本方案描述了在细胞中诱导自噬的方法 黑腹果蝇 幼虫脂肪体 通过 营养耗竭并利用转基因果蝇品系分析自噬变化。
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本文内容
摘要
摘要
自噬是一种细胞自我消化的过程，可在多种应激条件下（包括营养缺乏）将货物运送至溶酶体进行降解。自噬功能障碍与衰老及多种人类疾病相关。自噬机制在进化上高度保守，从酵母到人类均存在。 幼虫脂肪体 黑腹果蝇，作为脊椎动物肝脏和脂肪组织的类似物，为监测自噬提供了独特的模型 体内自噬可通过幼虫脂肪体中的营养缺乏而轻易诱导。大多数自噬相关基因在进化上是保守的 果蝇 已开发出多种表达标记型自噬标志物的转基因果蝇品系，这有助于监测自噬过程中的不同步骤。克隆分析技术能够在同一组织样本中对具有不同基因型的细胞进行自噬标志物的直接比较。本方案详细描述了以下操作步骤：（1）在幼虫脂肪体中产生体细胞克隆，（2）诱导自噬 通过 氨基酸饥饿，以及（3）解剖幼虫脂肪体，旨在建立一个利用自噬体标记物（GFP-Atg8a）和克隆分析来研究自噬差异的模型。
引言
自噬是一种由多种应激（包括氨基酸饥饿1）诱导的“自我降解”过程。大自噬（下文简称为自噬）是研究最为深入的自噬类型，在维持细胞稳态中发挥不可替代的作用2。自噬功能障碍与多种人类疾病相关3。此外，一些自噬相关基因是治疗多种疾病的潜在靶点4。
自噬过程以高度复杂的方式受到调控5。在营养缺乏条件下，隔离膜包裹胞质物质，形成双层膜结构的自噬体6。随后，自噬体与内体和溶酶体融合，形成兼性体（amphisomes）和自噬溶酶体（autolysosomes）。在溶酶体水解酶的作用下，被包裹的胞质内容物被降解，营养物质得以回收利用7。
自噬是一种在进化上保守的过程8. 黑腹果蝇 是研究自噬过程的理想模型 体内氨基酸饥饿可轻易诱导果蝇脂肪体组织中的自噬，该组织类似于人类的肝脏和脂肪组织9自噬相关蛋白（如 Atg8、Atg9、Atg18、Syx17、Rab7、LAMP1 和 p62 ....
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方案
1. Drosophila 杂交与产卵
- 将3只雄性（基因型 hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a）和15只雌性（基因型 y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP）成虫果蝇（见材料表）放入一个培养管（含标准玉米粉/糖浆/琼脂培养基的Drosophila培养管，置于25 °C条件下）进行交配。
注意：必须设置多个相同的杂交培养管，以确保获得足够数量的幼虫用于后续实验。雄性果蝇品系（基因型 hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a）在X染色体着丝粒附近携带FRT位点（FRT19A），并在37 °C热激条件下表达FLP。该品系X染色体上插入了泛表达RFP的转基因。GFP-Atg8a在幼虫脂肪体中由cgGal4驱动表达22。雌性果蝇品系（基因型 y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP）在X染色体上携带致死突变（Mu）和FRT19A位点。详细的杂交方案见图1。 - 为促进产卵，将果蝇转移至新的培养管。在引入果蝇48小时后....
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结果
在营养充足条件下，GFP标记的类泛素蛋白GFP-Atg8a在细胞内呈弥散分布。饥饿处理后，其形成绿色斑点并标记自噬体。当自噬体与溶酶体融合后，GFP在酸性的自噬溶酶体中被淬灭，绿色斑点随之消失。若自噬未被诱导，或自噬体成熟过程加快，则GFP斑点的数量预期较低。然而，若自噬体与溶酶体的融合受阻，或自噬溶酶体的pH变为碱性，则GFP斑点的数量和/或大小预期会增加。
在本方案中，FLP/FRT 系统可诱导有丝分裂重组，从而产生同时含有野生型和突变型细胞的组织。野生型细胞表达 RFP，而突变型细胞则不表达 RFP。若所有脂肪体细胞均表达 RFP，则表明 FLP/FRT 介导的有丝分裂重组未成功诱导，或该突变具有细胞致死效应。在后一种情况（即突变具有细胞致死性）下，幼虫脂肪体中应出现少数 RFP 信号强度高于周围细胞的细胞。
在图2中，GFP-Atg8a（绿色）在野生型细胞（红色）中形成点状结构，表明自噬过程已成功诱导。在突变克隆（RFP阴性）中，GFP-Atg8a点状结构的分.......
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讨论
本实验方案描述了以下方法：（1）在幼虫脂肪体中产生携带突变克隆的果蝇，（2）通过氨基酸饥饿诱导自噬，以及（3）解剖幼虫脂肪体。为了在幼虫脂肪体中成功产生克隆，必须认真执行以下关键步骤。（1）准确控制热激时间至关重要，因为有丝分裂重组仅在组织处于有丝分裂阶段时发生；（2）热激的温度和持续时间对于诱导FLP表达均极为关键。建议采用标准的37 °C水浴，热激1小时。考虑到热激和饥饿过程中胚胎/幼虫死亡率升高的可能性，必须设置多次杂交以获得足够的组织样本用于成像。
此外，考虑到实际培养条件，某些步骤可能需要进行调整。例如，不同实验室之间的环境条件和黑腹果蝇（Drosophila）培养基可能存在差异，这会影响幼虫的生长速率。因此，胚胎发育至三龄早期所需的时间以及幼虫饥饿处理时间（在20%蔗糖中培养以诱导自噬）可能需要在每个实验室中分别进行标准化。
GFP-Atg8a 是确定自噬最常用的标记物。然而，GFP-Atg8a 斑点模式的变化无法直接精确定位自噬缺陷的具体环节或受影响的步骤。因此，必须分析多个标记物才能准确解读此.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢THFC和BDSC提供果蝇品系。赵彤博士的研究得到国家自然科学基金（32030027、91754103、92157201）和中央高校基本科研业务费的资助。我们感谢生命科学研究所（LSI）核心设施提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 镊子 | Dumont | RS-5015 | |
| 9 孔点样板 | PYREX | 7220-85 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | SMZ1500 | |
| 甘油 | 生工生物 | A100854-0100 | |
| KCl | 生工生物 | A610440-0500 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| KH2PO4 | 生工生物 | A600445-0500 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| 实验室刮刀 | Fisher | 14-375-10 | |
| 长镊子 | R' DEER | RST-14 | |
| 显微镜盖玻片 | CITOTEST | 80340-1130 | |
| 显微镜载玻片 | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | 生工生物 | A501727-0500 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| NaCl | 生工生物 | A610476-0005 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 培养皿 | Corning | 430166 | |
| 标准玉米粉/糖蜜/琼脂果蝇食物 | 唐实验室自制 | ||
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ745 | |
| 蔗糖 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10021418 | |
| 含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vectorlabratory | H-1200-10 | 推荐使用的封片介质 |
| 果蝇品系 | |||
| y'w* Iso FRT19A | 唐实验室果蝇品系 | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | 唐实验室果蝇品系 | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | 唐实验室果蝇品系 | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | 唐实验室果蝇品系 |
参考文献
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushi....
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重印与许可
