通过神经元编程方法获得的人多能干细胞来源的GABA能神经元移植，可能成为治疗神经发育障碍的一种潜在治疗策略。本方案描述了将人干细胞来源的GABA能神经前体细胞生成并移植至新生小鼠脑内的方法，可用于对移植物神经元进行长期研究，并评估其治疗潜力。
本文内容
摘要
摘要
抑制性中间神经元数量减少或功能障碍是导致神经发育障碍的常见因素。因此，利用中间神经元进行细胞治疗以替代或缓解异常神经环路的影响，成为一种具有吸引力的治疗途径。为此，亟需进一步了解人干细胞来源的GABA能类中间神经元细胞（hdINs）在宿主神经环路中随时间推移的成熟、整合与功能特性。在神经发育障碍研究中尤为关键的是，需明确移植细胞的这些过程是否受到正在发育和成熟宿主大脑的影响。本方案描述了一种基于转录因子转基因表达，从人胚胎干细胞快速高效生成hdINs的方法。 Ascl1 和 Dlx2这些神经前体细胞在培养7天后进行单侧移植。 体外移植到出生后2天小鼠的海马区。在皮质发育不良-局灶性癫痫综合征小鼠模型中，移植的神经元分散于同侧和对侧海马，并可在移植后存活长达9个月。该方法可用于在发育中的健康与病变脑组织中，长期研究移植中间神经元的细胞身份、整合能力、功能特性及治疗潜力。
引言
神经元网络的建立、成熟与精细化发生在围产期和出生后早期，这是大脑发育的 关键时间窗口1。大脑从出生后初期过度丰富的连接状态，逐步演化为持续至青春期的精细连接调节过程2。因此，在此期间表达的基因发生改变，以及外界因素或损伤，均会影响个体对多种神经发育障碍的易感性。认知与运动功能的损害随时间逐渐显现，而目前的药物治疗手段有限，多数仅针对症状，且存在严重副作用的风险。
γ-氨基丁酸（GABA）能抑制功能障碍已被证实是多种神经发育障碍潜在病因的重要因素3，例如脆性X综合征、Angelman综合征、癫痫、精神分裂症和自闭症。GABA是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，在维持兴奋性/抑制性（E/I）平衡、神经元放电的同步化以及神经信息计算过程中起关键作用。GABA能中间神经元是一类异质性的神经元群体，其功能复杂性随着脑区结构的复杂化4以及进化过程而增加5,6。鉴于人类大脑内源性再生能力有限，且中间神经元功能障碍与多种神经系统疾病相关，移植GABA能中间神经元可能成为一种具有前景的治疗途径。在这一方向上，与啮齿类异体神经前体细胞或其他来源相比，人源干细胞衍生的GABA能中间神经元样细胞（hdINs）似乎是更具转化潜力和可行性的细胞来源7。目前已有多种从不同细胞来源生成GABA能神经元的实验方案可供参考8,9,10,11,12,13，但关于hdINs在发育中的病理脑环境中如何随时间成熟、整合并发挥功能，仍需进一步研究。已有若干研究发现皮层模式形成、神经连接建立14以及生理E/I平衡调节15过程中活跃基因的改变。将hdINs移植至具有相应基因异常的小鼠模型中，可在出生后阶段追踪宿主与移植物之间的相互作用，此类知识对于确定潜在治疗策略至关重要。
免疫调节在异种移植中被广泛且成功地用于避免引发宿主免疫反应和排斥反应16。然而，长期使用环孢素A等免疫抑制药物会导致肾毒性，且由于需要每日腹腔注射以维持稳定的全身浓度，操作繁琐并引起动物应激17，同时还存在可能与病理过程相互作用的脱靶效应18。此外，已有研究表明，免疫系统的削弱会改变行为表型19，并伴随相应神经解剖区域的改变20。有研究显示，在出生后第一周内进行移植可使机体适应移植细胞21,22，而其他研究则报道移植后初期存活，但在出生后第一个月内发生移植物排斥23,24。
本方案描述了从人源中间神经元（hdIN）的生成到将其移植至新生小鼠体内的操作步骤，可实现移植物的长期存活，并可用于研究移植的人类中间神经元在生理和病理发育过程中神经元特异性、突触整合、功能特性及治疗潜力。
方案
所有实验程序均经马尔默/隆德动物研究伦理委员会批准（伦理许可编号：12548-19），并遵循瑞典动物福利局法规及欧盟动物实验指令 2010/63/EU 的规定进行。本研究使用出生后第 2 天（P2）的 C57BL6/J 小鼠和Contactin-associated protein-like 2 (Cntnap2) 基因敲除（KO）小鼠，包括雄性和雌性个体。同时使用了人胚胎干细胞（hESCs）。实验动物和干细胞均来自商业来源（见材料表）。
1. 生成 hdIN 前体细胞
注意：本节所有步骤均在细胞培养罩内进行。hESC 在包被的培养板上以无饲养层细胞的方式维持培养，并使用干细胞培养基以集落形式传代。
- 将hESCs进行前向编程以获得hdIN前体细胞（图1).
注意：正向编程方法基于 Gonzalez-Ramos 等人所述的实验步骤。8 和 Yang 等人9.- 在新鲜的干细胞培养基中，用含有 Tet-On 系统的慢病毒载体转导 hESCs 10 µM ROCK抑制剂（RI）（参见 材料清单）。保持在 37 °C 在培养箱中。
- 转导后16小时更换为新鲜的干细胞培养基，并以与未转导的hESCs相同的方式培养转导后的细胞。
- 待细胞汇合后，使用细胞解离溶液将hESCs以单细胞形式解离（参见 材料清单) 并以 3 x 10 的密度接种于包被的 6 孔板中5 细胞/孔，置于含干细胞培养基中 10 µM RI 在第几天 体外 （体外培养天数）−1
- 在1 DIV时，将培养基更换为含有2 g/L多西环素（DOX，参见 材料清单).
注意：DOX 用于诱导转基因表达 Ascl1 和 Dlx29，从1 DIV到7 DIV，然后继续 体内 通过将其加入饮水中25. - 在第2天体外培养（DIV）时，开始抗生素抗性筛选期，持续至第5天体外培养（DIV）。将嘌呤霉素（puro）和潮霉素（hygro）加入新鲜培养基中（参见 材料清单）。在 2 DIV、4 DIV 和 5 DIV 时更换培养基。
注意：在分化方案开始前，使用转导和非转导的人胚胎干细胞（hESCs）优化嘌呤霉素（puro）和潮霉素（hygro）的浓度，以确保仅有携带抗生素抗性表达盒的细胞能够存活。在本方案中， 0.5 µg/mL 的puro和 750 µg/mL 使用了 hygro。 - 5 DIV 时，抗生素筛选期结束。更换为添加了 2 g/L DOX 的 N2 培养基，并 4 µM 阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside，Ara-C，参见 材料清单).
图1通过过表达从人胚胎干细胞生成高密度中间神经元前体细胞 Ascl1 和 Dlx2 (A) 用于生成hdIN前体的分化方案示意图。B-E) 7天体外培养（7 DIV）时hdIN前体细胞的免疫细胞化学B)神经元标记物MAP2，(C增殖标志物 Ki67，D）常规细胞核染色，以及（E) 之前标记的合并图像。比例尺： 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
2. 移植用单细胞悬液的制备
注意：本节所有步骤均在细胞培养罩内进行。在7 DIV时，将hdIN前体细胞解离并用于移植。
- 按照以下步骤进行细胞解离。
- 移除培养基，并用不含钙和镁的 DPBS 小心冲洗细胞。
- 向 6 孔板的每个孔中加入 400 µL 细胞解离溶液（参见材料表）。
注意：确保溶液覆盖整个孔底表面。 - 在 37 °C 培养箱中孵育 2–3 分钟，直至细胞边缘开始呈现光泽，表明细胞表面蛋白发生酶解并开始从孔板表面脱离。
注意：为提高细胞存活率，当所有细胞完全解离并漂浮时，不要等待过长时间。 - 然后，向 6 孔板的每个孔中加入 600 µL 新鲜 N2 培养基以终止酶反应，并使用移液器通过机械吹打辅助细胞解离，获得单细胞悬液。
- 将细胞悬液转移至塑料离心管（15 mL）中，在室温（RT）下以 180 ×g 离心 4 分钟。
- 进行细胞重悬。
- 使用真空系统小心弃去上清液（避免扰动沉淀），并将沉淀重悬于移植培养基中，该培养基含有 10 µM RI、1 µg/mL DNase 和 2 µg/µL DOX。
- 使用计数板和手动细胞计数器对悬液中的总细胞数进行计数，并调整体积使终浓度达到 100,000 个细胞/µL。
- 将细胞悬液置于密闭离心管中，冰上保存，直至移植，最长不超过 4 小时。
注意：移植操作必须在细胞悬液制备当天完成（7 DIV）。
3. 海马内细胞移植
注意：本节所有步骤均在动物实验设施内、超净工作台外进行。细胞向脑内的早期移植在出生后第2天（P2）进行，其中P0定义为出生当天。
- 按照以下步骤准备移植实验。
- 对所有手术器械进行高压灭菌，若无法高压灭菌，则采用其他经批准的方法进行灭菌。
- 将注射用注射器安装在固定架上，不连接玻璃毛细管。用水冲洗针头。
注意：针头必须为33 G。 - 将30 G胰岛素针头尖端弯曲90°。
- 制作一个类似橡皮泥的自制平台，用于固定幼鼠，使其头部保持水平（图2A）。
- 在准备任何手术用具前，先取出带有母鼠和幼鼠的鼠笼，使其适应新环境。
- 准备一个装有湿冰的托盘和一个内衬吸水纸的空鼠笼，用于异氟烷麻醉。
- 麻醉幼鼠。
- 将一张吸水纸浸透异氟烷（参见材料表），放入空鼠笼中。小心取出一只幼鼠，放入含有浸有异氟烷吸水纸的鼠笼内。
注意：切勿使与母鼠同处的幼鼠少于3只。异氟烷麻醉时间不得超过20–30秒，否则幼鼠可能死亡。 - 通过观察运动是否停止来确认麻醉效果。
- 麻醉后立即把幼鼠放置在湿冰表面的湿润纸巾上，保持在冰上3分钟，直至前肢呈现苍白状（图2B，蓝色箭头）。此过程通常持续2–3分钟。
- 利用此时间用移液器轻轻重悬细胞，然后将细胞悬液装入注射器中。
- 将幼鼠置于立体定位仪上，耳杆朝相反方向放置（图2A，品红色箭头）。
注意：耳杆背面较平钝，由于P2阶段的幼鼠尚无外耳，应使用较平坦的一面以避免损伤动物。 - 从侧面检查头部是否平直。头部必须保持水平，必要时使用橡皮泥样平台进行调整。
注意：此阶段的幼鼠尚未睁眼，因此无需额外操作；此阶段幼鼠无毛发，无需剃毛。由于手术不涉及皮肤切开，无需缝合，因此无需特殊镇痛处理。 - 在整个手术过程中，始终将幼鼠覆盖在冰上的纸巾中。
注意：切勿使冰块直接接触幼鼠皮肤。
- 将一张吸水纸浸透异氟烷（参见材料表），放入空鼠笼中。小心取出一只幼鼠，放入含有浸有异氟烷吸水纸的鼠笼内。
- 进行注射。
- 使用浸有乙醇的软纸巾清洁皮肤表面。
- 确定人字缝位置，并将立体定位仪数字显示控制台的坐标设为零（图2C，黄色虚线）。矢状缝和人字缝因富含血管而呈红色，肉眼清晰可见。
注意：若难以辨识人字缝，可在皮肤上放置一小块冰，等待数分钟使其冷却。随后移除冰块，皮肤轻微变白有助于辨识。 - 将注射针移动至目标坐标。在本实验方案中，靶向区域为海马体，坐标如下：前后（AP）+0.85，内外侧（ML）+1.35。
- 使用90°弯曲的胰岛素针头穿透颅骨，制造微小孔洞。
- 将注射针缓慢下降，穿过颅骨后将背腹（DV）坐标归零，再继续下降至目标DV坐标。在本实验方案中，DV坐标为−1.1。
- 根据预设的时间间隔进行注射。
注意：在本实验方案中，具体时间安排如下：（i）下降至DV坐标后等待3分钟，（ii）在5分钟内注射1 µL体积，（iii）注射完成后继续等待3分钟。 - 缓慢撤出针头。
- 结束操作。
注意：手术总时长不得超过15分钟，以确保幼鼠存活并避免因低温麻醉导致的损伤。- 在将幼鼠归还母鼠前，用手将其回暖至开始活动。
- 在移植前至少2天及移植后（PT）3周内，以1 mg/mL DOX溶于0.5%蔗糖溶液作为饮用水，持续给予，以促进细胞在体内的分化 in vivo。
图 2：出生后第2天（P2）新生小鼠的立体定位移植。 （A）用于固定幼鼠体位的类似橡皮泥的支架，以及倒置的耳杆（品红色箭头）。（B）白色前爪（蓝色箭头），提示该区域血流减少，表明幼鼠正处于低温麻醉状态。（C）实验装置整体示意图，幼鼠身体已被冰块覆盖在柔软的纸巾上。（c#）幼鼠头部的特写，注射针头已插入脑内（黄色虚线表示人字缝及人字形缝合线）。该图改编自 Gonzalez Ramos 等.27。 请点击此处查看此图的放大版本。
结果
根据此处提供的方案并结合图1A所示，hdIN前体细胞在7 DIV时已不具备增殖能力，依据如下两点：（i）细胞周期标志物Ki67免疫染色呈阴性；（ii）表达微管相关蛋白2（MAP2）等神经元标志物（图1B-E）。该表征分析是在完成全部操作步骤后重新接种并培养24小时的剩余细胞上进行的。此外，先前发表的基因表达分析表明，细胞从多能状态向神经元表型的快速转变发生在约4 DIV和7 DIV之间8。总体而言，这些结果证实了存在有丝分裂后细胞，并排除了畸胎瘤形成的风险。
接下来，通过针对人源细胞质标记物STEM121的免疫组织化学染色，检测了hdIN前体细胞在出生后早期移植到野生型（WT）小鼠海马区后的存活情况。在P2时期，将hdIN前体细胞移植至免疫功能正常小鼠的右侧背侧海马区，并在移植后P14和2个月时处死动物进行分析。在两个时间点均发现，移植的细胞分布于整个背侧海马区，并扩散至胼胝体以及对侧海马区。此外，在这两个时间点，移植的hdIN细胞均表达诱导性转录因子之一Ascl1（补充图1），且无增殖活性，表现为不表达Ki67（补充图2）。
重要的是，在移植后第14天（P14）或移植后2个月（PT）均未发现针对移植细胞的免疫反应或局部炎症，这通过以下指标进行评估：使用Iba1、CD68和半乳糖凝集素-3（Gal3）鉴定未见活化的微胶质细胞（图3）；通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）确定的星形胶质细胞增生程度以及白细胞介素-1（IL-1）等炎性细胞因子的表达情况；以及未见细胞毒性T淋巴细胞（CD8）的存在（图4）。
图3：人源性神经元前体细胞（hdINs）移植至新生野生型小鼠海马后，在P14和移植后2个月均未引发宿主组织的免疫排斥反应。 脑组织中Iba1、CD68和Gal3标记物的免疫荧光染色结果，分别来自（A-D）电凝法脑卒中小鼠模型缺血核心区域附近（阳性对照，Ctrl +），（E-H）2个月时的阴性对照动物（Ctrl-），（M-P）P14时期的阴性对照动物，以及（I-L）移植后2个月和（Q-T）P14时期的细胞移植动物。白色箭头指示由于自发荧光而在所有通道中可见的部分血管实例。缩写：Ctx = 皮层；Hip = 海马；DG = 齿状回；CA1 = Cornu ammonis 1。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：人源神经元前体细胞移植至新生野生型小鼠海马区后 2 个月未引发宿主组织的免疫排斥反应。 对脑组织进行 IL1、GFAP 和 CD8 标记物的免疫荧光染色，分别显示于（A-D）电凝法脑卒中模型小鼠缺血核心区域附近的组织（阳性对照，Ctrl +）、（E-H）2 个月时的阴性对照动物（Ctrl-）以及（I-L）移植细胞后 2 个月的动物。缩写：Ctx = 皮层；Hip = 海马；DG = 齿状回。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
类似地，也将hdIN前体细胞移植到海马体中 Cntnap2 KO小鼠，自闭症谱系障碍和皮质发育不良-局灶性癫痫综合征的模型。在 Cntnap2 KO小鼠中，这些hdINs确实存活至移植后9个月，并定位于注射部位，但也如野生型小鼠中所见，分散分布于同侧甚至对侧海马组织中。图5此外，大多数移植的hdINs对中间神经元标记物呈免疫阳性反应，这与先前的研究结果一致。 体外8,26 在成年啮齿类动物中 体内25.
图 5：移植后 9 个月时 Cntnap2 基因敲除小鼠海马区移植的 hdINs 细胞。（A）针对细胞移植小鼠（左）和假手术小鼠（右）中细胞质人源标记物 STEM121 的免疫化学染色。（a1 和 a2）STEM121 阳性细胞的放大图像。（B）STEM121（品红色）以及中间神经元标记物小清蛋白（PV）和生长抑素（SST）的免疫荧光染色。白色箭头指示 STEM121 与相应中间神经元标记物双阳性细胞。（C）一例对 STEM121 和 PV 呈免疫反应阳性的移植 hdIN 细胞的正交视图。比例尺：200 µm（A 和 B），100 µm（a1 和 a2），20 µm（a1 和 a2 中小方框放大图以及 C）。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：表达Ascl1的新生野生型小鼠海马内移植hdINs，术后2个月。 对细胞移植的野生型小鼠海马CA3区（A）和DG区（B）进行Ascl1与细胞质人源标记物STEM121的免疫荧光染色。（a）STEM121阳性细胞的放大图像。白色箭头指示STEM121与Ascl1双阳性细胞。比例尺：100 µm。 请点击此处下载该文件。
补充图2：移植后2个月的终末分化hdINs在新生野生型小鼠海马中的存活情况。 针对增殖标志物Ki67和细胞质人源标志物STEM121的免疫荧光染色结果，分别显示于（A）未处理组和（B）细胞移植组的野生型小鼠。(b) 一个STEM121阳性细胞的放大图像。黄色箭头指示Ki67阳性而STEM121阴性的细胞；白色箭头指示STEM121阳性而Ki67阴性的细胞；白色星号标示侧脑室的位置。比例尺：100 µm。 请点击此处下载该文件。
讨论
本方案描述了一种稳健、快速、简单且易于广泛采用的方法，用于生成hdIN前体 体外 及其在神经发育障碍的临床前模型中作为早期干预性细胞治疗的应用。
尽管某些神经发育障碍的特征性表型出现在青春期或成年期，但其病理生理学改变在早期发育阶段就已存在。因此，在症状或临床表现出现之前的脑发育关键期进行早期干预，将极有必要以获得有益效果。未来，基因筛查和生物标志物的开发将实现预防性或症状前治疗，这将为患者带来根本性的改变。因此，在Cntnap2基因敲除小鼠模型中，于出生后早期即移植hdIN前体细胞，此时神经元网络中的致痫性改变可能正在进行28，且该动物模型中已有关于细胞水平改变的报道29。然而，必须注意小鼠与人类大脑在年龄推算以及特定发育过程时间点上的潜在差异。
聚焦于实验操作本身，本文所介绍的分化方案基于转录因子的使用，相较于其他依赖小分子的方案，该方法可实现更快速且高效的干细胞编程10,30。该策略的一个潜在缺点是需要使用慢病毒载体，这可能带来插入突变的风险。方案中的两个关键步骤是在培养基中添加抗生素和抗有丝分裂试剂，前者用于筛选表达转录因子的细胞，后者用于清除增殖性细胞，从而分别避免插入突变和畸胎瘤形成的风险。尽管本研究仅测试了人源诱导神经元前体细胞（hdIN precursors），但预计该操作流程也可适用于其他细胞来源以及编程/分化方案。然而，其他神经元亚型和/或模型仍需进一步验证。
移植所用hdIN前体细胞的培养天数（7 DIV）是基于以下两点确定的：（i）通过Ki67免疫反应性检测确认无增殖细胞存在；（ii）结合既往报道中观察到的多能性基因（如）表达水平下降的现象 POU5F1 神经元标志物的出现 MAP2 以及中间神经元标记物 GAD1 在该时间点8然而，描述该方案的原始研究是在撤除DOX后第14天进行移植的9这引发了一个问题：母鼠饮水中添加的DOX能否进入哺乳幼鼠脑内移植的细胞中 通过 乳汁，或7天的DOX诱导是否足以确立GABA能命运。尽管Yang等人已确定14天的DOX处理足以生成稳定的神经元细胞 体外9，Gonzalez-Ramos 等人8 检测到 GAD1 基因表达在7 DIV时已经出现，表明GAD67的下游激活 Ascl1 和 Dlx2 在此时间点，模式形成已经发生。因此，模式形成在7 DIV时已经开始，可能对DOX处理的依赖性较低。此外，啮齿类动物和人类的研究证据表明，DOX可存在于乳汁中。31,32，本文结果显示，移植的hdINs在移植后2周和2个月时对Ascl1呈免疫阳性反应，到移植后9个月时则表达中间神经元标记物。在移植的细胞群体中，除PV和SST阳性神经元外，还检测到少量其他中间神经元亚群的标记物，如钙视网膜蛋白（CR）和钙结合蛋白（CB）。
该实验操作的一个难点在于胚胎分化时间与仔鼠年龄的协调。通常，小鼠在设置交配笼后妊娠期约为21天，但有时也会有所变化。而在成年啮齿类动物中进行细胞移植时则不存在这一问题，因为所有步骤均可提前精确规划和安排。然而，这一困难可通过设置两到三个交配笼，彼此间隔两天，或启动两到三批分化实验，每批之间相隔两天的时间差，从而轻松克服。
尽管本研究中使用的小鼠既非免疫缺陷也非免疫抑制，移植的细胞仍存活了长达9个月 体内 在移植后第14天和2个月时，均未观察到针对异种细胞的免疫反应或局部炎症的标志物。异种移植物的免疫排斥反应由MHC/肽复合物引发，介导移植物排斥的关键细胞为T淋巴细胞和小胶质细胞。33,34因此，研究了T细胞标志物以及活化小胶质细胞的免疫反应性。在P14或2个月大的野生型小鼠中，通过检测活化小胶质细胞水平或T淋巴细胞的存在，均未发现移植物在宿主组织中引起免疫排斥的迹象。此外，根据星形胶质细胞增生程度和炎症细胞因子水平的评估，未观察到局部炎症反应。这一结果可能部分归因于新生期免疫耐受。35,36,37，通过其他细胞类型、位置和动物模型观察到35,38Englund 等人发现，移植细胞在迁移和成熟方面的结果存在区域差异，包括在邻近的白质中观察到移植细胞35.
最后，与以往移植到成年啮齿类动物的研究相比，本研究观察到移植物细胞在海马体内的分布更为广泛，而此前的研究中人源神经元（hdINs）通常保持为一个移植核心25。这种分布模式也不同于Yang等先前观察到的结果9，这可能归因于本研究中细胞在移植时所处的发育阶段。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本项目由瑞典研究理事会（资助编号：2016-02605，M.A.）、瑞典脑基金会 F02021-0369（M.A.）、克劳福德基金会（M.A.）以及欧盟“地平线2020”计划（H2020-MSCA-ITN-2016）下的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络项目 Training4CRM 编号 722779（M.K.）资助。我们非常感谢巴塞罗那大学干细胞与再生医学实验室 Josep Maria Canals 课题组的 Andrés Miguez 在 P2 新生小鼠立体定位细胞移植技术方面的指导，也感谢德克萨斯大学奥斯汀分校课题组长 Mackenzie Howard 在 P2 新生小鼠海马区细胞移植方面的建议及初步定位坐标。我们感谢 Susanne Geres 在动物护理方面的协助，Ling Cao 在组织处理方面的帮助，以及以各种方式为本研究做出贡献的学生，特别是 Diana Hatamian。最后，本文中使用的部分插图由 BioRender.com 制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30 G 针头 | B Braun | 4656300 | |
| Hamilton 注射器用 33G 针头 | Hamilton | 7762-06 | |
| 4孔板 | 赛默飞世尔科技 | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | 用于细胞传代的细胞解离溶液（hESC 和 hdIN 前体细胞） |
| 可调体积移液器 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | 赛默飞世尔科技 | 1:1000 | |
| 抗CD68（大鼠） | 伯乐（Bio-Rad） | MCA1957 | 1:200 |
| 抗CD8（兔） | Abcam | 203035 | 1:200 |
| 抗半乳糖凝集素 3（山羊） | R&D系统 | AF1197 | 1:500 |
| 抗GFAP（豚鼠） | 突触系统 | 173004 | 1:500 |
| 抗Iba1（兔） | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| 抗IL1（山羊） | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| 抗Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| 抗Ki67（兔） | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| 抗MAP2（鸡） | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| 抗Mash1（Ascl1） | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| 抗-小清蛋白（兔） | 斯万特 | PV 27 | 1:5000 |
| 抗生长抑素（大鼠） | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| 抗-STEM121（小鼠） | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| 亲和素/生物素封闭试剂盒 | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | 杰克逊实验室 | 17482 | 动物模型 |
| 生物素标记的马抗小鼠 | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| 血球计数板 | 赛默飞世尔科技 | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | 动物模型 | |
| 离心 | 适用于15 mL离心管 | ||
| 共聚焦显微镜 | 尼康 | 共聚焦A1RHD显微镜 | |
| Costar 6孔透明TC处理板 | 康宁 | 3516 | |
| Cy3 链霉亲和素 | 杰克逊免疫研究实验室 | 016-160-084 | 1:200 |
| 胞嘧啶 β-D-阿糖呋喃糖苷（AraC） | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB底物试剂盒，过氧化物酶（含镍） | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| 数字立体定位 | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 | 11320082 | 用于N2培养基 |
| DNase I 溶液 | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| 落射荧光显微镜 | Olympus | BX51 显微镜 | |
| 乙醇 | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | 慢病毒载体 |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-嘌呤霉素 | Addgene | 97329 | 慢病毒载体 |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-潮霉素 | Addgene | 97330 | 慢病毒载体 |
| H1（WA01）ESC | WiCell | WA01 | 在材料转让协议下的人类胚胎干细胞系 |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| 汉密尔顿注射器 | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | 无钙、无镁移植培养基 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| 潮霉素B | Gibco（Invitrogen） | 10687010 | |
| 培养箱 | 5% CO₂2, 37 °C | ||
| 异氟烷 Baxter | Apoteket AB | ||
| 手动细胞计数器 | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-合格基质，无LDEV | 康宁 | 354277 | 用于包被 |
| 甲醇 | 默克密理博 | 1060091000 | |
| 显微镜盖玻片 24 x 60 mm | 赛默飞世尔科技 | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| 显微镜载玻片 | VWR | 631-1551 | |
| 显微镜软件 | Olympus | CellSens | |
| 封片剂 | 默克 | 10981 | PVA-Dabco |
| 立体定位仪用小鼠适配器 | 真实世界数据 | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | 基础培养基和5倍浓缩补充剂 - 干细胞培养基 |
| N2 补充剂 | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| 移液器吸头填充器 | |||
| 培乐多 | |||
| 嘌呤霉素（二盐酸盐） | Gibco | A1113803 | |
| 圆形盖玻片，厚度1.5H（公差 ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | 用于免疫细胞化学 |
| 血清 | 赛默飞世尔科技 | 山羊、驴、马 | |
| 无菌移液器吸头 | 对于体积 0.1–1000 µL | ||
| 无菌血清移液管 | 5、10、25 mL | ||
| 无菌水 Braun | B Braun | 3626873 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S8501 | 0.5% 蔗糖溶液 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 台盼蓝溶液 | Gibco | 15250061 | |
| 管子 | Sarstedt | 15 毫升，Eppendorf 1.5 毫升 | |
| 镊子 | VWR | ||
| 超纯水 | MilliQ 纯水系统 | ||
| 二甲苯 | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632（ROCK抑制剂） | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
参考文献
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050(2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382(2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651(2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243(2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970(2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136(2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11(2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
重印与许可
标签
