同时，保障操作人员的安全。低流量鼻罩便于动物在接种和显微成像过程中的准确定位。小口径、低容积的输送管路可使用相对较长的管道，使麻醉机可放置在足够远的位置，避免干扰显微成像操作。

普通小鼠饲料中的叶绿素会导致组织产生显著的自发荧光²⁵。这会在图像中引入大量背景噪声，使得获取高质量、高空间分辨率的图像变得困难。在成像前让动物食用无叶绿素饲料7天，可显著降低组织中的自发荧光背景，但沉积在毛发中的叶绿素仍会造成干扰。使用市售的化学脱毛膏去除耳廓上的毛发，可有效减少毛发产生的自发荧光（图1C、D）。因此，结合使用无叶绿素饲料和充分的脱毛处理，可显著降低自发荧光，大幅提高图像质量。由于在成像前已去除耳部毛发，动物毛发的颜色不会影响该成像系统。本方案已成功用于研究白色念珠菌（C. albicans）在BALB/c（白色）、C57BL/6（黑色）和DBA2/N（棕色）小鼠中的感染。该方案也可用于缺乏不同宿主基因的C57BL/6基因敲除小鼠，从而为今后研究哺乳动物宿主免疫系统如何影响菌丝形成提供可能。本模型的一个特点未在本方案中详细讨论：由于该成像系统具有非侵入性，同一动物可在数天内多次成像，从而实现对单个感染过程的动态追踪。这一特点将在未来关于宿主-病原体相互作用的研究中发挥关键作用。

总之，本方案可获得高空间分辨率的图像 C. albicans 在活体哺乳动物宿主组织中生长，从而实现对突变菌株形态发生过程的准确评估^8,9,10. 本文展示的结果说明了如何利用该方案对文库进行筛选 白色念珠菌 突变体。在 C. albicans 迄今为止检测的突变体中，具有已知形态发生缺陷的突变体占很大比例 体外 易于发生丝状化 体内^9,10。这凸显了包含一个 体内 此类系统在旨在阐明机制的实验中 C. albicans 发病机制

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 盖玻片	Thermo-Fisher	20811	足以覆盖万能载物台开口的尺寸
0.1 mL 胰岛素注射器	EXELint	26018	可使用5/16规格的注射器"–1/2" 长且29–32 G
dPBS 中的 3.7% 甲醛	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% 乙醇/30% 水	Decon Laboratories	A05061001A
酒精消毒片	Covidien	5110	替代方法：用70%异丙醇浸泡的纱布垫
白色念珠菌 参考菌株和实验菌株	SN250	FGSC 在线目录	特定的 白色念珠菌 菌株的选择因实验和研究者的目标而异。我们使用了源自 SC5314 的菌株以及其他临床分离株。
无叶绿素小鼠饲料	Envigo	2920x
计算机	Dell	Optiplex 7050	能够运行成像软件以进行图像采集与分析的计算机。多种成像软件可供选择，具体取决于所使用的显微镜型号及用户系统。
棉签 applicator	Pro Advantage	76200
DBA2/N（6-12 周龄小鼠）			BALB/c 和 C57/BL6 小鼠也可使用。  后者可利用广泛可用的基因敲除小鼠模型，以及通过荧光蛋白的表达来标记特定细胞类型（如吞噬细胞）的小鼠模型。
用于将织物固定在皮肤上的双面胶带（时尚胶带）	当地药店或杂货店		专为固定衣物与人体皮肤接触位置而设计的双面胶带。  这通常可在药店和各类商店的非处方药区域购得。  必须使用这种类型的胶带，因为它专为轻柔粘附皮肤而设计。  示例：  https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&和关键词 时尚胶带&qid=1649174406&sprefix= 时尚胶带,配件,70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&和关键词 时尚胶带&qid=1649174320&sprefix= 时尚胶带、配件、70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&和关键词 时尚胶带&qid=1649174406&sprefix= 时尚胶带、配件、70&sr=8-29
杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	必须无菌；每次实验均需打开新的容器
胎牛血清	Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
纱布垫	Pro Advantage	P157112
凝胶眼润滑剂	当地药店或杂货店
ImageJ 或 FIJI 分析软件	美国国立卫生研究院	ImageJ（FIJI）
异氟烷	Akorn	J119005
Leica DMi8（SP8平台）配Leica 11506375物镜镜头	Leica	DMi8（SP8）	物镜  （Leica 11506375）在此使用  使用25倍水浸物镜，可在近似耳组织折射率的条件下提供高数值孔径（0.95）。 显微镜（Leica DMi8（SP8平台））配备488 nm和638 nm半导体激光线，并具有无滤光片  使用计算机控制的可调带宽进行发射光检测的光谱检测。 载物台必须留有足够的空间，以确保物镜能够到达底部盖玻片处，而不会与载物台发生碰撞。
低流量麻醉系统或传统麻醉蒸发器	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair 脱毛乳液	当地药店或杂货店		非处方脱毛霜
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR 质粒			荧光蛋白表达转化载体  由 Robert Wheeler 博士慷慨提供（Seman 等，2018，Infection and Immunity；Bergeron 等，2017，Infection and Immunity）
压力敏感型实验室胶带	胶带 & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640细胞培养基	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
塑料15 mL锥形管或Falcon 5 mL圆底聚苯乙烯管	Falcon	352196	在注射过程中安全固定动物耳朵