Cette méthode quantifie l’abondance microbienne à l’aide d’un format de plaque de 96 puits pour les unités formant colonie (UFC) et est appliquée au microbiome de la drosophile dans des échantillons d’homogénat de mouches entières. Les UFC sont comptées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images automatisé fourni ici.
Les intestins des animaux sont colonisés par des microbes commensales, qui ont un impact sur le développement, la santé et le comportement de l’hôte. Une quantification précise de la colonisation est essentielle pour étudier les interactions complexes entre l’hôte et le microbe à la fois pour valider la composition microbienne et étudier ses effets. Drosophila melanogaster, qui a une faible diversité microbienne native et est économique à élever avec une composition microbienne définie, est apparu comme un organisme modèle pour l’étude du microbiome intestinal. L’analyse du microbiome d’un organisme individuel nécessite l’identification des espèces microbiennes présentes et la quantification de leur abondance absolue. Cet article présente une méthode pour l’analyse d’un grand nombre de microbiomes de mouches individuelles. Les mouches sont préparées dans des plaques de 96 puits, ce qui permet de manipuler un grand nombre d’échantillons à la fois. L’abondance microbienne est quantifiée en plaquant jusqu’à 96 homogénats de mouches entières sur une seule plaque de gélose dans un ensemble de taches, puis en comptant les unités formant colonie (UFC) qui se développent dans chaque endroit. Ce système de placage est associé à une plate-forme automatisée de quantification CFU, qui intègre la photographie des plaques, la différenciation des colonies fluorescentes et le comptage automatisé des colonies à l’aide d’un plugin ImageJ. Les avantages sont que (i) cette méthode est suffisamment sensible pour détecter les différences entre les traitements, (ii) la méthode de placage ponctuel est aussi précise que les méthodes de placage traditionnelles, et (iii) le processus de comptage automatisé est précis et plus rapide que le comptage manuel. Le flux de travail présenté ici permet une quantification à haut débit des UFC dans un grand nombre de réplicats et peut être appliqué à d’autres systèmes d’étude microbiologique, y compris in vitro et d’autres modèles de petits animaux.
La relation entre le microbiote intestinal et leur hôte animal est de plus en plus au premier plan des études biologiques1, qui montrent que la composition de la souche du microbiome est importante pour la physiologie de l’hôte 2,3,4. Le rythme des découvertes a été limité par des facteurs de confusion tels qu’une forte variation naturelle interindividuelle et une grande diversité de bactéries colonisatrices 5,6,7. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est apparue comme un modèle prometteur en raison de son microbiome naturellement peu diversifié, de sa facilité de manipulation et de sa génétique hôte robuste 8,9,10,11. Les mouches peuvent être exemptes de germes et réassociées à un microbiote défini12, et il a été démontré que la flore influence les traits physiologiques des mouches13,14. La flore innée se compose d’un ensemble limité de bactéries qui sont toutes cultivables, et leurs proches parents sont également endogènes à l’intestin des mammifères, y compris les lactobacilles, les protéobactéries et les entérocoques15.
L’étude de l’influence du microbiome sur les traits de l’hôte nécessite de quantifier le microbiome en termes d’espèces présentes et d’abondances absolues16. Les méthodes prédominantes d’analyse du microbiome de la mouche sont le nombre d’unités formant des colonies (UFC)17, le séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr16S 9 et la qPCR du gène 18S de l’ARNr16S. Le nombre d’UFC peut être obtenu sans réactifs coûteux, et ils confirment la viabilité des cellules bactériennes19. Les techniques 16S, y compris la qPCR, présentent des avantages en ce sens que les identités taxonomiques des microbes peuvent être déterminées sans tenir compte de leurs besoins de croissance ou de la morphologie des colonies20.
Dans le cas où les expériences utilisent des mouches avec un microbiome défini de bactéries connues (mouches gnotobiotiques), le nombre d’UFC présente des avantages particuliers par rapport au séquençage21. Le séquençage est coûteux, nécessitant une extraction d’ADN, une préparation de bibliothèque basée sur la PCR et un séquençage à haut débit pour obtenir des abondances relatives22. En raison de leur coût élevé, les méthodes de séquençage à haut débit doivent généralement être effectuées en vrac pour réduire le prix par échantillon23. D’autres méthodes telles que la qPCR sont nécessaires pour obtenir des abondances absolues16. En revanche, le nombre d’UFC est rapide et bon marché et donne le nombre absolu de cellules viables. La drosophile8 et d’autres petits modèles de microbiome 24, y compris le ver, Caenorhabditis elegans 25,26, et le poisson-zèbre larvaire, Danio rerio, cultivé gnotobiotiquement 27, ont une gamme limitée de bactéries, qui ont des caractéristiques de croissance connues 28. Dans ces cas, en particulier chez les animaux gnotobiotiques, le comptage de l’UFC peut différencier toutes les espèces de bactéries au sein des communautés intestinales multi-espèces21,27,29. Des méthodes de comptage CFU à débit plus élevé amélioreraient encore la rentabilité et la rapidité de la mesure de la composition du microbiome et pourraient être appliquées à de nombreuses autres expériences de microbiologie.
Le comptage des UFC par dilution en série d’une suspension bactérienne sur un milieu de croissance à base d’agar est une méthode standard dans le domaine de la microbiologie. Les colonies qui poussent sur les plaques sont ensuite comptées manuellement. Les dilutions permettent au chercheur de sélectionner une densité de colonies qui est dénombrable (p. ex., ~100 UFC par plaque), ce qui signifie que les colonies ne se développent pas les unes dans les autres et peuvent être comptées dans un laps de temps raisonnable. La plupart des microbiologistes utilisent essentiellement la même méthode de comptage de l’UFC développée il y a 140 ans dans le laboratoire de Robert Koch, et pour de nombreuses applications, cette méthode est encore adéquate. Cependant, un problème se pose lorsqu’on cherche à quantifier un grand nombre d’échantillons. Un seul échantillon peut nécessiter le placage de 1 à 10 dilutions en série de l’échantillon pour obtenir des UFC dénombrables, de sorte que les expériences impliquant plus de quelques dizaines d’échantillons deviennent éprouvantes. Diverses méthodes ont été mises au point pour accroître l’efficacité du dénombrement des UFC. Le placage en spirale automatisé élimine le besoin de dilutions en série30, ce qui rend une seule plaque nécessaire pour le comptage de l’UFC mais augmente le temps nécessaire pour plaquer l’échantillon. Le repérage de dilution sur plaque unique en série (SP-SDS) permet d’estimer l’UFC à partir d’un nombre réduit de plaques par échantillon31. Ces méthodes constituent une amélioration par rapport à la méthode traditionnelle de placage à tartiner, mais nécessitent toujours la manipulation et le placage d’échantillons bactériens seuls et ne sont donc pas idéales pour un débit élevé. La manipulation d’échantillons dans des plaques à 96 puits et le placage ponctuel de ces 96 échantillons sur des plaques de gélose rectangulaires améliorent considérablement le débit des échantillons19.
Les microbiomes sont généralement composés de plusieurs souches et espèces. Alors que les espèces peuvent souvent être distinguées par la morphologie de la colonie ou les milieux de croissance, la fluorescence peut être utilisée pour distinguer davantage différents types de bactéries et leurs caractéristiques de croissance32. Par exemple, différents génotypes de la même espèce peuvent être marqués avec différentes protéines fluorescentes codées génétiquement. Les méthodes d’imagerie sur plaque qui intègrent la fluorescence permettent aux chercheurs de tirer parti de ces techniques génétiques dans les tests basés sur l’UFC32. L’intégration de la fluorescence dans les méthodes de comptage des UFC à haut débit améliorerait encore leur utilité.
Le comptage manuel des UFC devient fastidieux lorsqu’il y a un grand nombre d’échantillons. Le comptage automatisé des UFC peut être effectué en photographiant la plaque et en traitant l’image à l’aide d’un logiciel spécialisé33. Sieuwerts et al. ont combiné l’efficacité améliorée du placage ponctuel avec le comptage automatisé des colonies à l’aide de la photographie numérique conventionnelle et du logiciel ImageJ19.
Une méthode à haut débit pour dépister les phénotypes de microbes spécifiques et les associations d’hôtes faciliterait les études sur l’assemblage de la communauté du microbiome et l’impact sur la santé et la forme physique de l’hôte. Pour les études du microbiome de la drosophile , une plateforme de microbiologie à haut débit intégrerait la manipulation d’échantillons de mouches dans un format de plaque à 96 puits, la lyse des mouches sans lyse bactérienne, l’efficacité du placage ponctuel, la capacité d’utiliser la fluorescence et de distinguer plusieurs fluorophores, un environnement lumineux contrôlé pour l’imagerie reproductible des plaques d’UFC et un logiciel de comptage de colonies automatisé fiable. Cet article décrit une méthode optimisée pour le dosage des UFC chez les mouches gnotobiotiques, qui est simple, rapide et automatisée. Ce protocole décrit un nouveau flux de travail combinant le meilleur des méthodes précédemment publiées et optimisé pour explorer le microbiome intestinal chez la drosophile.
Les techniques détaillées présentées ici permettent de multiplier par > 100 le nombre d’échantillons pouvant être évalués dans une expérience de comptage de l’UFC. Cette technique fait progresser les méthodes existantes pour les expériences sur le microbiome chez la drosophile 12,35,36 en utilisant le format de plaque à 96 puits pour tester les mouches individuelles. En outre, il applique une méthode de placage ponctuelplus efficace 19,31 et un flux de travail automatisé avec une plate-forme de photographie et de comptage de colonies. L’importance de cette méthode pour la drosophile est de standardiser les expériences au format de plaque à 96 puits, ce qui permet la manipulation simultanée d’un grand nombre de réplicats biologiques avec automatisation pour obtenir une quantification à haut débit des UFC.
La plateforme de 96 puits montre que l’augmentation de la fréquence de transfert et de « l’élimination » des bactéries transitoires entraîne une réduction significative de l’abondance moyenne et de la variation entre les échantillons (Figure 1B,C), démontrant la rigueur de ce protocole amélioré. L’une des limites des mouches de cohabitation est le transfert horizontal de bactéries entre les mouches. Une solution proposée consiste à garder les mouches individuellement dans un format de plaque de 96 puits, comme le plat d’alimentation des animaux entiers38.
Bien qu’une réduction significative de la charge bactérienne n’ait pas été observée lorsque les mouches ont été lavées à l’éthanol, ces mouches n’avaient été gardées en présence de bactéries externes que pendant 3 jours. Le logement pendant de plus longues périodes pourrait permettre à une plus grande charge bactérienne de s’accumuler39. Par conséquent, le lavage à l’éthanol est toujours recommandé.
Le transfert des mouches dans la plaque de 96 puits est la première étape critique pour la mise en place du flux de travail (Figure 1A). Une fois les mouches lavées, elles sont distribuées dans les puits une à la fois. Un tableau des plaques est utile à ce stade pour noter quelles conditions sont présentes dans chaque puits et ajouter des notes telles que « la mouche a été perdue ». L’homogénéisation est une autre étape critique avec quelques mises en garde importantes. Les bactéries survivent au processus d’homogénéisation en présence d’une mouche (Figure 1D,E), et vraisemblablement, ce principe est également vrai lorsque les bactéries sont à l’intérieur de l’intestin de la mouche. Cependant, les bactéries sont également tuées lorsqu’elles sont homogénéisées uniquement dans des plaques de battement de billes, démontrant que l’homogénéisation peut tuer les cellules bactériennes dans certaines circonstances, une limitation qui peut être importante si l’on homogénéise des intestins disséqués, par exemple. Notamment, la perte d’UFC lors de l’homogénéisation dépend du nombre d’UFC dans l’échantillon, et la perte est minime lorsque ~105 UFC par puits sont utilisés. Une préservation plus poussée des UFC peut être obtenue en arrêtant l’homogénéisation à mi-chemin et en refroidissant la plaque sur la glace.
L’homogénéisation a été effectuée pendant 5 minutes dans ce protocole sur la base d’expériences de contrôle où un nombre connu d’UFC ont été mélangées avec une mouche exempte de germes, ce qui a fonctionné empiriquement pour les bactéries de mouches. Moins de coups ont entraîné la présence de plus grandes parties de mouches, ce qui interfère avec le pipetage, tandis que des temps d’homogénéisation significativement plus longs de ~ 10 min ont rendu le nombre d’UFC plus variable. On a observé que le plus petit volume et la forme inclinée des puits à plaques coniques réduisaient l’efficacité du battage des billes par rapport aux tubes cylindriques de 2 mL. De nombreuses variantes de cette approche générale sont possibles, y compris quelles souches bactériennes, quel récipient de battage de perles, quelles perles et quel génotype de mouche sont utilisés. Les cas d’utilisation individuels doivent utiliser des contrôles positifs pour établir leur approche.
La méthode de placage ponctuel a été utilisée d’une manière spécifique : des dilutions 1:2 de L. plantarum WF dans le PBS ont été repérées sur des plaques MRS et incubées à 30 °C pendant 2 jours (des temps d’incubation plus courts peuvent être mis en œuvre pour générer des colonies plus petites). La méthode nécessite un certain investissement initial dans l’équipement, principalement le batteur de billes et le pipettor à 96 canaux (figure 2A), ce qui est nécessaire à la fois pour la série de dilution et le placage ponctuel. Cependant, des options moins coûteuses sont disponibles, y compris un réplicateur de plaques de 96 puits avec des broches fendues. La série de dilutions est une étape critique qui affecte l’exactitude des résultats du comptage de l’UFC. En termes de modes de défaillance, il est possible de boucher les pointes de pipette avec des pièces de mouche ou des perles de verre et que les extrémités de pipette ne scellent pas correctement sur la pipette ou tombent en panne pour une autre raison. Tous ces problèmes entraînent un sous-dénombrement des puits touchés et doivent être surveillés. Un mélange adéquat à chaque étape de la série de dilution est également crucial. Chaque dilution doit être soigneusement mélangée soit en mettant la plaque sur un agitateur à plaques, soit en pipetant de haut en bas 15 à 20 fois, ce qui sert également à rincer les pointes. En repérant de la tôle la plus diluée à la moins diluée, les embouts peuvent être réutilisés pour toute la série de dilution. Avec des dilutions de 1:2, le comptage est précis sur une plage de 2 à 25 colonies, couvrant un ordre de grandeur (Figure 2C). Par conséquent, les dilutions 1:10 permettent d’économiser du temps et des matériaux. Une autre variable dont on peut tirer parti est le temps d’incubation, qui peut être ajusté pour produire des colonies plus petites et, ainsi, augmenter la gamme des taches dénombrables en empêchant la fusion des colonies adjacentes.
Une photo de qualité de la plaque est essentielle car elle devient la source brute des données à partir desquelles les UFC sont analysées et peuvent être archivées indéfiniment. La FluoroBox est conçue pour produire des photos des plaques avec une intensité lumineuse uniforme, ce qui minimise l’éblouissement sur la surface de la gélose. De plus, la conception est capable de photographier sélectivement des colonies fluorescentes à l’aide de lumières LED unicolores et de filtres photo colorés (Figure 3A). La construction d’une installation comme la FluoroBox, avec un éclairage contrôlé et des réglages de caméra, peut augmenter considérablement la reproductibilité des images CFU, ce qui est important pour l’analyse automatisée. La morphologie des colonies, l’intensité de fluorescence et les effets du temps ou de la densité sur la croissance des colonies ne sont que quelques-unes des propriétés qui peuvent être analysées à l’aide des photographies. La boîte à photos peut être construite sans les filtres de couleur et les lumières unicolores si aucune bactérie fluorescente n’est utilisée, ce qui réduit le coût et la complexité. Différents feux d’excitation et filtres d’émission pourraient être substitués à ceux recommandés ici si un fluorophore différent est utilisé par un laboratoire. Une caméra connectée à une tablette via WiFi à l’aide d’une application est utile à la fois pour la fonction d’obturateur automatisé afin d’éviter les tremblements et pour faciliter le transfert de données. Les images peuvent être transférées sur la tablette, puis sur un ordinateur portable à l’aide d’un logiciel de transfert de fichiers sans fil. Les caméras recommandées avec ces capacités sont indiquées dans le tableau des matériaux.
Count-On-It est un plug-in écrit en ImageJ. Le logiciel de comptage CFU automatisé segmente l’image de la plaque dans une grille uniforme de 96 puits, compte les colonies dans chaque cellule de grille et regroupe les résultats dans une simple feuille de calcul. Comme il y a toujours une variation dans la position de la grille spot sur la plaque et sur la photo, l’utilisateur doit conformer manuellement la grille à la photo à l’aide du plug-in Croptacular . Cela permet également d’exclure les zones proches du bord de la plaque, qui présentent un éblouissement. La définition du seuil est essentielle pour obtenir le nombre d’UFC le plus précis à partir de l’image. Si le seuil est fixé trop haut, les colonies fusionneront; Si le seuil est fixé trop bas, les colonies seront exclues. Une fois le seuil défini, la macro applique un flou gaussien pour adoucir les bords et réduire le repliement, le filtre du bassin versant divise les colonies qui se chevauchent et les taches sont comptées à l’aide des particules d’analyse.
Parfois, la densité de colonies est trop élevée à un endroit particulier. Count-On-It fournit un moyen de faire face à cela. Pour estimer le nombre de colonies dans une cellule de grille avec des colonies partiellement fusionnées, on considère d’abord la surface moyenne d’un blob circulaire de la plaque entière comme C moyenne. Ensuite, l’aire du blob A 1 est divisée par la surface moyenne d’un blob circulaire A1/Cmoyenne. Ce nombre est arrondi à l’entier le plus proche, et c’est l’estimation du nombre de colonies dans un blob. Cette fonction est l’une des raisons pour lesquelles le seuil peut influencer les résultats du comptage : la surface moyenne relative de la colonie par rapport à une zone d’objets blob fusionnés sera différente selon la façon dont le seuil affecte les objets blob fusionnés.
Les méthodes présentées ont plusieurs limites. Il s’agit notamment de la nécessité de disposer d’équipements pour distribuer avec précision les fluides liquides à partir de plaques à 96 puits. Cet équipement, qu’il s’agisse d’un pipeteur à 96 canaux ou d’un outil à broche de réplicateur à fente, peut coûter des milliers de dollars à obtenir. Des alternatives moins chères existent mais sont moins précises. Le comptage automatisé via Count-On-It présente également certaines limites. Par exemple, si deux types de colonies dans une population mixte étaient délimités en fonction de la taille seule, le comptage des blob ne serait pas en mesure d’affecter les colonies au type correct. Dans ce cas, les taches avec des blobs devraient être éliminées des dénombrements. Une différenciation plus poussée des colonies en fonction de la morphologie serait une extension précieuse de la méthode qui n’est pas actuellement mise en œuvre. L’utilisation de milieux sélectifs, y compris des nutriments spécifiques à la souche et des antibiotiques, simplifie le besoin d’analyse d’images complexes.
Le maintien des expériences sur les mouches des fruits dans des plaques de 96 puits multiplie le nombre d’échantillons et les conditions qui peuvent être testés dans une seule expérience et peut faciliter les criblages à haut débit dans les phénotypes d’association drosophile-bactérie. Nous envisageons que cette méthode puisse être étendue en utilisant des milieux sélectifs pour différencier de nombreuses souches bactériennes dans des mélanges complexes. La méthode ne se limite pas à l’étude du microbiome des mouches. La quantification des UFC est courante dans de nombreuses applications de la microbiologie, de la numération des coliformes dans l’eau potable à l’identification des agents pathogènes. Le système de placage CFU présenté ici permet des criblages à haut débit, ainsi que l’acquisition, le traitement, le stockage et la livraison automatisés des résultats.
The authors have nothing to disclose.
Le Dr Kerwyn Casey Huang, le Dr Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper et les membres du laboratoire de Ludington ont apporté une contribution précieuse à l’élaboration de ce protocole. Le financement a été fourni par la subvention NSF IOS 2032985, la subvention DP5OD017851 des NIH, une subvention de l’Institut Carnegie du Canada et le Fonds de dotation du Carnegie Institute for Science.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |