本方案介绍了环状肽的合成方法 通过 半胱氨酸与甲硫氨酸之间的双烷基化反应，以及由丙炔基锍中心引发的高效硫醇-炔反应。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，环肽因其优异的生物活性而在药物发现领域受到越来越多的关注，并已进入临床应用。因此，探索有效的环肽合成策略对其在药物发现领域的应用至关重要。本文报道了一种利用树脂上或分子内（分子间）双烷基化反应高效合成环肽的详细实验方案。采用该方案，通过固相肽合成技术，在树脂上同时偶联半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）来合成线性肽；进一步地，通过双烷基化反应合成环肽 通过 利用可调节的连接链和链上锍中心实现甲硫氨酸（Met）与半胱氨酸（Cys）之间的双烷基化。整个合成路线可分为三个主要步骤：树脂上Cys的脱保护、连接链的偶联，以及在三氟乙酸（TFA）裂解溶液中Cys与Met之间的环化反应。此外，受锍中心反应性的启发，将丙炔基引入Met以触发巯基-炔加成反应，从而形成环肽。随后，粗肽经干燥后溶于乙腈，通过高效液相色谱（HPLC）进行分离和纯化。采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）确认环肽的分子量，并进一步通过HPLC验证环肽在还原剂存在下的稳定性。此外，通过核磁共振分析了环肽中的化学位移 1氢核磁共振（1氢核磁共振（H NMR）谱图。总体而言，本方案旨在建立一种合成环肽的有效策略。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）1在药物研究与开发中发挥着关键作用。通过化学手段构建具有固定构象的稳定化多肽，是开发PPI模拟基序的最重要方法之一2。迄今为止，已有多种靶向PPIs的环状多肽被开发用于临床应用3。大多数多肽被限制为α-螺旋构象，以降低构象熵，并提高其代谢稳定性、靶标结合亲和力以及细胞通透性4,5。在过去20年中，研究人员已将Cys6,7、赖氨酸（lysine）8,9、色氨酸（tryptophan）10、精氨酸（arginine）11以及Met12,13的侧链引入非天然氨基酸中，以将多肽固定为环状构象。这类环状多肽可靶向独特的化学空间或特定位点，从而引发共价反应，形成蛋白质-多肽共价结合
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方案
1. 仪器设备准备
警告：吗啉、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、三氟乙酸（TFA）、哌啶、乙醚和甲醇具有毒性、挥发性和腐蚀性。这些试剂可通过吸入、摄入或皮肤接触对人体造成伤害。进行所有化学实验时，应使用防护装备，包括一次性手套、实验服和护目镜。
- 按照 图1 所示，使用 Rink-酰胺 4-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂，通过标准的手动 Fmoc 固相多肽合成法（SPPS）29 构建所有多肽底物。
- 构建线性多肽可选择以下两种方法之一：其一，使用缩合剂 2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）和 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）作为试剂；其二，使用 1-羟基苯并三唑（HOBT）和 N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）作为酰胺缩合试剂。根据多肽序列选择合适的合成方案。
- 为建立手动多肽合成装置，将改装后的真空固相萃取设备置于通风橱中，并连接三通旋塞。然后将聚丙烯滤芯或玻璃反应器安装在设备上，并接入氮气（N2）气体。
注：改装真空固相萃取设备时，需移除萃取管，保留真空密封系统。 - 将 MBHA 树脂装入树脂填充柱中，并用 DMF ....
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结果
所有线性肽均采用标准手动Fmoc固相合成法在Rink-酰胺MBHA树脂上合成。如图5A所述，构建了一种模型环状六肽（Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2）。值得注意的是，通过甲硫氨酸烷基化反应生成了一个新的连接臂手性中心，两种差向异构体环肽（Ia、Ib）经反相HPLC确认。此外，通过反相HPLC峰面积积分确定了差向异构体的转化率及其比例。由线性六肽Ac-WMAAAC-NH2生成的环化产物Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH2（1-Ia和1-Ib）表现出不同的保留时间但具有相同的分子量（图5B）。接下来，进一步测试了该环肽对不同官能团的耐受性，结果如图5C所示。使用双卤素连接子评估了10种线性肽的成环效率，结果显示所有肽均能高效生成相应的环状肽。与其他环肽相比，一种具有高转化率的模型六环环肽产生了1:1的差向异构体比例，并可通过HPLC分离。然而，在某些情况下，肽的差向异构体在H.......
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讨论
本文所述的合成方法提供了一种利用肽序列中的Cys和Met合成环肽的途径，其中基本的线性肽通过常规的固相肽合成技术构建。对于Cys与Met之间的双烷基化环肽合成，整个合成路线可分为三个主要步骤：树脂上Cys的脱保护、连接子的偶联，以及在三氟乙酸裂解溶液中Cys与Met之间的环化反应。值得注意的是，Cys保护基的去除被发现是后续成环反应的关键步骤。因此，需对Trt-Cys进行脱保护处理，直至溶液不再呈现明显的黄色为止。进一步研究表明，通过Cys与Met之间双烷基化方法开发的环肽可拓展应用于多种肽的环合，前提是该肽含有Cys和Met这两种氨基酸。此外，肽序列和连接子也可根据实验设计进一步调整（图5）。因此，有必要通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）对合成过程进行监测。
对于硫醇-炔型反应中的环状肽，首先在树脂上通过常规的固相肽合成技术构建线性肽，随后在液相溶液中进行以下反应。粗肽从树脂上裂解后，通过反相高效液相色谱法进行纯化。将肽溶液与炔丙基溴混合，加入0.2 mL的MeCN/H2O (1:1, v/v) .......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢国家重点项目&中国#38;D计划（2021YFC2103900）；国家自然科学基金项目（21778009 和 21977010）；广东省自然科学基金（2022A1515010996 和 2020A1515010521）；深圳市科技创新委员会项目（RCJC20200714114433053、JCYJ201805081522131455 和 JCYJ20200109140406047）；深圳-香港脑科学研究院—深圳市基础研究机构项目（2019SHIBS0004）。作者感谢期刊提供的支持 化学科学， 英国皇家化学学会，参考文献30 有机化学杂志，美国化学会，参考文献31。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,3-双(溴甲基)苯 | Energy | D0215 | |
| 1,3-二甲基巴比妥酸 | Energy | A46873 | |
| 1H NMR 和 HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-羟基苯并三唑水合物 | Energy | E020543 | |
| 2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU） | Energy | A1797 | |
| 2-巯基吡啶 | Energy | Y31130 | |
| 6-氨基己酸 | Energy | A010678 | |
| 乙酸酐 | Energy | A01021454 | |
| 乙腈 | Aldrich | 9758 | |
| 碳酸铵 | Energy | 12980 | |
| 二氯甲烷（DCM） | Energy | W330229 | |
| 数字加热冷却干浴器 | Thermo Scientific | 88880029 | |
| 二异丙基乙胺（DIPEA） | Energy | W320014 | |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | Energy | B020051 | |
| 二硫苏糖醇 | Energy | A10027 | |
| 电喷雾电离质谱 | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31701 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | 南京肽研生物科技有限公司 | R32001 | |
| 甲酸 | Energy | W810042 | |
| 高效液相 色谱 | SHIMADZU | LC-2030 | |
| 甲醇 | Aldrich | 9758 | |
| 吗啉 | Aldrich | M109062 | |
| N,N'-二异丙基碳二亚胺 | Energy | B010023 | |
| 茚三酮试剂 | Energy | N7285 | |
| 丙炔基溴 | Energy | W320293 | |
| Rink 酰胺 MBHA 树脂 | 南京肽研生物科技有限公司 | ||
| 固相萃取（SPE）样品收集板 | Thermo Scientific | 60300-403 | |
| 四(三苯基膦)钯 | Energy | T1350 | |
| 三通旋塞阀 | Bio-Rad | 7328107 | |
| 三乙胺 | Energy | B010737 | |
| 三氟乙酸（TFA） | J&K | 101398 | |
| 三异丙基硅烷（TIS） | Energy | T1533 |
参考文献
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible....
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重印与许可
