从P3HR1细胞系中分离与定量EB病毒

摘要

本方案通过佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导人P3HR1细胞系的病毒裂解周期，从而分离出EB病毒颗粒。随后从病毒制备物中提取DNA，并进行实时PCR以定量病毒颗粒浓度。

摘要

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV），正式命名为人疱疹病毒4型（Human herpesvirus 4，HHV-4），是首个被分离的人类肿瘤病毒。全球约90%-95%的成年人群感染过EB病毒。随着分子生物学和免疫学的最新进展，体外（in vitro）和体内（in vivo）实验模型的应用已为深入理解EB病毒在多种疾病中的致病机制以及EB病毒相关肿瘤的发生提供了重要见解。本可视化实验论文旨在概述从P3HR1细胞系细胞中分离EB病毒颗粒并对其进行定量分析的实验流程。P3HR1细胞最初来源于人类伯基特淋巴瘤，能够产生一种P3HR1病毒，该病毒属于EB病毒2型毒株。通过佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）处理，可诱导P3HR1细胞进入EB病毒裂解周期，从而产生EB病毒颗粒。

采用本实验方案分离EBV病毒颗粒时，将P3HR1细胞在含有35 ng/mL PMA的完全RPMI-1640培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养5天。随后，将培养基在120 × g条件下离心8分钟，以沉淀细胞。收集含病毒的上清液，并在16,000 × g条件下离心90分钟，以沉淀EBV病毒颗粒。将病毒沉淀重悬于完全RPMI-1640培养基中，随后进行DNA提取和定量实时PCR检测，以评估制备物中EBV病毒颗粒的浓度。

引言

Epstein-Barr 病毒（EBV）是首个被分离出来的人类肿瘤病毒¹。EBV 正式称为人疱疹病毒 4 型（HHV-4）²，属于疱疹病毒科中的γ疱疹病毒亚科，是淋巴隐病毒属的原型种。全球约 90–95% 的成年人群均感染过该病毒³。大多数情况下，初次感染发生在出生后前 3 年内，且无明显症状；然而，若在青春期后期发生感染，则可能引发一种称为传染性单核细胞增多症的疾病⁴。EBV 能够感染静息态 B 细胞，诱导其转化为具有增殖能力的 B 淋巴母细胞，并在其中建立并维持潜伏感染状态⁵。EBV 可在任何时间被重新激活，从而导致反复感染⁶。

在过去的50年中，某些病毒与人类恶性肿瘤发生之间的关联变得越来越明显，目前估计所有人类癌症中有15%至20%与病毒感染有关⁷。疱疹病毒（包括EB病毒）是这类肿瘤病毒中研究最为深入的代表之一⁸。事实上，EB病毒可导致多种人类恶性肿瘤，例如伯基特淋巴瘤（BL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤以及免疫功能低下宿主中的淋巴增殖性疾病^9,10。EB病毒还被证实与系统性自身免疫性疾病的发生相关。这类自身免疫性疾病的一些例子包括类风湿关节炎（RA）、多发性肌炎-皮肌炎（PM-DM）、系统性红斑狼疮（SLE）、混合性结缔组织病（MCTD）和干燥综合征（SS）¹¹。此外，EB病毒还与炎症性肠病（IBD）的发生有关¹²。

这些疾病中的许多可通过细胞培养、小鼠或其他生物体进行研究或建模 感染EBV的细胞或生物体需要EBV颗粒来进行感染，无论是在 体外 或 体内 模型^13,14,15,16因此，有必要开发一种低成本的病毒颗粒分离技术。本文所述方案为从相对易得的细胞系中可靠地分离EBV颗粒提供了一种简便方法，并可通过实时PCR对颗粒进行定量，该方法成本较低，且大多数实验室均可实现。与已报道的多种从不同细胞系中分离EBV的方法相比，本方案具有明显优势。^17,18,19,20.

P3HR-1 是一种伯基特淋巴瘤（BL）细胞系，以悬浮状态生长，并潜伏感染EBV 2型毒株。该细胞系可产生EB病毒，经诱导后能够释放病毒颗粒。本文旨在展示一种从P3HR-1细胞系中分离EB病毒颗粒并定量病毒原液的方法，所得病毒原液可用于后续的 体外 和 体内 EBV 实验模型

方案

注意：EBV 应被视为潜在的生物危害材料，因此必须在生物安全二级或更高级别的防护条件下操作。操作时应穿戴实验服和手套。如果存在溅洒暴露的风险，还应考虑使用眼部防护装备。以下操作应在生物安全柜中进行。

1. 计数P3HR1细胞

1. 离心并重悬细胞
   1. 将处于80%融合度的P3HR1细胞培养物（来自100 mm培养皿或T-25培养瓶）中的细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中。P3HR-1细胞的接种密度为1 × 10⁶ 个细胞/mL。使用完全RPMI培养基（79% RPMI培养基、20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素抗生素）在37 °C、5% CO₂条件下培养，每3–4天传代一次。
   2. 以120 × g离心8分钟。离心后弃去上清液，将细胞沉淀用1 mL完全RPMI培养基重悬，并充分混匀（此溶液称为悬液A）。
2. 制备用于计数的细胞悬液
   1. 取2 µL细胞悬液A与8 µL培养基混合，制备稀释后的细胞悬液B。向悬液B中加入10 µL 0.4%台盼蓝，得到悬液C。通过轻柔吹打充分混匀。
3. 使用血细胞计数板进行细胞计数
   1. 将盖玻片盖在血细胞计数板上，加入10 µL悬液C。将血细胞计数板置于光学显微镜下，使用40倍物镜计数血细胞计数板四个象限中未被染成蓝色的细胞数量（图1）。
   2. 台盼蓝可将死细胞染成蓝色；此类细胞不计入总数，位于每个计数象限顶部、底部、右侧或左侧边界上的细胞也不计入。
   3. 使用以下公式计算每毫升的细胞浓度：
      
      注：计数的象限数为4个，血细胞计数板中方格的体积为10^-4 mL。应计数的四个象限在图1中以绿色标示。公式中的总细胞数为第1、2、3和4象限中细胞数的总和。图1中蓝色标示的细胞应计入，红色标示的细胞不应计入，因其接触了象限的顶部、右侧、底部或左侧边界。

图 1：使用血细胞计数板进行细胞计数。 使用光学显微镜计数四个象限的细胞，这些象限以绿色表示。本方案第 1.3.3 步中公式所示的总细胞数为第 1、2、3 和 4 象限中细胞数量的总和。蓝色标记的细胞应被计入，而红色标记的细胞不应计入，因为它们接触了象限的上、右、下或左边界。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 准备培养用的培养板

1. 将一定体积的细胞悬液A加入15 mL锥形管中。所需体积取决于细胞数量。调整体积，使细胞数量约为2.2 × 10⁶个，用于接种100 mm培养皿。
2. 向管中加入5 mL完全培养基，然后将管内液体转移至100 mm培养皿中。向培养皿中加入80 µL二甲基亚砜（DMSO）。
   注意：DMSO对光敏感，应储存于避光容器中，或用铝箔等不透光材料包裹。
3. 向管中加入350 µL浓度为1 mg/mL的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）。PMA的终浓度应为35 ng/mL，DMSO的终浓度应为0.08%。
   警告：PMA具有毒性、腐蚀性且为致癌物，操作时须格外小心。PMA对光敏感，应储存于避光容器中，或用铝箔等不透光材料包裹。
4. 加入4.27 mL培养基，使总体积达到10 mL。通过倾斜混匀管内液体，然后将内容物转移至100 mm培养皿中。将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下培养5天。

3. 埃博病毒颗粒的诱导与分离

1. 在培养箱中培养5天后，以120 × g 离心8分钟，使细胞沉淀。收集不含细胞但含有病毒的上清液，并弃去细胞沉淀。
2. 将上清液在4 °C条件下以16,000 × g 离心90分钟，使病毒颗粒沉淀。弃去上清液，并将病毒沉淀重悬于5 mL培养基中。
   注意：可使用磷酸盐缓冲液（PBS）代替培养基来重悬病毒沉淀。
3. 将获得的病毒悬液分装至20个管中，每管含250 µL病毒悬液。于-80 °C保存。

4. 从病毒颗粒中提取DNA

警告：处理苯酚时需格外小心，因为苯酚具有毒性和腐蚀性，可导致严重灼伤。苯酚对光敏感，接触光或空气后会发生氧化。应将其储存在避光容器中，或用铝箔等不透光材料包裹苯酚管。

1. 蛋白质与 DNA 的分离
   1. 向一个 250 µL 离心管中加入 500 µL TrisCl 饱和酚。加入 100 µL 水（以增加水相体积），充分涡旋震荡形成粉红色乳状液。在 9650 × g 条件下离心 15 分钟。
2. DNA 沉淀
   1. 收集上清液（透明的水相），转移至一个新的 1.5 mL 微量离心管中。
   2. 加入相当于上清液体积 1/10 的冷乙酸钠溶液（3 M，pH 5.2），通过移液器反复吹打混匀。加入 1 µL 20 mg/mL 甘油三酯，再次通过移液器吹打混匀。
      注意：此步骤为可选步骤，但加入甘油三酯可增强 DNA 沉淀，并有助于更清晰地观察 DNA 沉淀颗粒。
   3. 加入相当于上清液体积三倍的冷 100% 乙醇。于 -80 °C 下保存过夜。
      注意：此处可暂停实验流程，待后续继续操作。样品可在 -80 °C 下保存 1 小时，或过夜保存。过夜保存有助于提高 DNA 沉淀效率，因此推荐采用。
3. 病毒 DNA 的提取
   1. 次日，在 4 °C 条件下以 9650 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，获得 DNA 沉淀。
   2. 用 1 mL 冷 70% 乙醇洗涤沉淀三次，每次在 9650 × g 条件下离心 15 分钟，弃去上清液。
   3. 将沉淀在空气中干燥约 10 分钟。根据 DNA 沉淀的大小，将其重悬于 10–50 µL 无核酸酶的蒸馏水中。
   4. 将样品储存于 -20 °C 以备后续处理，或在 4 °C 下过夜保存以确保 DNA 充分溶解，随后转移至 -20 °C 保存。也可直接进入第 5 步操作。

5. 检测 DNA 浓度和纯度

1. 使用精细擦拭纸清洁显微分光光度计的样品台后，加入 1 µL DNA 样品。
2. 记录样品中 DNA 的浓度。检测在 和 处的吸光度比值。DNA 在 260 nm 处有吸收峰，蛋白质在 280 nm 处有吸收峰，而苯酚等有机物质在 230 nm 处有吸收峰。比值在 1.8–2.0 之间时，可满足实时荧光定量 PCR 的要求。

6. 实时聚合酶链式反应定量分析

1. PCR反应体系的配制
   1. 在0.2 mL PCR管中加入5 µL SYBR Green实时荧光定量PCR混合液。向每管中加入1 µL浓度为7.5 pmol/µL的正向引物和1 µL浓度为7.5 pmol/µL的反向引物。正向引物序列：5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'；反向引物序列：5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'。用于检测EBV基因组拷贝数的扩增基因为Epstein-Barr病毒小RNA 2（EBER-2）基因。
   2. 向其中一管中加入2 µL无核酸酶水和1 µL步骤4中提取的病毒DNA。反应体系总体积为10 µL。
      注意：根据样品中DNA的浓度，可能需要进行稀释。稀释倍数F应予以记录，并在步骤6.3的计算公式中纳入考虑。
   3. 准备其他作为标准品的PCR管，其中含有已知EBV基因组拷贝数的标准品（1000、2000、5000、10,000和54,000拷贝）。
2. 运行PCR程序：首先在95 °C激活5分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15秒和58 °C退火30秒。
3. 通过将各标准品的Ct值对其EBV基因组拷贝数的对数值作图，绘制qPCR标准曲线。根据标准曲线的拟合方程，推算出含有诱导病毒DNA的PCR管中的EBV基因组拷贝数。然后，使用以下公式计算诱导病毒制备物的浓度：
   
   其中X为根据标准曲线得出的EBV基因组拷贝数，F为PCR反应中所用DNA样本的稀释倍数。

7. 检测病毒颗粒的生物学活性/感染性

1. 将处于80%融合度的100 mm培养皿中的BC-3细胞转移至15 mL圆锥形离心管中。P3HR-1细胞的接种密度为1 × 10⁶ 个细胞/mL。使用完全RPMI培养基（79% RPMI培养基、20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素抗生素）在37 °C、5% CO₂条件下培养，每3-4天传代一次。
2. 按照步骤1的方法对BC-3细胞进行计数。向96孔板中每孔加入10⁵个BC-3细胞。使用三、六、九或十二个孔，以确保结果的显著性并减少误差。
3. 根据步骤6.3中确定的病毒制备物浓度，向每孔加入相应体积的病毒原液。感染复数（MOI）可变，通过本方案的优化可确定最佳MOI（建议MOI范围为2-50）。确保每孔中混合液的总体积为250 µL。
   1. 为确定所需体积，需已知病毒原液的浓度，并选择一个MOI值。例如，若MOI为2，则加入的病毒颗粒数量应为细胞数量的两倍。使用公式： 计算所需病毒原液的体积 V，其中n为所需的病毒颗粒数，C为已知的病毒原液浓度
4. 将96孔板内容物孵育5天。5天后，将每孔内容物转移至1.5 mL离心管中。
5. 以120 × g离心8分钟，使细胞与含病毒的培养基分离。对细胞沉淀及上清液均进行DNA提取，随后进行实时PCR定量，以检测各组分中病毒基因组的存在情况，从而评估病毒颗粒的感染能力。

结果

本实验的目的是分离出具有已知病毒滴度的EBV颗粒悬液，可用于建立EBV感染模型。因此，使用各种试剂的最佳浓度以获得最高的EBV产量至关重要。

为确定可产生最多EBV颗粒的PMA和DMSO浓度，进行了优化实验（图2）。0.8%的DMSO浓度和35 ng/µL的PMA浓度为最佳条件，可获得较高的EBV浓度。通过优化方案获得的病毒颗粒浓度为917,471 个病毒颗粒/µL。

图2：P3HR-1细胞经...

讨论

产生EBV病毒颗粒对于理解该病毒的生物学特性及其相关疾病至关重要。本文描述了从P3HR-1细胞系中产生这些病毒颗粒的方法。P3HR-1并非唯一可产生EBV的细胞系；事实上，EBV颗粒也已从B95-8细胞^21,22以及Raji细胞系^18,19中分离获得。在这些细胞中，EBV的裂解周期可通过正丁酸盐（n-butyrate）诱导激活。此外，也可使用佛波酯类化合物，如12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA），亦称佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）。总体而言，本文详述的实验方案同样适用于上述细胞系替代P3HR-1细胞。然而，B95-8细胞系源自棉顶狨（Saguinus oedipus），该物种目前被列为极危灵长类动物²³，因此供应商极少出售该细胞系，且对其销售和运输存在严格限制。根据《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）规...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 薄壁 PCR 管	Thermo Scientific	AB0620	使用前应高压灭菌
0.2–10 µL 微量滤芯吸头	Corning	4807	使用前应高压灭菌
0.5–10 µL 移液器	BrandTech	704770
10 mL 一次性刻度移液管	Corning	4488
1000 µL 滤芯吸头	QSP	TF-112-1000-Q
100–1000 µL 移液器	Eppendorf	3123000063
100 × 20 mm 培养皿	Sarstedt	83.1802
10–100 µL 移液器	BrandTech	704774
15 mL 圆锥形离心管	Corning	430791
200 µL 滤芯吸头	QSP	TF-108-200-Q
20–200 µL 移液器	Eppendorf	3123000055
50 mL 圆锥形离心管	Corning	430828
CFX96 实时荧光定量 C-1000 热循环仪	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
无 DNase/RNase 水	Zymo Research	W1001-1
EBER 引物	Macrogen	N/A	定制引物
EBV DNA 对照品（标准品）	Vircell	MBC065
乙醇（实验室试剂级）	Fischer Chemical	E/0600DF/17
胎牛血清	Sigma	F9665
Fresco 21 微型离心机	Thermo Scientific	10651805
糖原溶液	Qiagen	158930
血细胞计数板	BOECO	BOE 01
倒置光学显微镜	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
微量离心管	Costar (Corning)	3621	使用前应高压灭菌
P3HR-1 细胞系	ATCC	HTB-62
青霉素-链霉素溶液	Biowest	L0022
苯酚	VWR	20599.297
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139
移液管助吸器	Thermo Scientific	9501
精密擦拭纸	Kimtech	7552
RPMI-1640 培养基	Sigma	R7388
SL 16R 离心机	Thermo Scientific	75004030
乙酸钠	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
分光光度计	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
台盼蓝溶液	Sigma	T8154
水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific	4121