通过高通量微流体压缩系统对多细胞生物进行机械刺激

Summary

本协议描述了微流体系统的设计，制造和表征，该系统能够以最少的用户干预对齐，固定和精确压缩数百个 黑腹果蝇 胚胎。该系统可实现高分辨率成像和样品回收，以进行刺激后分析，并且可以扩展以适应其他多细胞生物系统。

Abstract

在胚胎发生过程中，协调的细胞运动产生调节基因表达和活性的机械力。为了研究这一过程，已经使用抽吸或盖玻片压缩等工具来机械刺激整个胚胎。这些方法限制了实验设计，因为它们不精确，需要人工处理，并且只能同时处理几个胚胎。微流体系统在自动化此类实验任务的同时提高通量和精度方面具有巨大潜力。本文描述了一种微流体系统，用于精确压缩整个 黑腹果 蝇（果蝇）胚胎。该系统具有带有气动驱动可变形侧壁的微通道，可实现胚胎对齐、固定、压缩和刺激后收集。通过将这些微通道并行到七个通道中，可以同时将稳定或动态压缩模式应用于数百个 果蝇 胚胎。在玻璃盖玻片上制造该系统有助于使用高分辨率显微镜同时对样品进行机械刺激和成像。此外，利用生物相容性材料（如PDMS）以及流体流过系统的能力使该设备能够对介质依赖性样品进行长期实验。这种方法还消除了手动安装的需要，手动安装会对样品施加机械压力。此外，从微通道快速收集样品的能力使刺激后分析成为可能，包括需要大量样品的组学测定，这是使用传统机械刺激方法无法实现的。该系统的几何形状易于扩展到不同的生物系统，使许多领域能够从本文描述的功能特征中受益，包括高样品通量、机械刺激或固定以及自动比对。

Introduction

生命系统在其一生中不断经历并响应各种机械输入¹.机械转导与许多疾病有关，包括发育障碍、肌肉和骨质流失以及通过直接或间接受机械环境影响的信号通路的神经病理学²。然而，机械敏感信号通路⁴中受机械刺激³调控的基因和蛋白质在很大程度上仍然未知⁵，阻碍了机械调节机制的阐明和与病理机械转导相关的疾病的分子靶点的鉴定6^，7.将机械生物学研究投射到相关生理过程的一个限制因素是使用具有常规培养皿的单个细胞而不是完整的多细胞生物。模式生物，如黑腹果蝇（果蝇），对理解参与动物发育的基因、信号通路和蛋白质做出了巨大贡献⁸，^9，10。然而，在机械生物学研究中使用果蝇和其他多细胞模式生物受到实验工具挑战的阻碍。用于准备、分类、成像或应用各种刺激的传统技术大多需要手动操作;这些方法非常耗时，需要专业知识，引入可变性，并限制实验设计和样本量¹¹。最近的微技术进步是实现具有非常高通量和高度受控实验参数的新型生物测定的重要资源¹²，^13，14。

本文介绍了一种增强型微流体装置的开发，该装置以单轴压缩的形式对准、固定和精确地将机械刺激应用于数百个完整的 果蝇 胚胎¹⁵（图 1）。微流体系统与玻璃盖玻片的集成允许在刺激期间对样品进行高分辨率共聚焦成像。微流体装置还能够在刺激后快速收集胚胎以进行组学测定（图2）。本文描述了该装置的设计考虑因素，以及使用软光刻和实验表征的制造。由于制造这种器件的硅晶圆模具需要在具有高纵横比（AR）沟槽（AR >5）的大面积上均匀涂覆厚光刻胶（厚度>200μm），因此该方法大大修改了传统的光刻模具制造方案。通过这种方式，该方法促进了光刻胶的处理、粘附、涂覆、图案化和开发。此外，还讨论了潜在的陷阱及其解决方案。最后，使用其他多细胞系统（如 果蝇 卵室和脑类器官¹⁶）证明了这种设计和制造策略的多功能性。

Protocol

1. 硅片模具的制备

1. 首先用丙酮清洁硅片（见 材料表），然后用异丙醇（IPA）清洁。
2. 将硅晶片放在250°C热板上30分钟以进行脱水烘烤（图3A）。
3. 在蒸汽底炉中用六甲基二硅氮烷（HDMS）涂覆硅晶片（见 材料表）（工艺温度:150°C，工艺压力:2托，工艺时间:5分钟，HDMS体积:5μL）（图3B）。
4. 将一瓶SU-8 2100光刻胶（见 材料表）放入60°C烘箱中15分钟以降低其粘度。
   注意:在烤箱中加热时，光刻胶的粘度降低。粘度较低的光刻胶可以更容易地处理，并且可以更准确地浇注在晶圆顶部。
5. 将硅晶片放在60°C热板上，为每英寸晶片倒入1mL加热的光刻胶，直到光刻胶覆盖大部分表面（图3C）。
6. 将光刻胶涂层的硅片转移到旋涂机上（参见 材料表）。
7. 首先以 250 rpm 的速度预旋转 30 秒，然后在 350 rpm 下再施加 30 秒，两者的加速度均为 100 rpm/s（图 3D）。
8. 使用洁净室拭子从硅晶片边缘去除多余的光刻胶。
9. 首先以 500 rpm 的速度以 100 rpm/s 的加速度旋转 15 秒，然后以 1450 rpm 的速度以 300 rpm/s 的加速度旋转 30 秒（图 3E）。
10. 用洁净室棉签去除边缘珠。
11. 将硅晶片放在50°C热板上，并在晶圆上喷洒丙酮以去除缺陷并促进均匀涂层（图3F）。
12. 以 2°C/min 的速度缓慢将热板的温度升至 95 °C。
13. 在95°C下软烘烤硅片50分钟（图3G）。
14. 以 2°C/min 的速度缓慢冷却热板至室温。
15. 将硅晶圆放在掩模对准器上（参见 材料表），并将光掩模放在其顶部（有关光掩模几何形状，请参阅 补充图1 ）。
16. 使用接触掩模对准器通过光掩模将硅晶圆暴露在 350 mJ/cm 2 紫外光（35 mW/cm² 下 10 秒）（图 3H）。
17. 通过将晶片放在50°C的热板上5分钟，在65°C下再加热5分钟，最后在80°C下再加热20分钟，在硅晶片上连续曝光后烘烤（图3I）。
18. 以2°C/min的速度缓慢冷却硅片至室温。
19. 将直径略小于硅晶片的磁力搅拌器放入烧杯中。将硅晶片倒置，并将其放在烧杯顶部。
20. 将烧杯放入另一个较大的烧杯中，并用新的显影剂溶液填充较大的烧杯（参见 材料表）。在搅拌器打开的情况下，将硅晶片浸没在显影剂中30分钟（图3J）。
21. 将硅晶片转移到装有新鲜显影剂的超声波浴超声仪中，以40kHz的频率放置1小时（图3K）。
22. 用 IPA 溶液彻底清洗硅晶圆以获得最终的硅晶圆模具（图 3L）。

2. 微流控芯片的制造

1. 将硅晶圆模具与 10 滴 （~500 μL） 三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷 （PFOCTS，见 材料表） 一起放入干燥器中附近的小称重船中。
2. 将干燥器连接到真空泵上，压力约为200托30分钟。
3. 关闭干燥阀并断开真空泵过夜以进行PFOCTS涂层。
4. 通过将PDMS碱与固化剂（见 材料表）以10:1的比例混合来制备预固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
5. 通过将混合物放入离心机（室温下500× g5 分钟）中对混合物进行脱气。
   注意:这种离心允许气泡迁移到顶部表面，从而在短时间内去除。
6. 将脱气的PDMS溶液倒在硅晶圆模具上。
7. 再次脱气以去除滞留在模具表面的气泡。
8. 将PDMS在60°C烘箱中固化1小时50分钟（图3M）。
9. 使用手术刀切割与微流控芯片几何形状相对应的固化PDMS区域的边界（图3N）。
10. 剥离 PDMS 部件并将其倒置放在切割垫上。
11. 使用剃须刀将PDMS部件切割成最终形状（图3O）。
12. 使用活检打孔器（见 材料表）或带有钝尖的针头（图3P）在PDMS上打孔。
    1. 对于胚胎入口孔，请使用直径为4毫米的冲头。
    2. 对于胚胎出口孔，请使用直径为1.3毫米的冲头。
    3. 对于进气孔，请使用 2 mm 冲头。
13. 使用一块透明胶带去除可能残留在PDMS图案表面上的任何颗粒。
14. 首先用丙酮清洁 24 mm x 60 mm 矩形载玻片，然后用 IPA 清洁。
15. 用连接到过滤空气源的气枪擦干玻璃表面。
16. 通过将脱水烘烤放在250°C热板上2小时，将其应用于载玻片（图3Q）。
17. 用烧杯盖住载玻片以防止表面污染。
18. 将PDMS及其图案面朝上，将脱水的玻璃玻片放入等离子清洁器中（参见 材料表）。
19. 用18 W的氧气等离子体处理PDMS和载玻片30秒。
20. 将PDMS放在载玻片上，其图案表面朝向载玻片，通过共价键合 密封 微通道（图3R）。
21. 使用镊子轻轻地将PDMS部件推到载玻片上，以确保完全的构象接触。
22. 将完成的微流控芯片在室温下储存过夜，以使键合达到其最终强度。

3. 果蝇胚胎的制备

1. 允许俄勒冈-R成蝇在苹果汁琼脂平板（1.5%琼脂，25%苹果汁，2.5%蔗糖）上产卵，并在产卵后的所需发育时间收集平板进行给定实验。
   注意:对于本实验，在140分钟收集板以在细胞化阶段¹⁷为胚胎准备和分类。
2. 用胚胎蛋液（0.12M NaCl，0.04%Triton-X 100）淹没琼脂，并用画笔轻轻搅拌胚胎以将它们从琼脂中取出。
3. 将胚胎转移到50%漂白剂溶液中90秒，偶尔搅拌。通过组织筛过滤胚胎，并用水彻底洗去漂白剂溶液。
4. 将胚胎转移到90毫米玻璃培养皿中，并有足够的胚胎蛋液以完全覆盖胚胎。
5. 在解剖显微镜上用透照检查胚胎，并选择所需发育阶段的胚胎以加载到微流体装置中。
   注意:在此应用程序中，选择了细胞化阶段的胚胎。有关如何确保正确选择发育阶段的详细说明，请参阅 果蝇¹⁷的实验室手册。

4. 利用微流控芯片对果蝇胚胎进行机械刺激

1. 通过主胚胎入口向所有七个胚胎微通道填充0.4μm过滤的IPA。
2. 用 0.4 μm 过滤去离子 （DI） 水替换 IPA。
3. 用胚胎蛋液代替去离子水。
4. 使用玻璃移液管从玻璃培养皿中收集大约 100 个预选胚胎。
5. 将胚胎移液到胚胎入口（图4A）。
6. 使用便携式真空泵向气体入口施加约3 PSI负压（即真空）以打开胚胎微通道。
7. 向下倾斜微流控芯片，使胚胎自动对齐并沉淀到胚胎微通道中（图4B）。
8. 如果胚胎微通道入口被同时进入的多个胚胎堵塞，请向上倾斜微流控芯片，然后再次向下倾斜以清除堵塞。
9. 根据所需的吞吐量，将多达300个胚胎引入胚胎微通道。
10. 胚胎加载完成后，移除真空以固定胚胎。
11. 将微流控芯片倾斜回水平位置（图4C）。
12. 将带有压力表的便携式正压源（见 材料表）连接到进气口以施加 3 PSI 压缩（图 4D）。
13. 持续检查压力表，以确保应用的压缩水平一致。
14. 如果要对机械刺激的胚胎进行实时成像实验，请将微流控芯片放在标准显微镜载物台玻璃载玻片支架上，气体入口连接到压力源。
15. 压缩实验完成后，可以收集胚胎进行下游分析。为此，首先，将真空施加到气体入口以释放胚胎。
16. 然后，向上倾斜微流控芯片以使胚胎向胚胎引入端口移动（图4E）。
17. 使用玻璃移液管从微流控芯片中收集胚胎。
    注意:收集后，可以通过将果蝇生长到成年期来研究压缩对胚胎发育和活力的影响。微流体装置的高通量处理能力还使胚胎可用于需要大量样品的下游组学测定（图2）。

Results

微流体系统分为两个由可变形的PDMS侧壁隔开的子隔间。第一个隔间是液体系统，其中果 蝇 胚胎被引入，自动对齐，排列和压缩。第二个隔室是气体系统，其中压缩通道两侧的气体压力通过死端微通道 控制 ，以精确控制压缩通道的有效宽度。微流体装置在底部用载玻片密封，从而能够对微流控装置相关尺寸的样品进行高分辨率实时成像（补充图2）。

多细胞生物如 果蝇 胚胎在所需的胚胎发育阶段被选择。就 果蝇 胚胎而言，所有发育阶段都同样符合这种方法，因为胚胎大小在孵化之前不会改变。使用玻璃微量移液器通过大入口（即直径4mm）将选定的样品引入微流体装置。然后将装置向下倾斜，以使胚胎流入以平行方式组织的七个压缩通道。连接胚胎入口和压缩通道的狭窄中庭确保胚胎在到达压缩通道入口之前自动对齐。施加在气体入口上的真空使可变形侧壁向外偏转，增加有效微通道宽度并允许胚胎依次进入压缩通道。七个压缩通道长 22 毫米，并行，单次运行可容纳多达 300 个 果蝇 胚胎。压缩通道终止于瓶颈，其中微通道的宽度减...

Discussion

本文介绍了一种微流体装置的开发，该装置可以自动对齐，固定并精确地将机械刺激应用于数百个完整的 果蝇 胚胎。微流体系统与薄玻璃盖玻片的集成允许在刺激期间用高分辨率共聚焦显微镜对胚胎进行成像。微流体装置还能够在刺激后立即收集胚胎以进行下游生物测定。详细描述了该器件的设计考虑因素、制造方法和特性。硅晶圆模具制造方案允许光刻胶具有高纵横比沟槽的均匀厚涂层。

为了使这种制造方法取得成功，重要的是降低烘烤步骤的温度，并在硅片涂覆光刻胶后最大限度地降低硅片的加热和冷却速率。如果操作不当，光刻胶涂层很容易分层并改变模具几何形状。一旦硅晶圆模具成功制造，就可以将其复制到更耐用的材料中，以防止在连续的PDMS复制成型步骤中损坏原始模具，其中还包含加热和冷却循环²¹。通过复制成型制造PDMS微流控装置依赖于从模具中成功剥离高纵横比侧壁结构。为了使该制造步骤可靠，必须用硅烷化剂适当地涂覆硅片表面以促进剥离。在制造大约20个PDMS器件后，涂层也应更新，以补偿每个剥离步骤中硅烷层的部分去除。否则，侧壁可能会卡在光刻胶图案内，使模具无法使用。由...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL 带 60 mm 培养皿的三角多孔塑料烧杯	Fisher	14-955-111B	带气孔
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP测试级硅片	大学晶片	452
打孔	Ted Pella	15110
漂白剂			非品牌特定
钝针套装	CML Supply	901
接触式口罩对准器	Quintel	Q4000 MA
切割垫	Dahle	Vantage 10670	：24" x 36"
开发商	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
直写平版画家	海德堡	MLA100
解剖显微镜			任何市售的带透射光的解剖显微镜
玻璃培养皿	Fisher	FB0875713A
载玻片	华纳仪器	64-0710 （CS-24/60）
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			非品牌特定
Oven	Labnet	I5110A
画笔			非品牌特定
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
光刻胶	MicroChem	SU-8 2100
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-32G
便携式压力源	清洗机 最安静	HGD946
压力表	Cole-Parmer	EW-68950-25
旋涂机	Laurell	WS-650-8B
三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷 （PFOCTS）	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	Fisher	AAA16046AP
Tubing	Saint-Gobain	02-587-1A
超声波清洗机	Cole-Parmer	UX-08895-05
真空泵	Cole-Parmer	EW-07164-87