本方案描述了在细胞中诱导自噬的方法 黑腹果蝇 幼虫脂肪体 通过 营养耗竭并利用转基因果蝇品系分析自噬变化。
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摘要
摘要
自噬是一种细胞自我消化的过程，可在多种应激条件下（包括营养缺乏）将货物运送至溶酶体进行降解。自噬功能障碍与衰老及多种人类疾病相关。自噬机制在进化上高度保守，从酵母到人类均存在。 幼虫脂肪体 黑腹果蝇，作为脊椎动物肝脏和脂肪组织的类似物，为监测自噬提供了独特的模型 体内自噬可通过幼虫脂肪体中的营养缺乏而轻易诱导。大多数自噬相关基因在进化上是保守的 果蝇 已开发出多种表达标记型自噬标志物的转基因果蝇品系，这有助于监测自噬过程中的不同步骤。克隆分析技术能够在同一组织样本中对具有不同基因型的细胞进行自噬标志物的直接比较。本方案详细描述了以下操作步骤：（1）在幼虫脂肪体中产生体细胞克隆，（2）诱导自噬 通过 氨基酸饥饿，以及（3）解剖幼虫脂肪体，旨在建立一个利用自噬体标记物（GFP-Atg8a）和克隆分析来研究自噬差异的模型。
引言
自噬是一种由多种应激（包括氨基酸饥饿1）诱导的“自我降解”过程。大自噬（下文简称为自噬）是研究最为深入的自噬类型，在维持细胞稳态中发挥不可替代的作用2。自噬功能障碍与多种人类疾病相关3。此外，一些自噬相关基因是治疗多种疾病的潜在靶点4。
自噬过程以高度复杂的方式受到调控5。在营养缺乏条件下，隔离膜包裹胞质物质，形成双层膜结构的自噬体6。随后，自噬体与内体和溶酶体融合，形成兼性体（amphisomes）和自噬溶酶体（autolysosomes）。在溶酶体水解酶的作用下，被包裹的胞质内容物被降解，营养物质得以回收利用7。
自噬是一种在进化上保守的过程8. 黑腹果蝇 是研究自噬过程的理想模型 体内氨基酸饥饿可轻易诱导果蝇脂肪体组织中的自噬，该组织类似于人类的肝脏和脂肪组织9自噬相关蛋白（如 Atg8、Atg9、Atg18、Syx17、Rab7、LAMP1 和 p62 等）的特异性点状分布模式在自噬缺陷条件下受到破坏10因此，分析这些自噬标志物的模式将有助于识别自噬缺陷的发生以及具体的缺陷自噬步骤。例如，类泛素蛋白Atg8是最常用的自噬标志物11在 黑腹果蝇，已成功构建了带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的Atg8a的转基因品系12GFP-Atg8a 在营养充足的细胞中弥散分布于细胞质和细胞核内。饥饿处理后，GFP-Atg8a 被加工并由磷脂酰乙醇胺（PE）修饰，形成点状结构，标记隔离膜和完全形成的自噬体。13,14通过直接荧光显微镜观察，自噬诱导可被轻松识别为GFP-Atg8点状结构的形成增加15Atg8a 斑点在自噬起始存在缺陷的情况下，即使处于饥饿状态也不会形成。由于GFP-Atg8a可在自噬溶酶体的低pH环境中被淬灭并降解，因此若自噬在晚期阶段受阻，GFP-Atg8a斑点的数量可能会增加16.
由于自噬对营养物质的可利用性高度敏感17，培养条件的微小差异常常导致表型变异。因此，克隆分析（即在同一组织中对突变细胞与野生型对照细胞进行比较分析）在解析自噬缺陷方面具有显著优势18。利用同源染色体之间由翻转酶/翻转酶识别靶点（FLP/FRT）介导的位点特异性重组，可便捷地构建携带嵌合组织的果蝇模型19,20。突变细胞周围的野生型细胞可作为理想的内部对照，以消除个体差异的影响21。
本研究描述了如何通过氨基酸饥饿诱导自噬，并产生表达GFP-Atg8a的镶嵌型脂肪体组织。这些实验方案可用于分析突变克隆之间自噬水平的差异。
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方案
1. Drosophila 杂交与产卵
- 将3只雄性（基因型 hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a）和15只雌性（基因型 y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP）成虫果蝇（见材料表）放入一个培养管（含标准玉米粉/糖浆/琼脂培养基的Drosophila培养管，置于25 °C条件下）进行交配。
注意：必须设置多个相同的杂交培养管，以确保获得足够数量的幼虫用于后续实验。雄性果蝇品系（基因型 hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a）在X染色体着丝粒附近携带FRT位点（FRT19A），并在37 °C热激条件下表达FLP。该品系X染色体上插入了泛表达RFP的转基因。GFP-Atg8a在幼虫脂肪体中由cgGal4驱动表达22。雌性果蝇品系（基因型 y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP）在X染色体上携带致死突变（Mu）和FRT19A位点。详细的杂交方案见图1。 - 为促进产卵，将果蝇转移至新的培养管。在引入果蝇48小时后，轻敲"交配"培养管，使果蝇被震晕并掉落至管底培养基上。
- 打开"交配"培养管，用一个装有新鲜培养基的倒置空管（新鲜培养管）盖住管口，然后通过翻转并轻敲的方式将果蝇转移至新鲜培养管中。
- 塞好装有转移果蝇的新鲜培养管，丢弃旧的培养管。将该新鲜培养管置于25 °C培养箱中，使果蝇在新鲜培养基上产卵。
注意：在转移果蝇前，将新鲜培养管预先在25 °C条件下温育15分钟，有助于果蝇快速适应新环境，从而加快产卵速度。
- 在产卵6小时后移除果蝇。若需重复实验，可将这些果蝇转移至另一培养管（如步骤1.2所述）；否则，将果蝇倒入含有75%乙醇的烧杯中弃去。
- 将含有胚胎的培养管置于37 °C水浴中孵育1小时，以诱导FLP表达。随后将培养管转移至25 °C培养箱中，使胚胎继续发育。
注意：突变克隆的成功形成可通过后续成像确认。无RFP信号的区域即为突变克隆。
- 将含有胚胎的培养管置于37 °C水浴中孵育1小时，以诱导FLP表达。随后将培养管转移至25 °C培养箱中，使胚胎继续发育。
2. 氨基酸饥饿诱导自噬
- 使用实验室刮勺，在产卵后75小时将含有发育中幼虫的培养基转移至直径为75 mm的培养皿中。向培养皿中加入3 mL 1× PBS，并用长柄镊子轻轻分离培养基与幼虫。挑选10至15条早期三龄幼虫。
注意：需仔细挑选早期三龄幼虫。幼虫的发育阶段对本实验方案的成功至关重要。由于产卵时间受限，培养管中的大多数幼虫在孵化75小时后应处于早期三龄阶段。然而，不同配方的培养基可能导致幼虫发育时间出现差异。区分早期三龄幼虫的标准包括体长、前部和后部气门的存在，以及口器部位的下颚钩结构23。 - 用1× PBS填充9孔玻璃凹孔载玻片的各孔（参见材料表）。使用长柄镊子将分离出的三龄幼虫放入各孔中，并充分清洗幼虫以彻底去除所有培养基残留物。
- 取一个空管，加入5 mL 20%蔗糖（溶于1× PBS）溶液，并用长柄镊子将清洁后的三龄幼虫转移至该溶液中。将此管置于25 °C培养箱中孵育6小时，随后收集幼虫用于解剖。
注意：20%蔗糖（溶于1× PBS）溶液作为缺乏氨基酸的饥饿培养基。
3. 三龄幼虫解剖及样品组织处理
- 使用磨刀石将两把 #5 镊子（参见材料表）的两侧均匀磨尖。
- 向 9 孔玻璃凹孔载片的每个孔中加入 400 µL 的 1× PBS，并用长镊子将幼虫转移至孔中。每孔放置一只幼虫，使其背侧（气管所在侧）朝上。
- 用两把 #5 镊子夹住幼虫躯干中部的角质层，轻轻撕开角质层。暴露的脂肪体及其他内部组织仍将附着在幼虫残体上。尽量拉开以充分暴露内部器官。对所有幼虫重复此步骤。
注意：每只幼虫躯干两侧各有一大片脂肪体。脂肪体组织呈白色、不透明、扁平的单层结构，在解剖显微镜下易于识别24。
- 用两把 #5 镊子夹住幼虫躯干中部的角质层，轻轻撕开角质层。暴露的脂肪体及其他内部组织仍将附着在幼虫残体上。尽量拉开以充分暴露内部器官。对所有幼虫重复此步骤。
- 将幼虫残体转移至含有 500 µL 4% 多聚甲醛（PFA）的 1.5 mL 微量离心管中。在 25 °C 下孵育 30 分钟，期间不要振荡管子。
警告：4% PFA 具有毒性。操作时需佩戴手套和口罩进行防护。
注意：建议使用 1× PBS 缓冲液配制 4% PFA。PFA 粉末不能立即溶于 1× PBS 中，因此需将混合液在 65 °C 恒温箱中孵育过夜，或在 25 °C 下间歇振荡 45 分钟以促进溶解。 - 幼虫残体与 4% PFA 孵育 30 分钟后，用移液器吸去 PFA 溶液，向管中加入 500 µL 1× PBS，并在平轨摇床上轻轻振荡 10 分钟，随后弃去 PBS 溶液（重复此洗涤步骤 3 次）。
- 用长镊子将固定并洗涤后的幼虫残体转移至盛有 1× PBS 的 9 孔凹孔载片的一个孔中。使用 #5 镊子去除所有非脂肪体组织。
- 使用 #5 镊子将脂肪体组织置于载玻片上，以 80% 甘油作为封片剂，盖上盖玻片。
注意：封片前应检测 80% 甘油的 pH 值（使用 pH 试纸，pH = 7 为最佳），以保护 GFP 信号。含有 DAPI 的 80% 甘油封片剂（参见材料表）有助于观察脂肪体细胞的细胞核。制备好的玻片在 4 °C 避光保存条件下可稳定存放 1 周。
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结果
在营养充足条件下，GFP标记的类泛素蛋白GFP-Atg8a在细胞内呈弥散分布。饥饿处理后，其形成绿色斑点并标记自噬体。当自噬体与溶酶体融合后，GFP在酸性的自噬溶酶体中被淬灭，绿色斑点随之消失。若自噬未被诱导，或自噬体成熟过程加快，则GFP斑点的数量预期较低。然而，若自噬体与溶酶体的融合受阻，或自噬溶酶体的pH变为碱性，则GFP斑点的数量和/或大小预期会增加。
在本方案中，FLP/FRT 系统可诱导有丝分裂重组，从而产生同时含有野生型和突变型细胞的组织。野生型细胞表达 RFP，而突变型细胞则不表达 RFP。若所有脂肪体细胞均表达 RFP，则表明 FLP/FRT 介导的有丝分裂重组未成功诱导，或该突变具有细胞致死效应。在后一种情况（即突变具有细胞致死性）下，幼虫脂肪体中应出现少数 RFP 信号强度高于周围细胞的细胞。
在图2中，GFP-Atg8a（绿色）在野生型细胞（红色）中形成点状结构，表明自噬过程已成功诱导。在突变克隆（RFP阴性）中，GFP-Atg8a点状结构的分...
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讨论
本实验方案描述了以下方法：（1）在幼虫脂肪体中产生携带突变克隆的果蝇，（2）通过氨基酸饥饿诱导自噬，以及（3）解剖幼虫脂肪体。为了在幼虫脂肪体中成功产生克隆，必须认真执行以下关键步骤。（1）准确控制热激时间至关重要，因为有丝分裂重组仅在组织处于有丝分裂阶段时发生；（2）热激的温度和持续时间对于诱导FLP表达均极为关键。建议采用标准的37 °C水浴，热激1小时。考虑到热激和饥饿过程中胚胎/幼虫死亡率升高的可能性，必须设置多次杂交以获得足够的组织样本用于成像。
此外，考虑到实际培养条件，某些步骤可能需要进行调整。例如，不同实验室之间的环境条件和黑腹果蝇（Drosophila）培养基可能存在差异，这会影响幼虫的生长速率。因此，胚胎发育至三龄早期所需的时间以及幼虫饥饿处理时间（在20%蔗糖中培养以诱导自噬）可能需要在每个实验室中分别进行标准化。
GFP-Atg8a 是确定自噬最常用的标记物。然而，GFP-Atg8a 斑点模式的变化无法直接精确定位自噬缺陷的具体环节或受影响的步骤。因此，必须分析多个标记物才能准确解读此...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢THFC和BDSC提供果蝇品系。赵彤博士的研究得到国家自然科学基金（32030027、91754103、92157201）和中央高校基本科研业务费的资助。我们感谢生命科学研究所（LSI）核心设施提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 镊子 | Dumont | RS-5015 | |
| 9 孔点样板 | PYREX | 7220-85 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | SMZ1500 | |
| 甘油 | 生工生物 | A100854-0100 | |
| KCl | 生工生物 | A610440-0500 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| KH2PO4 | 生工生物 | A600445-0500 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| 实验室刮刀 | Fisher | 14-375-10 | |
| 长镊子 | R' DEER | RST-14 | |
| 显微镜盖玻片 | CITOTEST | 80340-1130 | |
| 显微镜载玻片 | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | 生工生物 | A501727-0500 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| NaCl | 生工生物 | A610476-0005 | 1x PBS 溶液的组成成分 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 培养皿 | Corning | 430166 | |
| 标准玉米粉/糖蜜/琼脂果蝇食物 | 唐实验室自制 | ||
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ745 | |
| 蔗糖 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10021418 | |
| 含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vectorlabratory | H-1200-10 | 推荐使用的封片介质 |
| 果蝇品系 | |||
| y'w* Iso FRT19A | 唐实验室果蝇品系 | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | 唐实验室果蝇品系 | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | 唐实验室果蝇品系 | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | 唐实验室果蝇品系 |
参考文献
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