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方法文章

利用连接臂上的硫鎓中心构建环状多肽

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DOI：

10.3791/64289

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2022年9月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了环状肽的合成方法 通过 半胱氨酸与甲硫氨酸之间的双烷基化反应，以及由丙炔基锍中心引发的高效硫醇-炔反应。

摘要

近年来，环肽因其优异的生物活性而在药物发现领域受到越来越多的关注，并已进入临床应用。因此，探索有效的环肽合成策略对其在药物发现领域的应用至关重要。本文报道了一种利用树脂上或分子内（分子间）双烷基化反应高效合成环肽的详细实验方案。采用该方案，通过固相肽合成技术，在树脂上同时偶联半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）来合成线性肽；进一步地，通过双烷基化反应合成环肽 通过 利用可调节的连接链和链上锍中心实现甲硫氨酸（Met）与半胱氨酸（Cys）之间的双烷基化。整个合成路线可分为三个主要步骤：树脂上Cys的脱保护、连接链的偶联，以及在三氟乙酸（TFA）裂解溶液中Cys与Met之间的环化反应。此外，受锍中心反应性的启发，将丙炔基引入Met以触发巯基-炔加成反应，从而形成环肽。随后，粗肽经干燥后溶于乙腈，通过高效液相色谱（HPLC）进行分离和纯化。采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）确认环肽的分子量，并进一步通过HPLC验证环肽在还原剂存在下的稳定性。此外，通过核磁共振分析了环肽中的化学位移 1氢核磁共振（1氢核磁共振（H NMR）谱图。总体而言，本方案旨在建立一种合成环肽的有效策略。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）1在药物研究与开发中发挥着关键作用。通过化学手段构建具有固定构象的稳定化多肽，是开发PPI模拟基序的最重要方法之一2。迄今为止，已有多种靶向PPIs的环状多肽被开发用于临床应用3。大多数多肽被限制为α-螺旋构象，以降低构象熵，并提高其代谢稳定性、靶标结合亲和力以及细胞通透性4,5。在过去20年中，研究人员已将Cys6,7、赖氨酸（lysine）8,9、色氨酸（tryptophan）10、精氨酸（arginine）11以及Met12,13的侧链引入非天然氨基酸中，以将多肽固定为环状构象。这类环状多肽可靶向独特的化学空间或特定位点，从而引发共价反应，形成蛋白质-多肽共价结合14,15,16,17。在Yu等人近期的一项研究中，氯乙酰胺被锚定在多肽配体的结构域上，实现了与蛋白质的高度特异性共价偶联反应18。此外，Walensky等人进一步将丙烯酰胺和芳基磺酰氟（ArSO2F）等亲电弹头引入多肽中19，以形成稳定的多肽共价抑制剂，并增强多肽抑制剂的抗肿瘤效果。因此，引入额外的功能基团以实现对蛋白质-多肽配体的共价修饰具有重要意义20。这些基团不仅能与多肽侧链上的蛋白质发生反应，还能稳定多肽的二级结构21。然而，由于合成路线复杂以及化学基团存在非特异性结合问题，由多肽配体诱导的共价修饰蛋白的应用仍受到限制22,23。因此，迫切需要开发有效的环状多肽合成策略。

受环肽多种策略的启发2,24,25,26，本实验方案旨在建立一种简单且高效的肽链稳定化方法。此外，我们注意到，当稳定肽的侧链基团在空间上接近肽配体时，可与靶蛋白发生共价反应。2013年，Deming课题组开发了一种新型选择性修饰肽甲硫氨酸的方法，填补了甲硫氨酸缺乏化学修饰手段的空白27。基于上述背景，Shi 等人聚焦于通过侧链成环形成锍盐中心的研究。当肽配体与靶蛋白结合时，锍盐基团可与空间邻近的半胱氨酸蛋白发生共价反应。近年来，Shi 等人设计了一种新的环肽稳定化方法28。该方法利用含巯基的还原剂将环肽上的锍盐还原，可逆地恢复为甲硫氨酸。然而，该反应效率较低，不利于后续的生物学应用研究。在本研究中，设计了甲硫氨酸-半胱氨酸以及丙炔溴-半胱氨酸的成环反应，使环肽侧链上保留单一的锍盐结构。该锍盐作为新型反应弹头，在空间邻近条件下可与蛋白中的半胱氨酸发生共价反应。简而言之，通过分子内烷基化反应，将含有半胱氨酸和甲硫氨酸突变的肽链环化，从而生成连接臂上的锍盐中心。在此过程中，侧链桥的形成对环肽至关重要。总体而言，本方案详细描述了一种基于锍盐的肽环化方法，该方法仅需简单的反应条件和操作步骤即可实现，旨在为拓展其在生物学领域的广泛应用提供一种潜在的技术途径。

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方案

1. 仪器设备准备

警告：吗啉、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、三氟乙酸（TFA）、哌啶、乙醚和甲醇具有毒性、挥发性和腐蚀性。这些试剂可通过吸入、摄入或皮肤接触对人体造成伤害。进行所有化学实验时，应使用防护装备，包括一次性手套、实验服和护目镜。

  1. 按照 图1 所示，使用 Rink-酰胺 4-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂，通过标准的手动 Fmoc 固相多肽合成法（SPPS）29 构建所有多肽底物。
  2. 构建线性多肽可选择以下两种方法之一：其一，使用缩合剂 2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）和 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）作为试剂；其二，使用 1-羟基苯并三唑（HOBT）和 N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）作为酰胺缩合试剂。根据多肽序列选择合适的合成方案。
  3. 为建立手动多肽合成装置，将改装后的真空固相萃取设备置于通风橱中，并连接三通旋塞。然后将聚丙烯滤芯或玻璃反应器安装在设备上，并接入氮气（N2）气体。
    注：改装真空固相萃取设备时，需移除萃取管，保留真空密封系统。
  4. 将 MBHA 树脂装入树脂填充柱中，并用 DMF 溶解。调节三通旋塞至 N2 鼓泡状态，然后使用连接真空系统的蠕动泵除去柱内溶剂。根据以下公式计算所需氨基酸或缩合剂的用量：
    氨基酸（g）和缩合剂（g） = 树脂用量（g） × 树脂载量（mmol/g） × 当量数（5 eq） × 分子量（g/mol）
    ​注：根据偶联多肽的长度选择合适的树脂装载体积。使用多个当量（eq）的氨基酸可使反应更充分。液体试剂需根据密度换算为体积。5 eq 表示计算所得化合物的投入量放大五倍。

2. 树脂准备

注意：根据偶联肽的长度选择上样树脂的量。

  1. 称取302 mg Rink-amide MBHA树脂（载量为0.331 mM/g）至柱中（20 mL储液罐）。加入5–10 mL DCM或DMF，通入N2鼓泡溶胀30分钟。
  2. 随后关闭N2开关，打开真空泵抽滤开关以除去溶剂。接着依次用DCM（5–10 mL）和DMF（5–10 mL）各洗涤树脂5次。

3. N端Fmoc脱保护

注意：吗啉脱保护需要 30 分钟，而哌啶脱保护需要 5 分钟。

  1. 配制N端9-芴甲氧羰基（Fmoc）脱保护溶液：在玻璃容器中配制足量（500 mL）的20%（v/v）哌啶或50%（v/v）吗啉的DMF溶液，用于Fmoc基团的脱保护。
  2. 向柱中加入10 mL去保护溶液，通入N₂鼓泡2 到……中 溶液中孵育30分钟，或每次5分钟重复2次，并重复脱保护步骤2次。
  3. 用真空泵抽干溶液，并用二氯甲烷（5–10 mL）和 N,N-二甲基甲酰胺（5–10 mL）依次洗涤树脂，各洗 5 次。
  4. 每次脱保护后，使用5% 茚三酮（Kaiser试验）检测树脂，若溶液呈深黄色则表明Fmoc基团已完全去除，方可进行下一步偶联反应。具体操作如下：取少量树脂加入1 mL DMF，再加入200 µL 5% 茚三酮溶液至玻璃管中，于130 °C加热3 min，观察树脂颜色变化。
  5. 用真空泵抽干溶液，并用二氯甲烷（5–10 mL）和 N,N-二甲基甲酰胺（5–10 mL）依次洗涤树脂，各洗 5 次。

4. 连接线性肽（图2）

注意：当合成肽序列包含两个或更多重复单元时，可直接选择氨基酸类型（如 Fmoc-AA-OH 或 Fmoc-AAA-OH 等）进行偶联反应。对于具有空间位阻的某些特殊氨基酸或较长氨基酸序列的肽，需适当延长偶联反应时间。

  1. 以单个偶联步骤为例，以Cys残基的偶联为例（合成300 mg树脂规模）。在聚丙烯管中配制混合溶液，包含Fmoc-Cys(Trt)-OH（5当量，292 mg）和HATU（5当量，206 mg），或Fmoc-Cys(Trt)-OH（5当量，292 mg）和HOBT（5当量，106 mg），并用3 mL DMF溶解。
  2. 向Cys溶液中加入173 µL DIPEA（10当量）或154 µL DIC（10当量）以活化氨基酸。让混合物预活化1分钟。将该混合液加入装有树脂的柱中，并用N2鼓泡反应2小时。
    注：具体反应时间应根据5%茚三酮检测结果进行标准化确定。
  3. 偶联完成后，取少量树脂加入1 mL DMF，再取200 µL 5%茚三酮溶液加入玻璃管中，在130 °C加热3分钟。观察树脂是否变为无色，以确认去保护步骤前无游离氨基存在。
  4. 使用真空泵抽干溶液，并依次用DCM（5–10 mL）和DMF（5–10 mL）各洗涤树脂5次。
  5. 向柱中加入10 mL去保护溶液，用N2鼓泡30分钟，或分两次每次5分钟，加入新鲜溶液后重复去保护步骤2次。
  6. 重复以下步骤：Fmoc基团的去保护；检测树脂去保护程度；洗涤树脂；氨基酸偶联；检测偶联反应。重复偶联步骤直至所有肽链合成完成。
    ​注：使用Kaiser试验监测每一步去保护是否完全，以及每一步氨基酸偶联是否彻底。或者，可从树脂上切下少量肽段，通过LC-MS检测以确认偶联成功。

5. Met 与 Cys 之间的双烷基化（图3）

  1. 通过重复步骤 4.1–4.6 构建含有 Met 和 Cys 的线性肽。在线性肽偶联完成后，向装有树脂的柱中加入 10 mL 无水甲醇进行脱水，并用 N2 吹干以备下次使用（重复 2 次）。
  2. 将上一步得到的 100 mg 树脂称量后装入柱中（20 mL 储液器），在偶联步骤前依次用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂。
  3. 配制用于去除 Cys 三苯甲基（trt）保护基的溶液。在玻璃容器中配制足量（100 mL）TFA/TIS/DCM（3:5:92）混合液，用于去除保护基。
  4. 向柱中加入 5–10 mL TFA/TIS/DCM（3:5:92）溶液，反应 10 分钟以去除保护基。重复六次，并持续通入 N2 气泡，直至黄色完全消失。
  5. 用真空泵抽干溶液，并依次用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂 5 次。
  6. 配制与去保护 Cys 反应的溶液。在玻璃容器中配制足量（50 mL）反应混合液（DMF），其中包含二卤代连接子（2 当量）和 DIPEA（4 当量），用于与去保护的 Cys 反应。
  7. 向柱中加入 5–10 mL 反应溶液，在通入 N2 的条件下反应至少 3 小时。反应完成后，用无水甲醇脱水，并用 N2 吹干以备后续使用。
  8. 用真空泵抽干溶液，并依次用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂 5 次。
  9. 配制用于肽环化的溶液：在通风橱内的玻璃容器中配制足量（20 mL）TFA 混合液（TFA:TIS:H2O = 95:2.5:2.5），用于肽环化反应。
  10. 将 5–10 mL TFA 混合液加入聚丙烯管中，在 TFA 混合液中裂解树脂，反应 3 小时。
    注意：TFA 具有强腐蚀性和刺激性，肽裂解过程应在通风橱中进行。
  11. 执行步骤 7.1–7.5，通过反相液相纯化（HPLC）获得线性肽溶液。将溶液冷冻干燥以备后续使用。

6. 丙炔基锍盐环化反应（图4）

  1. 通过重复步骤 4.1–4.6 构建含 Met 和 Cys 的线性肽。在线性肽偶联完成后，向装有树脂的柱中加入 10 mL 无水甲醇进行脱水，并用 N2 吹干以备下次使用（重复两次）。
  2. 称取上一步得到的树脂 100 mg 置于柱中（20 mL 储液器），在偶联步骤前用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂。
  3. 执行步骤 7.1–7.5，通过 HPLC 获得线性肽溶液，并如前所述将样品冷冻干燥，以备后续使用。
  4. 配制 1% HCOOH 水溶液（体积比）和 1.0 mM 丙炔基溴（5 当量），加入至 Met 肽溶液中（0.2 mM，1 当量；0.2 mL MeCN/H2O [1:1, v/v]）。
  5. 随后，在室温下振荡反应 12 小时，完成 Met 与丙炔基溴的偶联反应。
  6. 反应结束后，将产物溶解于聚丙烯管中的乙腈中，并通过 0.22 µm 滤膜过滤。然后立即通过反相 HPLC 纯化溶液，并冷冻干燥成粉末以供后续使用。
  7. 最后一步，将含丙炔基溴的肽加入聚丙烯管中，通过添加 (NH4)2CO3 溶液将反应体系 pH 维持在 8.0，并在 37 °C 下振荡反应 12 小时。此步骤得到丙炔基锍盐环肽。
  8. 收集最终反应混合物：将其溶解于聚丙烯管中的乙腈中，并通过 0.22 µm 滤膜过滤。然后立即通过反相 HPLC 纯化溶液，并冷冻干燥成粉末以供后续使用。

7. 环肽的纯化

  1. 通过重复步骤 4.1–4.6 在 Rink-酰胺 MBHA 树脂上构建线性肽底物。在线性肽偶联完成后，向装有树脂的柱中加入 10 mL 无水甲醇进行脱水，并用 N2 吹干以备后续使用（重复两次）。
  2. 在通风橱中配制足量的裂解试剂（TFA/H2O/TIS，v/v/v，95:2.5:2.5）。向聚丙烯管中加入 1–5 mL TFA 混合溶液，在 TFA 裂解试剂中裂解树脂 3 小时。
  3. 随后，在柱中用 N2 气流依次吹干树脂。或者，使用滤膜装置过滤树脂并收集肽溶液。然后向肽溶液中加入 20 mL 乙醚以沉淀肽，于 3,500 × g 离心 5 分钟，重复两次。收集粗肽沉淀物，并在 N2 气流下吹干以进行下一步操作。
  4. 将 200 mg 粗肽溶解于 4 mL 乙腈-水溶液中，置于聚丙烯管内，经 0.22 µm 滤膜过滤。将滤液转移至 HPLC 进样小瓶内衬中，将内衬放入配备 C18 5 µm、4.6 mm × 250 mm 色谱柱和 1 mL 进样环的半制备型反相 HPLC 系统的自动进样器中。
  5. 采用含 0.1% TFA 的水相与乙腈进行梯度洗脱（5%–95% 乙腈，30 分钟），纯化并分离肽，同时在 254 nm 处监测 HPLC 谱图。通过 LC-MS 确认肽的分子量，收集目标肽溶液，并冷冻干燥成粉末以供后续使用。

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结果

所有线性肽均采用标准手动Fmoc固相合成法在Rink-酰胺MBHA树脂上合成。如图5A所述，构建了一种模型环状六肽（Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2）。值得注意的是，通过甲硫氨酸烷基化反应生成了一个新的连接臂手性中心，两种差向异构体环肽（Ia、Ib）经反相HPLC确认。此外，通过反相HPLC峰面积积分确定了差向异构体的转化率及其比例。由线性六肽Ac-WMAAAC-NH2生成的环化产物Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH2（1-Ia和1-Ib）表现出不同的保留时间但具有相同的分子量（图5B）。接下来，进一步测试了该环肽对不同官能团的耐受性，结果如图5C所示。使用双卤素连接子评估了10种线性肽的成环效率，结果显示所有肽均能高效生成相应的环状肽。与其他环肽相比，一种具有高转化率的模型六环环肽产生了1:1的差向异构体比例，并可通过HPLC分离。然而，在某些情况下，肽的差向异构体在H...

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讨论

本文所述的合成方法提供了一种利用肽序列中的Cys和Met合成环肽的途径，其中基本的线性肽通过常规的固相肽合成技术构建。对于Cys与Met之间的双烷基化环肽合成，整个合成路线可分为三个主要步骤：树脂上Cys的脱保护、连接子的偶联，以及在三氟乙酸裂解溶液中Cys与Met之间的环化反应。值得注意的是，Cys保护基的去除被发现是后续成环反应的关键步骤。因此，需对Trt-Cys进行脱保护处理，直至溶液不再呈现明显的黄色为止。进一步研究表明，通过Cys与Met之间双烷基化方法开发的环肽可拓展应用于多种肽的环合，前提是该肽含有Cys和Met这两种氨基酸。此外，肽序列和连接子也可根据实验设计进一步调整（图5）。因此，有必要通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）对合成过程进行监测。

对于硫醇-炔型反应中的环状肽，首先在树脂上通过常规的固相肽合成技术构建线性肽，随后在液相溶液中进行以下反应。粗肽从树脂上裂解后，通过反相高效液相色谱法进行纯化。将肽溶液与炔丙基溴混合，加入0.2 mL的MeCN/H2O (1:1, v/v) ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢国家重点项目&中国#38;D计划（2021YFC2103900）；国家自然科学基金项目（21778009 和 21977010）；广东省自然科学基金（2022A1515010996 和 2020A1515010521）；深圳市科技创新委员会项目（RCJC20200714114433053、JCYJ201805081522131455 和 JCYJ20200109140406047）；深圳-香港脑科学研究院—深圳市基础研究机构项目（2019SHIBS0004）。作者感谢期刊提供的支持 化学科学， 英国皇家化学学会，参考文献30 有机化学杂志，美国化学会，参考文献31。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,3-双(溴甲基)苯EnergyD0215
1,3-二甲基巴比妥酸EnergyA46873
1H NMR 和 HSQCBruker AVANCE-III 400
1-羟基苯并三唑水合物EnergyE020543
2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）EnergyA1797
2-巯基吡啶EnergyY31130
6-氨基己酸EnergyA010678
乙酸酐EnergyA01021454
乙腈Aldrich9758
碳酸铵Energy12980
二氯甲烷（DCM）EnergyW330229
数字加热冷却干浴器 Thermo Scientific88880029
二异丙基乙胺（DIPEA）EnergyW320014
二甲基甲酰胺（DMF）EnergyB020051
二硫苏糖醇EnergyA10027
电喷雾电离质谱SHIMADZU2020 LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH南京肽研生物科技有限公司R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH南京肽研生物科技有限公司R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH南京肽研生物科技有限公司R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH南京肽研生物科技有限公司R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH南京肽研生物科技有限公司R30701
Fmoc-His(Boc)-OH南京肽研生物科技有限公司R30902
Fmoc-Ile-OH南京肽研生物科技有限公司R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH南京肽研生物科技有限公司R31201
Fmoc-Met-OH南京肽研生物科技有限公司R31301
Fmoc-Pro-OH南京肽研生物科技有限公司R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH南京肽研生物科技有限公司R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH南京肽研生物科技有限公司R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH南京肽研生物科技有限公司R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH南京肽研生物科技有限公司R31901
Fmoc-Val-OH南京肽研生物科技有限公司R32001
甲酸EnergyW810042
高效液相
色谱		SHIMADZULC-2030
甲醇Aldrich9758
吗啉AldrichM109062
N,N'-二异丙基碳二亚胺EnergyB010023
茚三酮试剂EnergyN7285
丙炔基溴EnergyW320293
Rink 酰胺 MBHA 树脂南京肽研生物科技有限公司
固相萃取（SPE）样品收集板 Thermo Scientific60300-403
四(三苯基膦)钯EnergyT1350
三通旋塞阀Bio-Rad7328107
三乙胺EnergyB010737
三氟乙酸（TFA）J&K101398
三异丙基硅烷（TIS）EnergyT1533

参考文献

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