本方案描述了从小鼠胸腺中分离双阴性胸腺细胞，随后进行逆转录病毒转导，并在表达Delta样配体4的骨髓基质细胞系共培养系统（OP9-DL4）上进行共培养，以进一步开展功能分析。
本文内容
摘要
摘要
转导的小鼠未成熟胸腺细胞可分化为T细胞 体外 使用表达Delta样4的骨髓基质细胞系共培养系统（OP9-DL4）。由于逆转录病毒转导需要细胞分裂才能实现外源基因整合，OP9-DL4提供了适宜的 体外 用于培养造血祖细胞的环境。在研究特定基因表达对正常T细胞发育及白血病发生影响时，这一方法具有显著优势，因为它使研究人员能够避免耗时的转基因小鼠制备过程。为获得成功结果，必须仔细执行一系列协调步骤，涉及对不同类型细胞的同步操作。尽管这些操作流程已相当成熟，但文献中缺乏统一的参考来源，往往需要进行一系列优化，耗费大量时间。本方案已被证实可高效实现原代胸腺细胞的逆转录病毒感染，随后在OP9-DL4细胞上诱导其分化。本文详细描述了一种优化后的共培养实验流程，可作为逆转录病毒转导胸腺细胞在OP9-DL4基质细胞上共培养的快速操作指南。
引言
OP9 骨髓基质细胞系提供了一种有用的工具 体外 从多种前体细胞来源诱导淋巴生成的系统1早期使用OP9细胞的研究表明，由于OP9细胞系不表达巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），因而能够支持由骨髓来源的造血干细胞（HSCs）分化为造血细胞和B细胞，这一特性随后也在胚胎干细胞（ESCs）中得到证实。2,3,4,5在以往的研究中，表达delta样1/4的OP9细胞（OP9-DL1/OP9-DL4）的建立实现了T细胞谱系分化的诱导6 并成功展示了重现胸腺成熟过程的能力7,8简而言之，T细胞的发育过程可通过CD4和CD8分子的依次表达来描述。未成熟的胸腺细胞为 "双阴性" （DN，CD4− CD8−）并可根据CD44和CD25的表面表达进一步细分。DN胸腺细胞依次经历未成熟单阳性（ISP）阶段（小鼠以CD8表达为特征，人类以CD4表达为特征）、双阳性（DP）阶段（以CD4和CD8共表达为特征），最终发育为成熟单阳性阶段（以表达CD4或CD8为特征）。9造血干细胞（HSCs）表达 Notch1 受体，该受体通常与胸腺上皮细胞表达的 Delta-like 4（DL4）相互作用，以诱导T系分化10因此，人们对OP9-DL1/4模型的兴趣逐渐增加，导致过去二十年中该方法被广泛应用于多种研究领域。8,11,12,13尽管DL1和DL4均能支持T细胞分化 体外 它们表现出不同的需求 体内，少数研究指出，OP9_DL4 在模拟小鼠胸腺微环境方面比 OP9_DL1 更为高效7,14.
在OP9-DL1/4系统的潜在应用中，尤其引人关注的是将该系统与逆转录病毒载体对DN细胞或造血干细胞（HSCs）的转导相结合。这种组合是调控正常T细胞发育及白血病发生过程中基因表达的有效手段，并已被证明是一种高效诱导或抑制目的基因功能的方法15,16,17。该模型在研究驱动白血病的癌基因之间的协同作用方面已取得特别成功的应用15，因其具有灵活性，能够在合理的时间内检测多种基因组合的影响，相较于构建转基因小鼠更为高效。此外，类似的模型此前已被用于评估将癌基因导入正常细胞后所产生的效应15,16,17。另外，逆转录病毒转导需要细胞处于分裂状态才能实现转基因的整合18；尽管慢病毒转导可通过无需细胞分裂即可完成转基因整合来克服这一限制，但我们尚未成功使用慢病毒载体对DN胸腺细胞实现有效转导。因此，OP9-DL1/DL4是培养造血祖细胞的适宜工具。
在OP9-DL4细胞上进行转导胸腺细胞淋巴生成的标准方案涉及一系列协调的步骤，必须谨慎操作才能获得成功的结果。尽管这些技术已为科研领域服务多年，但文献中提供的方案往往较为分散。因此，每个实验室都不得不自行调整和优化实验流程的不同阶段，这可能耗费大量时间。本文所述方案详细介绍了从小鼠胸腺中分离DN期胸腺细胞，随后进行逆转录病毒转导，并在OP9-DL4基质细胞上共培养以进行进一步功能分析的过程。该成熟方案已被证实可高效且可重复地转导原代胸腺细胞，并可在OP9-DL4细胞上诱导其分化或引发T细胞急性淋巴母细胞白血病15。
方案
所有所述动物实验均经美国国立卫生研究院（NIH）机构生物安全委员会（IBC）和动物护理与使用委员会（ACUC）批准。有关本实验方案中使用的所有试剂和材料的详细信息，请参见材料表。有关逆转录病毒生产细胞的培养与维持操作的更多细节，请参考已发表的指南19 。有关本实验方案的总体流程，请参见图1。
1. 启动 OP9-DL4 细胞培养（第1天）
- 将冻存的OP9-DL4细胞置于37 °C水浴中，轻轻振荡，快速解冻。立即转移至含有5 mL OP9培养基（MEM-α培养基、10%胎牛血清、50 U/mL青霉素/链霉素、55 µM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺）的离心管中，以去除冷冻保护剂。
- 在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，用1 mL OP9培养基重悬细胞。
- 向T25培养瓶中加入5 mL OP9培养基，并将重悬的细胞加入该培养瓶中。在37 °C、5% CO2条件下培养。
- 培养2–3天后，按1:3比例传代（每周一、三、五传代一次）。
注意：在OP9-DL4细胞达到汇合前进行传代。用于与胸腺细胞共培养时，OP9-DL4培养瓶在第6–7天以及第8–9天之后应保持80%–90%汇合度。因此，在传代OP9-DL4细胞时，必须提前规划好这些时间点所需的细胞数量。- 弃去培养瓶中的培养基，用1× PBS洗涤单层细胞。弃去PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育1–5分钟，或直至细胞从瓶壁脱落。轻敲培养瓶以帮助细胞脱落。
注意：（可选）可通过显微镜观察细胞解离的进程。 - 加入5 mL OP9培养基以中和胰蛋白酶活性，并在重悬过程中冲洗培养瓶内细胞附着的表面，使细胞充分悬浮。
- 将细胞悬液在室温下以300 × g离心5分钟，然后用3 mL OP9培养基重悬（用于1:3传代）。
- 取1 mL细胞悬液加入已含有5 mL新鲜OP9培养基的T25培养瓶中。剩余细胞冷冻保存或弃去。
- 如需冻存OP9-DL4细胞，按每管细胞加入1 mL冻存液（90% FBS/10% DMSO）的比例重悬细胞。
- 根据后续需求，将细胞置于1 mL冻存管中，在−80 °C或液氮中冷冻。长期保存应置于液氮中。
- 弃去培养瓶中的培养基，用1× PBS洗涤单层细胞。弃去PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育1–5分钟，或直至细胞从瓶壁脱落。轻敲培养瓶以帮助细胞脱落。
2. 启动逆转录病毒生产细胞系的培养（第1天）
- 将逆转录病毒生产细胞系置于37 °C水浴中，握住冻存管并轻轻振荡，快速解冻。立即将细胞转移至含有5 mL逆转录病毒生产细胞培养基（RPC：DMEM，10% FBS）的离心管中，以去除冷冻保护剂。
- 在室温下以300 × g 离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1 mL RPC培养基中。
- 向T25培养瓶中加入5 mL RPC培养基，并将重悬的细胞加入该培养瓶中。在37 °C、5% CO2条件下培养。
- 每2–3天传代一次，传代比例为1:5至1:8。
- 轻敲培养瓶使细胞脱落，并通过剧烈吹打使细胞重悬。
注意：此类细胞可通过剧烈吹打从培养瓶表面脱离，无需使用胰蛋白酶。或者，也可使用胰蛋白酶（0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）消化，直至细胞易于脱离，并可轻松吹打成单细胞悬液。
- 轻敲培养瓶使细胞脱落，并通过剧烈吹打使细胞重悬。
- 将细胞悬液在300 × g 条件下离心5分钟，并重悬于5 mL RPC培养基中（用于1:5传代）。
- 取1 mL细胞悬液加入已含有5 mL新鲜RPC培养基的T25培养瓶中。剩余细胞进行冻存或丢弃。逆转录病毒生产细胞的冻存方法与OP9-DL4细胞相同（步骤1.4.4.1–1.4.4.2）。
3. 在6孔板中开始逆转录病毒生产细胞的培养（第4–5天）
- 在转染前18–24小时，将逆转录病毒生产细胞以每孔2 mL的RPC培养基接种于6孔组织培养板中，细胞融合度为70%–90%，于37 °C、5% CO2条件下培养。
注意：每转导2–5 × 105至1 × 106个胸腺细胞，需转染两孔逆转录病毒生产细胞。
4. 转染逆转录病毒生产细胞以生成包含目的基因的逆转录病毒（第5–6天）
- 转染前1小时，用新鲜的RPC培养基替换原有培养基。
- 制备脂质体转染混合物（每6孔板每孔用量，可根据需要放大）：将4 µg DNA（2 µg辅助质粒（pCL-Eco）和2 µg转移质粒（pMIG））溶于250 µL低血清培养基中，轻轻混匀。
- 将10 µL转染试剂与步骤4.2中的250 µL低血清培养基混合，室温孵育5分钟。
- 孵育5分钟后，将稀释的DNA与稀释的转染试剂混合（总体积=500 µL），轻轻混匀，室温孵育20–25分钟。
- 将500 µL DNA/转染试剂混合物沿孔壁以环形方式缓慢加入含逆转录病毒生产细胞的孔中。轻轻前后摇动培养板混匀，然后将培养板置于37 °C培养箱中孵育16–24小时。
注意：亚融合状态的细胞（80%–90%融合度）最适合转染，可能产生最高的病毒滴度。由于逆转录病毒生产细胞极易从培养瓶脱落，操作时应避免剧烈移动。
5. 更换逆转录病毒生产细胞的培养基（第6–7天）
- 转染后约16 h，用2 mL新鲜RPC培养基替换旧培养基。继续在37 °C条件下培养细胞20–24 h。
- 可在荧光显微镜下评估转染效率（可选步骤）。
注意：在本实验方案中，GFP阳性细胞即为目标细胞（见图2）。此步骤取决于本方案所选用的逆转录病毒载体（载体骨架中是否含有报告基因）。
6. 胸腺细胞制备及去除 CD4+ 和 CD8+ 细胞（第6–7天）
- 从一只4至6周龄的C57BL/6小鼠中采集胸腺。有关胸腺采集的更多细节，请参阅Xing和Hogquist20.
注意：小鼠通过 CO2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死。 - 将胸腺置于含有5 mL PBS的培养皿中，制备胸腺细胞单细胞悬液。使用无菌载玻片，将胸腺置于两张载玻片的磨砂面之间，轻轻摩擦并滚动载玻片，使胸腺组织分散。用PBS冲洗载玻片以收集细胞，弃去残留的胸腺基质组织。
注意：一个胸腺的预计产量为 90 × 106–100 × 106 细胞，且在去除CD4和CD8细胞后大约有1%的细胞保留。为获得更高的细胞得率，应使用较年轻小鼠的胸腺组织，因为小鼠胸腺在出生后数周内细胞数量迅速增加，在4–6周龄时达到平台期，之后逐渐发生退行性萎缩21使用自动血细胞计数器或任何替代方法对细胞进行计数。 - 将5 mL胸腺悬液通过30 µm或40 µm细胞滤筛进行过滤。在300 × g条件下离心细胞 g 10 分钟。
- 移去上清液，根据样本量，每管加入1 mL ACK裂解缓冲液，裂解红细胞1分钟。加入5 mL细胞去除缓冲液（500 mL PBS [pH 7.2]，0.5% BSA，2 mM 0.5 M EDTA，pH 8.0）以终止ACK裂解缓冲液的作用，300 × g离心 g 孵育10分钟，然后在1–5 mL细胞去除缓冲液中重悬，进行计数。
注意：在进行耗竭前（耗竭前），将以下样品置于冰上保存：70 µL细胞悬液用于计数（根据所选的细胞计数方法可调整此体积），以及200 µL细胞悬液用于通过CD4和CD8染色并结合流式细胞术分析来测定耗竭效率。22,23. - 计数细胞，并在300 × g离心 g 10分钟。将细胞重悬于1 × 107/80 µL 细胞去除缓冲液。每 1 × 10⁶ 个细胞加入 CD4 和 CD8 微珠各 10 µL7 细胞。充分混匀，于冰箱（2–8 °C）中避光孵育15分钟。
- 使用2 mL去除缓冲液冲洗去除柱，并弃去流出液。
- 用每 1 × 10⁷ 个细胞加入 1–2 mL 去除缓冲液的方式洗涤第 6.6 步中的细胞7 细胞，并在300 × g 10 分钟后移除并弃去上清液。
- 重悬至多 1.25 × 108 将细胞重悬于500 µL去除非标记细胞缓冲液中。将细胞悬液加入柱中，收集穿流液（未标记细胞）。用1 mL缓冲液洗涤柱两次，每次均收集穿流液。
注意：仅当柱子储液槽为空时才添加新缓冲液。耗竭后（耗竭后对照），将以下样品置于冰上保存：70 µL 细胞悬液用于计数（根据所选的细胞计数方法可调整体积）和 1,000 µL 细胞悬液用于通过 CD4 和 CD8 染色并结合流式细胞术分析耗竭效率22,23. - 将分选前收集的200 µL细胞分装至四个流式管中，用于染色去除效率对照：未染色、仅CD4染色、仅CD8染色以及CD4/CD8双染色（使用未染色和单染样本设置流式细胞仪参数）。将分选后收集的1,000 µL细胞进行CD4和CD8染色，并与分选前收集的双染色样本进行比较（典型去除结果见 图3).
注意：根据抗体生产商的建议调整流式细胞术染色的体积（例如，每 1 × 10⁶ 个细胞使用 1 µL anti-CD4-FITC 和 0.5 µL anti-CD8-PE）6 50 µL缓冲液中的细胞
7. 在 OP9-DL4 细胞上培养胸腺细胞（第 6–7 天）
- 将 2–5 × 105 至 1 × 106 个去除非T细胞后的胸腺细胞接种至一个含有80%–90%融合度的OP9-DL4细胞的T25培养瓶中，培养基为添加细胞因子（10 ng/mL 重组IL-7和重组hFLT-3）的OP9培养基。在37 °C、5% CO2 条件下培养，于OP9-DL4细胞上共同培养约24小时。
注意：此培养时间对于使T细胞具备可转导性是必需的（参见图4中的典型结果）。保留一份胸腺细胞与OP9-DL4细胞的共培养T25培养瓶作为对照（未转导组）。未转导的胸腺细胞将与转导后的胸腺细胞一同进行染色（步骤9.1），作为阴性对照以评估转导效率。未转导的胸腺细胞也可用于检测目的基因表达对细胞分化的影响。含细胞因子的培养基在使用一个月后应弃去。
8. 从上清液中收集逆转录病毒并用于转导胸腺细胞（第8–9天）
- 通过倾斜6孔板并将3–5 mL注射器置于板底部，同时拉动活塞吸取上清液，收集转染细胞中含逆转录病毒的上清液。用2 mL新鲜RPC培养基替换原培养基。继续在37 °C培养20–24小时，用于步骤8.9中的第二次转导。
- 使用0.45 µm注射器滤器过滤逆转录病毒上清液，并将滤液收集至50 mL离心管中。
注意：请勿冷冻逆转录病毒上清液。转导时应使用新鲜制备的病毒液。 - 通过剧烈吹打OP9-DL4培养物，使胸腺细胞和OP9-DL4细胞从培养瓶表面脱落，从而收集胸腺细胞。将细胞悬液通过40 µm细胞筛网过滤，以去除大部分OP9-DL4细胞，并将滤液收集至50 mL离心管中。
注意：OP9细胞具有很强的贴壁性。尽管剧烈吹打可能使部分OP9-DL4细胞脱落，但此过程中OP9-DL4单层结构的破坏程度极小，且脱落的OP9-DL4细胞会因体积明显大于原代胸腺细胞而被40 µm细胞筛网滤除。若OP9-DL4细胞仍保持80%–90%汇合度，可去除胸腺细胞后将其重新接种至同一OP9-DL4培养瓶中；否则，必须准备新的OP9-DL4培养瓶。 - 将步骤8.3所得滤液中的胸腺细胞在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
- 在50 mL离心管中，用0.5–1 mL OP9培养基+细胞因子（见步骤7.1）重悬胸腺细胞。加入含病毒的RPC培养基1–2 mL（RPC培养基体积为胸腺细胞培养基体积的两倍）。加入六甲基溴化铵（储存液浓度为10 µg/µL），使终浓度为每毫升总细胞悬液含8 µg六甲基溴化铵。
- 在室温下以850 × g离心1小时进行离心转导（spinoculation）。
- 每瓶用6 mL OP9培养基+细胞因子（见步骤7.1）重悬细胞，并将细胞悬液重新加入OP9-DL4细胞单层中。
注意：也可提前准备好新的OP9-DL4培养瓶用于接收转导后的胸腺细胞。若将胸腺细胞重新接种至已使用的OP9-DL4培养瓶，需确保在胸腺细胞离心转导的1小时内向OP9-DL4细胞中添加新鲜OP9培养基，以维持细胞健康状态并保证80%–90%的汇合度。 - 在37 °C孵育过夜。
- 使用含逆转录病毒的细胞上清液的新孔，重复步骤8.2–8.7。
9. 将转导的胸腺细胞在 OP9-DL4 培养体系中维持培养 2–5 天，或根据需要冻存（第 9 天及以后）
- 通过流式细胞术检测胸腺细胞的T细胞发育标志物（如CD4、CD8、CD25和CD44）来评估胸腺细胞分化23。典型的胸腺细胞分化结果见图5。
结果
可通过免疫磁珠细胞分选（MACS）后，对未磁标记的细胞组分进行CD4和CD8染色，并在二维双变量点图上分析，从而流式细胞术评估去除非目标细胞的效率（图3）。双阴性（CD4−, CD8−）细胞的良好得率应达到95%或以上，如图3所示。导致得率偏低的两个最常见原因是：根据细胞数量对微珠用量计算错误，以及被标记细胞数量超出分选柱的承载能力。建议根据被标记细胞的数量选择适当数量的MACS分选柱。在处理胸腺细胞时，被标记细胞（DP和SP细胞）的数量几乎等于总细胞数（超过96%）。细胞计数可使用自动细胞计数仪、血球计数板（Neubauer chamber）或任何其他替代方法进行。因此，细胞计数时所用的体积可能需要根据具体仪器和所选计数方法进行相应调整。
在耗竭前和耗竭后确定存在的细胞数量非常重要。这些细胞计数数据用于计算所需的LD耗竭柱数量，并将双阴性胸腺细胞均匀分配到适当数量的OP9-DL4培养瓶中。流式细胞术的对照（未标记细胞、CD4标记细胞和CD8标记细胞）可使用预留的耗竭前样品进行，因为该样品含有较多细胞。然而，由于大部分细胞预期会保留在柱内，用于标记的耗竭后样品将需要更大的体积。因此，可能需要根据所选的标记方案进行相应调整。
当使用表达可筛选标记（如荧光基因）的载体时，可通过荧光显微镜对转染和转导效果进行粗略的经验性评估（图2）。如步骤8.3所述，将胸腺细胞从OP9-DL4单层中收集后，通过流式细胞术检测荧光基因的表达，可分析转导效率。使用携带GFP作为报告基因的空逆转录病毒载体进行转导的效率为84.2%（图4）。
在转导后4天即可观察到OP9-DL4细胞上的T细胞分化情况。通常通过流式细胞术评估在OP9-DL4细胞共培养体系中诱导的细胞分化及/或转基因表达情况，如图5所示，其中细胞被标记了CD4、CD8、CD44和CD25。已有多种细胞表面分子标记组合被证明可用于研究小鼠T细胞发育的分子与细胞机制24,25,26,27。因此，荧光抗体组合可根据具体研究问题进行调整。使用空逆转录病毒载体pMIG转导双阴性（DN）胸腺细胞的结果如图中B组所示，其单阳性（CD4+或CD8+）、双阳性（CD4+/CD8+）、双阴性（CD4−/CD8−）细胞及其亚群双阴性1–4期（DN1–DN4）的比例与未转导的胸腺细胞（A组）大致相同，表明转导过程未对T细胞发育造成影响。
图1：胸腺细胞分离、转导及共培养步骤示意图。缩写：DN = 双阴性。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：GFP转导胸腺细胞或非转导胸腺细胞与OP9-DL4细胞共培养的荧光显微镜观察结果。（A）非转导胸腺细胞和（B）在第二次转导后第3天，稳定表达GFP的小鼠胸腺细胞与OP9-DL4细胞共培养的结果。使用配备40倍物镜和适合GFP检测的480/30滤光片的Olympus-IX71荧光显微镜进行观察。比例尺 = 40 µm。缩写：GFP = green fluorescent protein；DN = double-negative。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：胸腺细胞耗竭的流式细胞术分析。代表性流式细胞术图谱，用于分析从 7–8 周龄 C57BL/6J 雌性小鼠中获取的胸腺细胞在使用磁珠和 LD 柱按照制造商说明进行 CD4+ 和 CD8+ 耗竭前（A）和耗竭后（B）CD4 与 CD8 的表达情况。左侧的点图显示基于事件大小和复杂性（分别为 FSC-A 和 SSC-A）设定的门控。中间图显示 FSC-H 与 FSC-A 的关系，用于圈选单细胞并排除双联体。右侧图中，细胞根据单细胞门控定义为 CD4 和 CD8。缩写：FSC-A = 前向散射峰值面积；SSC-A = 侧向散射峰值面积；FSC-H = 前向散射峰值高度；FITC = 异硫氰酸荧光素；PE = 藻红蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：胸腺细胞逆转录病毒转导效率的流式细胞术分析。（A）未转导的胸腺细胞在 OP9-DL4 上共培养；（B）转导后第 3 天在 OP9-DL4 上的逆转录病毒转导胸腺细胞。缩写：FSC-A = 前向散射峰面积；SSC-A = 侧向散射峰面积；FSC-H = 前向散射峰高度；FITC = 异硫氰酸荧光素；PE = 藻红蛋白；DN = 双阴性。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：转导胸腺细胞在与OP9-DL4共培养4天后的流式细胞术分析。（A）未转导细胞和（B）用pMIG逆转录病毒感染的细胞。首先根据活细胞设门，然后根据细胞大小和复杂性（分别为FSC-A和SSC-A）进行设门，接着绘制FSC-H对FSC-A的散点图以选择单细胞并排除双联体。对于未转导的细胞，采用以下设门策略：从单细胞门中，将细胞定义为单阳性（CD4+ 或 CD8+）、双阳性（CD4+/CD8+）和双阴性（CD4−/CD8−）。随后，从双阴性（CD4−/CD8−）门中，将细胞进一步定义为CD44+、CD25+、CD44+/CD25+以及CD44−/CD25−，如图A所示。对于图B所示的pMIG转导细胞，从单细胞门开始，首先根据GFP+/GFP−进行区分，然后在GFP+细胞中，依据CD4、CD8、CD44和CD25的表达情况，采用与未转导细胞相同的设门策略，确定细胞群体在主要T细胞发育阶段的分布。缩写：FSC-A = 前向散射峰值面积；SSC-A = 侧向散射峰值面积；FSC-H = 前向散射峰值高度；FITC = 异硫氰酸荧光素；GFP = 绿色荧光蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文所述方案专为胸腺来源的双阴性（CD4−/CD8−）T细胞研究而设计，包括逆转录病毒转染，随后采用OP9-DL4分化模型。然而，该转导后进行细胞分化的方案可能在更广泛的跨学科研究中具有应用价值。因此，除未成熟胸腺细胞外，其他造血干细胞（如来源于胎肝或骨髓的细胞）也可能适用于本方案。
OP9-DL4 系统已被证明是研究基因功能的有效模型，适用于细胞分化17和肿瘤发生15等多个方面。尽管逆转录病毒对造血祖细胞进行遗传修饰是一种成熟的技术，可实现稳定的基因改造，但将 OP9-DL4 系统诱导的细胞分化与逆转录病毒转导相结合，仍需谨慎操作和熟练的技术。本方案成功的关键在于确保所有步骤协调有序，因为该流程涉及三种不同类型的细胞，必须保持其健康状态，并在各个特定阶段维持理想的汇合度。因此，在执行每一步骤后，必须进行所有质量控制检查点的分析，再进入下一步，以确保每个步骤均正常进行。检查细胞耗竭效率、转染效率和转导效率对于本方案的成功实施至关重要（参见图4中转导效率的典型结果）。初级细胞良好的转导效率与高病毒滴度密切相关。通常，插入片段越大，病毒滴度越低18。出于培训目的，我们使用空载体来展示本方案可获得的结果。根据我们的经验，转导和转染效率会因插入片段的大小而异，尤其是当病毒骨架表达报告基因（如GFP）时。当研究多个基因之间的相互作用时，一种可行的策略是将每个基因分别克隆至不同的转移载体中，随后进行独立的病毒生产，最终对靶细胞实施共转导。在此情况下，可增加筛选步骤，以消除单转导细胞，仅保留共转导细胞。
值得注意的是，大多数OP9-DL1/DL4基质饲养层细胞系均已通过基因工程改造，在DL1或DL4表达构建体中包含GFP的表达7。在本方案中，我们使用了一种同样表达GFP的逆转录病毒载体；然而，该GFP信号比OP9-DL4细胞自身表达的GFP更强，因此在荧光显微镜下观察共培养体系时，不会干扰转导效果的检测。
OP9 细胞在多次传代、长期培养或过度融合的条件下会分化为脂肪细胞19，表现为出现大的空泡。因此，具有这些特征的 OP9 细胞不应在本方案中使用。过度融合的逆转录病毒生产细胞转染后将导致病毒滴度降低。实际上，细胞在亚融合阶段最易于转染。此外，对低密度的逆转录病毒生产细胞进行转染可减少转染过程中的细胞应激，并获得最高的病毒滴度。
尽管在本方案中我们未对病毒上清液进行滴度测定，但在某些情况下必须考虑病毒上清液的滴度测定，例如当逆转录病毒载体中缺乏报告基因时，将无法间接测定病毒的产生量；或当实验设计需要更准确地确定整合到靶细胞基因组中的转基因拷贝数时。然而，需要注意的是，逆转录病毒载体上清液在 −80 °C 或 4 °C 保存期间，其滴度会显著下降。因此，使用 freshly prepared 病毒上清液进行转导可获得更高的转导效率。
胸腺中含有大量双阳性（DP）胸腺细胞（超过85%）和约10%单阳性15 细胞 （CD4 或 CD8），即双阴性阶段之后的胸腺细胞。双阳性细胞无法存活 体外 对于逆转录病毒操作，而SP细胞不可转导。因此，本方案可用于生成可被逆转录病毒载体转导的DN胸腺细胞。
致谢
本工作由美国国家癌症研究所院内项目（项目编号：ZIABC009287）资助。OP9-DL4细胞系由加拿大安大略省多伦多市Sunnybrook健康科学中心Juan Carlos Zúñiga-Pflücker博士提供。作者感谢美国国家癌症研究所弗雷德里克实验室动物科学项目团队持续提供的技术协助、实验建议与支持，同时感谢Jeff Carrel、Megan Karwan和Kimberly Klarmann在流式细胞术方面的协助。我们对Howard Young提供的关键性建议与支持深表感谢。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | |
| ACK 裂解缓冲液 | Lonza | 10-548E | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 微珠 | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 微珠 | Miltenyi | 130-049-401 | |
| 离心机 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM 培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| 胎牛血清 HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD 柱 | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | G7513 | 将谷氨酰胺分装后冻存，并使用新鲜解冻的谷氨酰胺 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-α 培养基 | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I 低血清培养基 | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco 质粒 | Addgene | 12371 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG 质粒 | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| 预分离滤器 | Miltenyi | 130-041-407 | |
| 重组人 FLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| 重组 IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| 逆转录病毒包装细胞系 Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| 注射器滤器（0.45 µm） | Millipore | SLHV033RS |
参考文献
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