从P3HR1细胞系分离和定量EB病毒

摘要

该协议允许在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导病毒裂解循环时从人P3HR1细胞系中分离Epstein-Barr病毒颗粒。随后从病毒制剂中提取DNA，并进行实时PCR以量化病毒颗粒浓度。

摘要

爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV），正式名称为 人类疱疹病毒4 （HHV-4），是第一个分离的人类肿瘤病毒。世界上近90-95%的成年人口感染了EB病毒。随着分子生物学和免疫学的最新进展， 体外 和 体内 实验模型的应用为EBV在许多疾病的发病机制以及EBV相关的肿瘤发生提供了深刻而有意义的见解。这篇可视化实验论文的目的是概述从P3HR1细胞系细胞中分离EBV病毒颗粒，然后对病毒制剂进行定量。P3HR1细胞最初是从人伯基特淋巴瘤中分离出来的，可以产生P3HR1病毒，这是一种2型EBV毒株。通过用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）处理，可以在这些P3HR1细胞中诱导EBV裂解循环，产生EBV病毒颗粒。

使用该协议分离EBV颗粒，将P3HR1细胞在含有35ng / mL PMA的完整RPMI-1640培养基中在37°C和5%CO₂ 下培养5天。随后，将培养基以120× g 的速度离心8分钟以沉淀细胞。然后收集含病毒的上清液并以16，000× g 的速度旋转90分钟以沉淀EBV颗粒。然后将病毒沉淀重悬于完整的RPMI-1640培养基中。随后进行DNA提取和定量实时PCR，以评估制剂中EBV颗粒的浓度。

引言

EB病毒（EBV）是第一个被分离出来的人类肿瘤病毒¹。EB病毒，正式名称为 人类疱疹病毒4 （HHV-4）²，是疱疹病毒家族的γ疱疹病毒亚科的一部分，是 淋巴密码病毒 属的原型。世界上近90-95%的成年人口感染了该病毒³。在大多数情况下，初始感染发生在生命的前 3 年内并且是无症状的，但是，如果感染发生在青春期后期，则可能会引起称为传染性单核细胞增多症的疾病⁴。EBV能够感染静息的B细胞，诱导它们成为增殖的B淋巴母细胞，其中病毒建立并维持潜伏感染状态⁵。EB病毒可以随时重新激活，从而导致复发性感染⁶。

在过去的50年中，某些病毒与人类恶性肿瘤发展之间的关联变得越来越明显，今天估计所有人类癌症中有15%至20%与病毒感染有关⁷。疱疹病毒，包括EB病毒，是这些类型^{肿瘤病毒中}研究得最好的例子8。事实上，EBV可引起多种类型的人类恶性肿瘤，如伯基特淋巴瘤（BL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤和免疫功能低^{下的宿主的}淋巴组织增生性疾病9^，10。EB病毒也被证明与系统性自身免疫性疾病的发展有关。这些自身免疫性疾病的一些例子是类风湿性关节炎 （RA）、多发性肌炎-皮肌炎 （PM-DM）、系统性红斑狼疮 （SLE）、混合性结缔组织病 （MCTD） 和干燥综合征 （SS）¹¹。EB病毒也与炎症性肠病（IBD）的发展有关¹²。

许多这些疾病可以使用细胞培养物，小鼠或其他感染EBV的生物体进行研究或建模。这就是为什么需要EBV颗粒来感染细胞或生物体，无论是体外还是体内模型¹³，^14，15，^16，因此需要开发一种能够以低成本分离病毒颗粒的技术。此处描述的方案提供了一种简单的方法，可以从相对容易获得的细胞系中可靠地分离EBV颗粒，并使用实时荧光定量PCR对颗粒进行定量，这是经济高效的，并且大多数实验室都可以轻松获得。这是与已经描述的从不同细胞系中分离EBV的其他几种方法相比¹⁷，^18，19，20。

P3HR-1是一种在悬浮液中生长并潜伏感染EBV 2型菌株的BL细胞系。该细胞系是EBV生产者，可以诱导产生病毒颗粒。本手稿的目的是展示一种允许从P3HR-1细胞系中分离EBV颗粒的方法，然后对病毒储液进行定量，以后可用于 体外 和 体内 EBV实验模型。

方案

注意:EB病毒应被视为潜在的生物危害性材料，因此应在生物安全2级或更高遏制下处理。应穿实验室外套和手套。如果有可能接触到飞溅物，还应考虑保护眼睛。以下程序应在生物安全柜中进行。

1. 计数 P3HR1 细胞

1. 离心和重悬细胞
   1. 将细胞悬液从正在进行的P3HR1细胞培养物的100 mm培养板（或T-25烧瓶）中以80%汇合度转移到15 mL锥形管中。P3HR-1 细胞的接种密度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。在37°C和5%CO₂下维持在完全RPMI培养基（79%RPMI培养基，20%胎牛血清，1%Pen-Strep抗生素）中，每3-4天传代一次。
   2. 以120 x g 离心8分钟。离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1mL完全RPMI培养基中，并充分混合（该溶液将称为悬浮液A）。
2. 准备细胞悬液以进行计数
   1. 通过将 2 μL 细胞悬液 A 与 8 μL 培养基混合来制备稀释的细胞悬液 B。向悬浮液 B 中加入 10 μL 0.4% 台盼蓝以获得悬浮液 C.通过轻轻移液充分混合制剂。
3. 使用血细胞计数器计数细胞
   1. 将玻璃盖玻片放在血细胞计数器上并加载10μL悬浮液C.将血细胞计数器置于光学显微镜下，并使用40倍显微镜物镜计数血细胞计数器室四个象限中每个象限中未染成蓝色的细胞数量（图1）。
   2. 台盼蓝将死细胞染成蓝色;不要计数这些细胞，也不要计数接触每个血细胞计数器象限的任何顶部、底部、右侧或左侧边界的细胞。
   3. 使用以下公式计算每毫升细胞浓度:
      
      注意:计数的象限数为四个，^10-4 mL是血细胞计数器上方块的体积。应该计数的四个象限在 图1中以绿色表示。公式中 计数的单元格总数 是象限 1、2、3 和 4 中单元格数的总和。 应计数图 1 中以蓝色表示的单元格，而不应计数红色单元格，因为它们接触象限的上、右、下或左边框。

图1:使用血细胞计数器室进行细胞计数。 使用光学显微镜计数四个象限;这些象限以绿色表示。此处描述的协议的步骤1.3.3中指示的公式中 计数的细胞总数 是象限1，2，3和4中细胞数的总和。应计算蓝色表示的单元格，而红色单元格不应计数，因为它们触及象限的顶部、右侧、底部或左侧边框 请单击此处查看此图的大图。

2. 准备培养板

1. 将一定体积的细胞悬液 A 放入 15 mL 锥形管中。所需的体积取决于细胞计数。调整体积，使100 mm培养板的细胞数量约为2.2 x 10⁶ 个细胞。
2. 向管中加入 5 mL 完全培养基，然后将管中的内容物转移到 100 mm 培养板中。向培养板中加入 80 μL 二甲基亚砜 （DMSO）。
   注意:DMSO对光敏感，因此应存放在耐光容器中或用铝箔等不透明材料覆盖。
3. 向试管中加入 350 μL 1 mg/mL 佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 （PMA）。PMA的最终浓度应为35 ng/mL，DMSO的最终浓度应为0.08%。
   注意:PMA有毒，腐蚀性和致癌性，因此应格外小心地处理。PMA对光敏感，因此应存放在耐光容器中或用铝箔等不透明材料覆盖。
4. 加入 4.27 mL 培养基，使总体积为 10 mL。通过倾斜混合管的内容物，然后将内容物转移到100mm培养板中。将板在细胞培养箱中在37°C，5%CO₂下放置5天。

3. EB病毒颗粒的诱导和分离

1. 在培养箱中5天后，将板的内容物以120× g 离心8分钟以沉淀细胞。收集无细胞，含病毒的上清液并丢弃细胞沉淀。
2. 将上清液在4°C下以16，000× g 离心90分钟以沉淀病毒颗粒。弃去上清液并将病毒沉淀重悬于5mL培养基中。
   注意:磷酸盐缓冲盐水（PBS）可用于重悬病毒沉淀而不是培养基。
3. 将获得的病毒悬液等分到 20 个试管中，每个管含有 250 μL 病毒悬液。将悬浮液储存在-80°C。

4. 从病毒颗粒中提取DNA

注意:处理苯酚时应格外小心，因为它有毒且具有腐蚀性，并且能够引起严重烧伤。苯酚对光敏感，与光或空气接触时会氧化。将其存放在耐光容器中，或者用铝箔等不透明材料覆盖苯酚管。

1. 从DNA中分离蛋白质
   1. 将 500 μL TrisCl 饱和苯酚加入 250 μL 试管之一中。加入 100 μL 水（以增加水相的体积）并充分涡旋以获得粉红色乳液。以9650 x g 离心15分钟。
2. 脱氧核糖核酸沉淀
   1. 收集上清液（透明水相）并将其转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
   2. 加入相当于上清液体积的1/10的冷醋酸钠（3M，pH 5.2），并通过上下移液混合。加入 1 μL 20 mg/mL 糖原，通过移液混合。
      注意:此步骤是可选的，但添加糖原可增强DNA沉淀，并使DNA沉淀更容易可视化。
   3. 加入三倍于上清液体积的冷100%乙醇。在-80°C下储存过夜。
      注意:可以在此处停止该过程，以便稍后恢复。样品可以在-80°C下储存1小时，或者过夜。过夜储存可增强DNA沉淀，因此建议使用。
3. 分离病毒基因
   1. 第二天，在4°C下以9650× g 离心15分钟，弃去上清液以获得DNA沉淀。
   2. 用1mL冷的70%乙醇洗涤沉淀三次，以9650× g 离心15分钟，弃去上清液。
   3. 将颗粒风干约10分钟。将沉淀重悬于10-50μL无核酸酶蒸馏水中（取决于DNA沉淀的大小）。
   4. 将样品储存在-20°C下进行后续处理，或在4°C下过夜，以确保最大的DNA溶解度，然后在-20°C下储存。 或者，直接继续执行步骤 5。

5. 检查DNA浓度和纯度

1. 用精密的任务擦拭器清洁显微分光光度计的基座后，加载 1 μL DNA 制备物。
2. 注意样品中DNA的浓度。检查两者的吸光度比和。DNA将在260 nm吸收，蛋白质将在280 nm吸收，而苯酚等有机物质将在230 nm吸收。1.8-2的比率被认为足以进行实时荧光定量PCR。

6. 通过实时聚合酶链反应进行定量

1. PCR反应混合物的制备
   1. 将 5 μL 的 SYBR 绿色实时荧光定量 PCR 混合物放入 0.2 mL PCR 管中。向每个试管中加入 1 μL 7.5 pmol/μL 正向引物和 1 μL 7.5 pmol/μL 反向引物。正向引物序列:5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3';反向引物序列:5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'。扩增以确定EBV基因组拷贝数的基因是 EB病毒小RNA 2（EBER-2） 基因。
   2. 向其中一个试管中加入步骤 4 中的 2 μL 无核酸酶水和 1 μL 病毒 DNA。反应混合物的总体积为10μL。
      注意:根据样品中DNA的浓度，可能需要稀释步骤。应注意稀释因子F，并将在步骤6.3中整合到公式中。
   3. 准备其他将用作具有已知EBV基因组拷贝数（1000，2000，5000，10，000和54，000拷贝）的标准品的试管。
2. 运行PCR混合物，首先在95°C下活化5分钟，然后在95°C和58°C（退火）下分别运行40个循环15秒和30秒。
3. 通过将标准的Ct值与每个标准管的EBV基因组拷贝数的对数绘制来生成qPCR标准曲线。采用标准曲线图方程，得出含有诱导病毒DNA的PCR管中EBV基因组拷贝数。然后，使用以下公式计算诱导的病毒制剂的浓度:
   
   其中X是从标准曲线得出的EBV基因组拷贝数，F是用于建立每个PCR反应使用的DNA的稀释因子。

7. 检查病毒颗粒的生物活性/感染性

1. 将BC-3细胞从80%汇合度的100 mm培养板转移到15 mL锥形管中。P3HR-1 细胞的接种密度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。在37°C和5%CO₂下维持在完全RPMI培养基（79%RPMI培养基，20%胎牛血清，1%Pen-Strep抗生素）中，每3-4天传代一次。
2. 以与通过步骤1计数P3HR-1细胞相同的方式计数BC-3细胞。向96孔板中，向每个孔中加入10个^{5 BC-3} 细胞。使用 3 个、6 个、9 个或 12 个孔来确保结果的重要性并最大限度地减少误差。
3. 根据步骤6.3中确定的病毒制剂的浓度，向每个孔中加入一定体积的病毒储备液。MOI 可能会有所不同，并且该协议的优化将揭示感染的最佳 MOI（建议 MOI 范围为 2-50）。确保每个孔中存在的混合物的总体积为 250 μL。
   1. 要确定所需的体积，应知道病毒储液的浓度，并应选择MOI。例如，如果MOI为2，则添加的病毒颗粒数量应该是细胞数量的两倍。使用以下公式计算所需病毒储液的体积 V : ，n 是所需的病毒颗粒数，C 是已知浓度的病毒储液
4. 将96孔板的内容物孵育5天。5天后，将每个孔的内容物转移到1.5 mL管中。
5. 将试管以120× g 离心8分钟，以将细胞与含病毒的培养基分离。对细胞沉淀和上清液进行DNA提取，然后进行实时PCR定量，以检查每个部分中是否存在病毒基因组，从而评估病毒颗粒的感染性。

结果

该程序的目标是在具有已知病毒滴度的悬浮液中分离EBV颗粒，随后可用于模拟EBV感染。因此，使用不同试剂的最佳浓度以获得最高的EBV产量至关重要。

进行优化试验以确定产生最多EBV颗粒的PMA和DMSO浓度（图2）。DMSO浓度为0.8%，PMA浓度为35 ng/μL是最佳的，并导致高EBV浓度。从优化方案获得的病毒颗粒浓度为917，471个病毒颗粒/μL。

图 2:用佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 （PMA） 诱导 P3HR-1 细胞时获得的 EBV DNA 拷贝/mL。 P3HR-1细胞（10⁵

讨论

EBV颗粒的产生对于了解该病毒的生物学及其相关疾病是必要的。在这里，我们描述了从P3HR-1细胞系中产生这些颗粒的过程。该细胞系不是唯一的EBV生产者系;事实上，EBV颗粒也已从B95-8细胞²¹，²²以及Raji细胞系^18，19中分离出来。EBV裂解循环已在这些细胞中用正丁酸盐诱导。或者，可以使用佛波醇酯，例如12-O-十四烷酰佛波-13-乙酸酯（TPA），也称为佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）。总体而言，此处详述的方案可用于使用这些细胞而不是P3HR-1系。然而，B95-8系来源于棉顶狨（Saguinus oedipus），目前被归类为极度濒危的灵长类物种²³;因此，这条线很少被供应商出售，对其销售和运输有限制。《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）还要求联合王国境外的所有订单获得许可证。虽然Raji细胞系是市售的，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 薄壁 PCR 管	Thermo Scientific	AB0620	使用前应进行高压灭菌
0.2-10 &微量;L 微量滤芯吸头	Corning	4807	应在使用前进行
0.5-10 µL 移液器	BrandTech	704770
10 mL 一次性血清移液器	Corning	4488
1000 µL 带滤芯的移液器吸头	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 & micro;L 移液器	Eppendorf	3123000063
100x20 mm 切板	Sarstedt	83.1802
10-100 µL 移液器	BrandTech	704774
15 mL 锥形管	Corning	430791
200 &微量;L 带滤芯的移液器吸头	QSP	TF-108-200-Q
20-200 & micro;L 移液器	Eppendorf	3123000055
50 mL 锥形管	康宁	430828
CFX96 实时 C-1000 热循环仪	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
不含 DNase/RNase 的水	Zymo Research	W1001-1
EBER 引物	Macrogen	N/A	定制引物
EBV DNA 对照品（标准品）	Vircell	MBC065
乙醇（实验室试剂级）	Fischer Chemical	E/0600DF/17
胎牛血清	Sigma	F9665
Fresco 21 微量离心机	Thermo Scientific	10651805
糖原溶液	Qiagen	158930
血球计数器	BOECO	BOE 01
倒置光学显微镜	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green 超混合液	Bio-Rad	172-5121
微量离心管	Costar （Corning）	3621	使用前应进行高压灭菌
P3HR-1 细胞系	ATCC	HTB-62
青霉素-链霉素解决方案	Biowest	L0022
苯酚	VWR	20599.297
佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA）	Sigma-Aldrich	P8139
移液器灌装机	Thermo Scientific	9501
精密湿巾	Kimtech	7552
RPMI-1640 培养基	Sigma	R7388
SL 16R 离心	Thermo Scientific	75004030
醋酸钠	Riedel-de Haën （Honeywell）	25022
分光光度计	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
台盼蓝溶液	Sigma	T8154
水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific	4121