从P3HR1细胞系分离和定量EB病毒

摘要

该协议允许在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导病毒裂解循环时从人P3HR1细胞系中分离Epstein-Barr病毒颗粒。随后从病毒制剂中提取DNA，并进行实时PCR以量化病毒颗粒浓度。

摘要

爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV），正式名称为 人类疱疹病毒4 （HHV-4），是第一个分离的人类肿瘤病毒。世界上近90-95%的成年人口感染了EB病毒。随着分子生物学和免疫学的最新进展， 体外 和 体内 实验模型的应用为EBV在许多疾病的发病机制以及EBV相关的肿瘤发生提供了深刻而有意义的见解。这篇可视化实验论文的目的是概述从P3HR1细胞系细胞中分离EBV病毒颗粒，然后对病毒制剂进行定量。P3HR1细胞最初是从人伯基特淋巴瘤中分离出来的，可以产生P3HR1病毒，这是一种2型EBV毒株。通过用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）处理，可以在这些P3HR1细胞中诱导EBV裂解循环，产生EBV病毒颗粒。

使用该协议分离EBV颗粒，将P3HR1细胞在含有35ng / mL PMA的完整RPMI-1640培养基中在37°C和5%CO₂ 下培养5天。随后，将培养基以120× g 的速度离心8分钟以沉淀细胞。然后收集含病毒的上清液并以16，000× g 的速度旋转90分钟以沉淀EBV颗粒。然后将病毒沉淀重悬于完整的RPMI-1640培养基中。随后进行DNA提取和定量实时PCR，以评估制剂中EBV颗粒的浓度。

引言

EB病毒（EBV）是第一个被分离出来的人类肿瘤病毒¹。EB病毒，正式名称为 人类疱疹病毒4 （HHV-4）²，是疱疹病毒家族的γ疱疹病毒亚科的一部分，是 淋巴密码病毒 属的原型。世界上近90-95%的成年人口感染了该病毒³。在大多数情况下，初始感染发生在生命的前 3 年内并且是无症状的，但是，如果感染发生在青春期后期，则可能会引起称为传染性单核细胞增多症的疾病⁴。EBV能够感染静息的B细胞，诱导它们成为增殖的B淋巴母细胞，其中病毒建立并维持潜伏感染状态⁵。EB病毒可以随时重新激活，从而导致复发性感染⁶。

在过去的50年中，某些病毒与人类恶性肿瘤发展之间的关联变得越来越明显，今天估计所有人类癌症中有15%至20%与病毒感染有关⁷。疱疹病毒，包括EB病毒，是这些类型^{肿瘤病毒中}研究得最好的例子8。事实上，EBV可引起多种类型的人类恶性肿瘤，如伯基特淋巴瘤（BL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤和免疫功能低^{下的宿主的}

方案

注意:EB病毒应被视为潜在的生物危害性材料，因此应在生物安全2级或更高遏制下处理。应穿实验室外套和手套。如果有可能接触到飞溅物，还应考虑保护眼睛。以下程序应在生物安全柜中进行。

1. 计数 P3HR1 细胞

1. 离心和重悬细胞
   1. 将细胞悬液从正在进行的P3HR1细胞培养物的100 mm培养板（或T-25烧瓶）中以80%汇合度转移到15 mL锥形管中。P3HR-1 细胞的接种密度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。在37°C和5%CO₂下维持在完全RPMI培养基（79%RPMI培养基，20%胎牛血清，1%Pen-Strep抗生素）中，每3-4天传代一次。
   2. 以120 x g 离心8分钟。离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1mL完全RPMI培养基中，并充分混合（该溶液将称为悬浮液A）。
2. 准备细胞悬液以进行计数
   1. 通过将 2 μL 细胞悬液 A 与 8 μL 培养基混合来制备稀释的细胞悬液 B。向悬浮液 B 中加入 10 μL 0.4% 台盼蓝以获得悬浮液 C.通过轻轻移液充分混合制剂。
3. 使用血细胞计数器计数细胞
   1. 将玻璃盖玻片放在血细胞计数器上并加载10μL悬浮液C.将血细胞计数器置于光学显微镜下，并使用40倍显微镜物镜计数血细....

结果

该程序的目标是在具有已知病毒滴度的悬浮液中分离EBV颗粒，随后可用于模拟EBV感染。因此，使用不同试剂的最佳浓度以获得最高的EBV产量至关重要。

进行优化试验以确定产生最多EBV颗粒的PMA和DMSO浓度（图2）。DMSO浓度为0.8%，PMA浓度为35 ng/μL是最佳的，并导致高EBV浓度。从优化方案获得的病毒颗粒浓度为917，471个病毒颗粒/μL。

图 2:用佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 （PMA） 诱导 P3HR-1 细胞时获得的 EBV DNA 拷贝/mL。 P3HR-1细胞（10⁵

讨论

EBV颗粒的产生对于了解该病毒的生物学及其相关疾病是必要的。在这里，我们描述了从P3HR-1细胞系中产生这些颗粒的过程。该细胞系不是唯一的EBV生产者系;事实上，EBV颗粒也已从B95-8细胞²¹，²²以及Raji细胞系^18，19中分离出来。EBV裂解循环已在这些细胞中用正丁酸盐诱导。或者，可以使用佛波醇酯，例如12-O-十四烷酰佛波-13-乙酸酯（TPA），也称为佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）。总体而言，此处详述的方案可用于使用这些细胞而不是P3HR-1系。然而，B95-8系来源于棉顶狨（Saguinus oedipus），目前被归类为极度濒危的灵长类物种²³;因此，这条线很少被供应商出售，对其销售和运输有限制。《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）还要求联合王国境外的所有订单获得许可证。虽然Raji细胞系是市售的，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 薄壁 PCR 管	Thermo Scientific	AB0620	使用前应进行高压灭菌
0.2-10 &微量;L 微量滤芯吸头	Corning	4807	应在使用前进行
0.5-10 µL 移液器	BrandTech	704770
10 mL 一次性血清移液器	Corning	4488
1000 µL 带滤芯的移液器吸头	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 & micro;L 移液器	Eppendorf	3123000063
100x20 mm 切板	Sarstedt	83.1802
10-100 µL 移液器	BrandTech	704774
15 mL 锥形管	Corning	430791
200 &微量;L 带滤芯的移液器吸头	QSP	TF-108-200-Q
20-200 & micro;L 移液器	Eppendorf	3123000055
50 mL 锥形管	康宁	430828
CFX96 实时 C-1000 热循环仪	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
不含 DNase/RNase 的水	Zymo Research	W1001-1
EBER 引物	Macrogen	N/A	定制引物
EBV DNA 对照品（标准品）	Vircell	MBC065
乙醇（实验室试剂级）	Fischer Chemical	E/0600DF/17
胎牛血清	Sigma	F9665
Fresco 21 微量离心机	Thermo Scientific	10651805
糖原溶液	Qiagen	158930
血球计数器	BOECO	BOE 01
倒置光学显微镜	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green 超混合液	Bio-Rad	172-5121
微量离心管	Costar （Corning）	3621	使用前应进行高压灭菌
P3HR-1 细胞系	ATCC	HTB-62
青霉素-链霉素解决方案	Biowest	L0022
苯酚	VWR	20599.297
佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA）	Sigma-Aldrich	P8139
移液器灌装机	Thermo Scientific	9501
精密湿巾	Kimtech	7552
RPMI-1640 培养基	Sigma	R7388
SL 16R 离心	Thermo Scientific	75004030
醋酸钠	Riedel-de Haën （Honeywell）	25022
分光光度计	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
台盼蓝溶液	Sigma	T8154
水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific	4121