方法文章

96孔板格式下的快速菌落形成单位计数应用于 黑腹果蝇 微生物组

11.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64298

⸱

2023年1月13日

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

本文内容

摘要

本方法采用96孔板形式对菌落形成单位（CFUs）进行接种，通过定量微生物丰度应用于整个果蝇匀浆样品中的Drosophila 微生物组。CFUs的计数使用此处提供的自动化图像分析软件完成。

摘要

动物的肠道被共生微生物定植，这些微生物影响宿主的发育、健康和行为。精确量化定植情况对于研究宿主与微生物之间的复杂相互作用至关重要，既可用于验证微生物组成，也可用于研究其效应。Drosophila melanogaster 因其原生微生物多样性较低，且易于以明确的微生物组分进行培养，已成为研究肠道微生物组的模式生物。分析单个生物体的微生物组需要鉴定存在的微生物种类，并量化其绝对丰度。本文介绍了一种用于分析大量个体果蝇微生物组的方法。果蝇在96孔板中进行处理，可实现对大量样本的同步操作。通过将多达96个完整果蝇匀浆液以点样方式接种于单个琼脂平板的不同位点，随后计数各点生长的菌落形成单位（CFUs），从而量化微生物丰度。该接种系统结合了一个自动化的CFU定量平台，该平台包括平板摄影、荧光菌落的区分，以及利用ImageJ插件对菌落进行自动计数。该方法的优势在于：（i）灵敏度足够高，可检测不同处理之间的差异；（ii）点样接种法的准确性与传统平板接种法相当；（iii）自动计数过程比人工计数更准确且更快速。本文所述的工作流程可实现对大量重复样本中CFUs的高通量定量，且可应用于其他微生物学研究系统，包括体外（in vitro）实验及其他小型动物模型。

引言

肠道微生物群与其动物宿主之间的关系正日益成为生物学研究的前沿领域1，研究表明微生物组的菌株组成对宿主生理功能具有重要意义2,3,4。由于个体间天然差异较大以及定植细菌多样性较高，这些混杂因素限制了相关发现的进展5,6,7。果蝇 Drosophila melanogaster 因其天然低多样性的微生物组、易于操作以及强大的宿主遗传学工具，已成为一个极具前景的研究模型8,9,10,11。果蝇可被培育为无菌状态，并可重新定植定义明确的微生物群12，已有研究证实这些菌群会影响果蝇的生理特征13,14。其天然菌群由一组有限的、均可培养的细菌组成，这些细菌的近缘种也常见于哺乳动物肠道中，包括乳杆菌属（Lactobacilli）、变形菌门（Proteobacteria）和肠球菌属（Enterococci）15。

研究微生物组对宿主性状的影响，需要对微生物组进行定量分析，包括确定存在的物种及其绝对丰度16。分析果蝇微生物组的主要方法包括菌落形成单位（CFU）计数17、16S rRNA基因扩增子测序9以及16S rRNA基因的定量PCR（qPCR）18。CFU计数无需昂贵试剂即可获得，且能确认细菌细胞的活性19。包括qPCR在内的16S技术具有优势，可在不依赖微生物生长条件或菌落形态的情况下确定其分类学身份20。

当实验使用已知细菌组成（无菌定义菌群果蝇）的果蝇时，菌落形成单位（CFU）计数相较于测序具有明显优势21。测序成本较高，需要进行DNA提取、基于PCR的文库构建以及高通量测序才能获得相对丰度数据22。由于成本高昂，高通量测序方法通常需批量处理样本以降低单个样本的成本23。此外，还需采用qPCR等其他方法来获取绝对丰度16。相比之下，CFU计数快速、经济，并能提供可存活细胞的绝对数量。Drosophila8 和其他小型微生物组模型24，包括线虫 Caenorhabditis elegans25,26 以及无菌培养的幼年斑马鱼 Danio rerio27 ，其体内细菌种类有限，且这些细菌的生长特性已被充分了解28。在此类情况下，尤其是对于无菌定义菌群动物，CFU计数能够区分多物种肠道群落中的所有细菌种类21,27,29。更高通量的CFU计数方法将进一步提升微生物组组成分析的成本效益和速度，并可应用于更多其他微生物学实验。

通过在基于琼脂的培养基上对细菌悬液进行连续稀释涂布来计数菌落形成单位（CFU），是微生物学领域普遍采用的标准方法。随后，研究人员通过人工方式对平板上生长的菌落进行计数。稀释的目的是使菌落密度处于可计数范围（例如每平板约100个CFU），从而避免菌落相互重叠，能够在合理时间内完成计数。目前大多数微生物学家所使用的CFU计数方法，其基本原理仍源自140年前罗伯特·Koch实验室所建立的技术，对于许多应用而言，该方法依然足够有效。然而，当需要对大量样本进行定量分析时，该方法便暴露出局限性。单个样本通常需要涂布1至10个连续稀释梯度，以获得可计数的CFU，因此当实验样本数量超过几十个时，工作量将显著增加。为提高CFU计数效率，已发展出多种改进方法。自动化螺旋涂布技术消除了对连续稀释的需求30，仅需使用一块平板即可进行CFU计数，但增加了样品点板所需时间。单板-系列稀释点样法（SP-SDS）可实现 每样本使用较少平板的菌落形成单位估算31这些方法虽优于传统的涂布平板法，但仍需逐一处理和接种细菌样品，因此并不适合高通量操作。将样品在96孔板中进行处理，并将这96个样品点样接种到矩形琼脂平板上，可显著提高样品的处理通量。19.

微生物组通常由多种菌株和物种组成。尽管物种通常可以通过菌落形态或培养基来区分，但荧光技术可用于进一步区分不同类型的细菌及其生长特性32。例如，同一物种的不同基因型可通过不同的遗传编码荧光蛋白进行标记。结合荧光的平板成像方法使研究人员能够在基于菌落形成单位（CFU）的检测中利用这些遗传技术32。将荧光技术整合到高通量CFU计数方法中，将进一步提升其应用价值。

当样本数量较多时，手动计数菌落形成单位（CFU）会变得繁琐。可通过拍摄平板照片并使用专业软件处理图像来实现CFU的自动计数33。Sieuwerts 等人将点样接种法提高的接种效率与常规数码摄影及 ImageJ 软件相结合，实现了菌落的自动计数19。

一种高通量筛选特定微生物与宿主关联表型的方法，将有助于研究微生物组群落的组装过程及其对宿主健康与适应性的影响。针对黑腹果蝇（Drosophila）微生物组的研究，一个高通量微生物学平台应具备以下功能：以96孔板格式处理果蝇样本、在不破坏细菌的前提下裂解果蝇组织、高效进行点样涂布、能够使用荧光标记并区分多种荧光染料、提供受控的光照环境以实现菌落形成单位（CFU）平板的可重复成像，以及配备可靠的自动化菌落计数软件。本文介绍了一种专为无菌果蝇中CFU检测而优化的方法，具有操作简便、快速且自动化的特点。本方案概述了一种新颖的工作流程，整合了先前已发表方法中的各项优势，并针对黑腹果蝇（Drosophila）肠道微生物组的研究进行了优化。

方案

1. 果蝇定殖

注意：本方法适用于通过菌落形成单位（CFU）的培养计数，对具有可培养肠道微生物组的果蝇进行定量分析。有关无菌果蝇培养的详细方案此前已有发表12。

  1. 建立一种共生细菌物种的稳定定植。
    1. 制备新鲜的细菌培养物，于室温下以 400 × g 离心 3 分钟收集菌体，并用 PBS 重悬菌体沉淀至 OD600 为 1.0。在本实验方案中，Lactiplantibacillus plantarum（以前称为 Lactobacillus plantarum）在培养过夜后达到 OD600 为 2.0。
    2. 用移液器将 100 µL 菌液滴加到果蝇培养管的食物表面（参见材料表）。均匀涂布，静置 15–30 分钟使液体完全吸收。
    3. 使用标准的培养管翻转技术，将 20 只无菌果蝇转移至该培养管中34。每只果蝇将摄取大致相等剂量的细菌35。也可选择添加无菌卵。
    4. 连续 3 天每天将果蝇转移至含新鲜无菌食物的培养管中。所有操作均应在生物安全柜中进行，并采用无菌操作技术（图 1A-1）。
  2. 在测定 CFU 负荷之前，将果蝇转移至含有无菌水琼脂的培养管中，静置 4 小时，以清除肠道中的短暂性细菌。水琼脂培养管可为果蝇提供水分来源，但不提供营养，因此既不能支持果蝇长期生存，也不能支持表面细菌生长。水琼脂培养管的制备方式与标准果蝇培养管相同，但仅包含去离子水和 1.5% 琼脂。

2. 在96孔PCR板中单独匀浆果蝇

  1. 提前准备珠磨板。
    1. 将0.5 µm玻璃珠（参见材料表）倒入珠计量托盘中（使用补充代码文件1 S1-bead-measurer.stl文件3D打印制成）。将珠子铺在托盘上，使所有孔穴填满并保持水平，然后将多余的珠子刷入锥形管中回收。
    2. 将半裙边PCR板（参见材料表）倒置放在计量托盘上，并通过嵌入托盘上的凹槽对齐孔位。然后迅速翻转，以转移珠子。
    3. 清除PCR板表面多余的珠子，并用铝箔覆盖。检查PCR板，确保所有孔中均含有珠子。如有需要，可使用称量勺向单个孔中添加珠子。若因静电导致珠子粘附在板表面，可用70%乙醇擦拭或喷洒计量托盘背面及PCR板。
    4. 用铝箔覆盖。可按此方法制备多个板，随后进行高压灭菌并储存以备后续使用。使用前，用96通道移液器向每孔加入100 µL PBS（参见材料表）。
  2. 在均质化前，用70%乙醇对携带微生物的果蝇（见步骤1）进行表面灭菌。
    1. 用100% CO2麻醉果蝇5秒。使用小漏斗将麻醉后的果蝇从试管转移至1.5 mL微量离心管中（图1A-2）。本研究中，通常每管加入25只果蝇。
    2. 立即向管内喷入约1 mL 70%乙醇，盖紧管盖，倒置混匀10秒。然后用P1000移液器吸除乙醇，注意避免吸出果蝇。重复乙醇洗涤一次，再用无菌PBS洗涤两次（图1A-3）。
  3. 最后一次PBS洗涤后，盖上管盖，将管倒置，管盖朝下，在实验台上用力敲击数次，使果蝇进入管盖内。
  4. 打开管盖，用镊子将果蝇分装至各孔中（图1A-4）。每孔放入一只果蝇（图1A-5）。加样过程中保持板置于冰上，以维持果蝇的麻醉状态。
  5. 使用Thermal Bond热封铝箔密封板（参见材料表）。
    1. 首先，清除靠近孔周围的散落珠子，以免造成铝箔密封泄漏。确保铝箔哑光面朝下接触板面，光面朝上朝向热封仪。将热封仪（参见材料表）牢固压下5秒（图1A-6）。使用手动压合器（参见材料表）压平，以确保铝箔密封牢固。
      注意：密封不良可能导致样品损失。
  6. 将板固定在板式振荡器中。均质5分钟（图1A-7）。在微型板式离心机（参见材料表）中以350 × g离心30秒，使液体从密封铝箔上脱离。
  7. 取下铝箔时，用手握住板体，避免果蝇匀浆液滴从孔中溅出。

3. 果蝇匀浆液的系列稀释及点样至菌落形成单位（CFU）平板

  1. 在生物安全柜中放置四个矩形 MRS 琼脂培养板（参见材料表），并移去盖子。本方案中使用 MRS 琼脂培养 L. plantarum。 将这些平板晾干至少 10 分钟（若为新倒制或从冷藏保存中取出，则需晾干 20 分钟）。
    注意：如果平板表面潮湿，来自 96 孔板的液滴会融合流动，导致计数失败。
  2. 使用 96 通道移液器，在无菌 96 孔板的每孔中加入 100 µL PBS，制备三个稀释板。将一盒 P20 吸头装入 96 通道移液器。
  3. 通过从第 2 节制备的样品板中吸取 11.1 µL 匀浆液，进行 1:10 稀释（图 1A-8）。务必从孔的中部吸取液体，而非底部，因为果蝇匀浆液和玻璃珠会堵塞移液器吸头。玻璃珠下沉，果蝇碎片上浮，中间层相对澄清。
  4. 将 11.1 µL 液体加入已预先装有 100 µL 无菌 PBS 的第一稀释板中。将稀释板置于板式摇床上，以 600 rpm 振荡 10 秒。再通过上下吹打 5 个循环进行混匀。从第一稀释板中转移 11.1 µL 至第二稀释板，并对后续两个稀释板重复相同的混匀步骤。
  5. 按以下方法进行系列稀释涂布。
    1. 从生物安全柜中取出培养板。
    2. 从最稀释的孔开始，使用 96 孔移液器将每孔中的 2 µL 液体点样至琼脂平板上（图 1A-9）。
      1. 缓慢将移液器头部压下至平板表面，注意不要刺入琼脂。仔细检查平板，确保所有点样已完成；如有遗漏，手动补加 2 µL 至相应位置。确认液体点迅速被琼脂吸收，且不发生融合。
      2. 若点样液滴发生融合，需延长新一组新鲜琼脂平板的干燥时间并重新点样。若存在多种类型的平板（例如不同培养基或含抗生素），也应同时进行点样。将剩余溶液重新加回稀释板中，并进入下一个更高浓度的稀释步骤。
        注意：在进行稀释点样时，应对下一个稀释度吹打混合 5 次，以确保移液器吸头内无前一稀释度残留。稀释板可在 4 °C 下保存 >8 小时而不影响菌落计数35。
  6. 对剩余稀释板重复步骤 3.5 所述的涂布过程，从最稀释到最浓依次进行，直至原始匀浆液所在的平板。
  7. 待所有液体完全被琼脂吸收后，将平板倒置放入培养箱中（图 1A-10）。对于来自 Drosophila 的 Lactiplantibacillus 和 Acetobacter，在 MRS 培养基上的最适培养温度为 30 °C。培养至菌落达到最佳大小：即菌落足够大以便清晰观察，但又不至于过大而相互融合或干扰生长（参见代表性结果部分对最佳大小的量化说明）。
    注意：最佳培养条件因菌株而异，需通过实验确定。对于来自 Drosophila 的 Lactiplantibacillus，在 MRS 琼脂上最适培养时间为 26 至 30 小时；对于来自 Drosophila 的 Acetobacter，最适培养时间则为 30 至 48 小时，具体取决于菌株。
  8. 培养结束后，如需等待计数，可将平板储存于 4 °C。

4. 菌落形成单位（CFU）的定量分析

  1. 通过拍摄平板照片，然后使用自动化软件计数菌落形成单位（CFUs），具体方法如下所述。如果平板曾保存在4 °C环境中，应先使其恢复至室温，以避免平板表面产生冷凝水而造成反光。
  2. 将平板按逻辑顺序排列，并在拍摄过程中保持该顺序，以便于文件命名。将所有平板的方向调整为A1位于左上角。建议在A1角标记唯一编号，以防止照片混淆。将每个稀释梯度系列按顺序叠放。
  3. 取下平板盖，将平板放置在成像台上，确保A1角位于正确的位置。本实验提供了平板拍照箱的设计文件（补充文件1，补充文件2），该装置专为拍摄此类培养皿而优化，包含照明和滤光片选项，可用于荧光菌落成像。
  4. 对平板进行成像。使用相机（见材料表）并设置手动模式，以确保各平板间曝光水平一致。建议采用较长焦距设置，以最小化透视畸变。使用遥控快门拍摄照片，以减少因相机抖动造成的模糊。
  5. 将图像传输至计算机，并重命名文件，文件名应包含实验名称、培养基类型、稀释倍数及其他相关细节。某些操作系统（见材料表）在文件管理器中提供了批量重命名功能，可通过右键点击所选文件实现。

5. 使用 Count-On-It 套件进行自动菌落计数（补充文件 3）

  1. 使用 ImageJ 的 Croptacular 插件（补充代码文件 2）对图像进行裁剪。该插件可将图像划分为有序的子区域阵列（例如，96 孔板为 8 × 12）。各个子区域将被单独计数。
    注意：用于计数圆形培养皿的另一个插件 Circus 在 补充代码文件 3 Circus_.ijm 中有描述。
    1. 将需要进行定量分析的图像整理到一个文件夹中。选择能够区分不同培养皿的文件名，因为这些文件名将成为每组计数结果的列标题。在该文件夹内，创建名为 "cropped" 和 "receipts" 的子文件夹。
    2. 启动 Croptacular， 然后点击 OK 开始裁剪。
      注意：默认设置已显示，通常已足够使用。但根据图像分辨率、光照条件、斑点大小等因素，可能需要调整基础参数。
    3. 如果图像已经对齐，直接按 空格键 即可。否则，沿应变为水平的一条边缘绘制一条直线以校正图像方向。若图像仍未对齐，可多次重绘该直线直至图像对齐。
    4. 接下来，绘制需要计数区域的边界框。调整其大小和比例，确保所有斑点均位于各自的孔位内。将光标拖动至边界框外可刷新网格。当网格显示合适时，按 空格键。
    5. 确保下一张图像会自动旋转至与第一张相同的角度；插件假定所有照片的朝向一致。若确实如此，请按 空格键 继续。否则，需如前所述重新校正图像。网格也会沿用上一张图像的位置；必要时进行调整，然后按 空格键。
  2. 使用提供的 ImageJ 插件 Count-On-It: Gridiron 对培养皿上的菌落进行计数（补充代码文件 4）。有关安装和使用该插件的详细说明包含在 补充文件 3 中。
    1. 启动 Count-On-It > Gridiron。 使用与 Croptacular 相同的网格设置。用户可批量处理整个文件夹、分析单张图像，或从当前图像开始处理。
    2. 根据像素强度的上限和下限值设置阈值。在确保所有菌落均被选中的前提下，尽可能严格地设定阈值。理想情况下，被选中的菌落之间应留有一定空间，但软件具备一定程度的斑点分割能力。当阈值设置满意后，在 "Action Required" 对话框中点击 OK。
    3. 为检查结果，可放大图像并仔细查看菌落计数。点击取消将中止插件运行。点击 OK 继续。
    4. 在第一张图像上，应提供继续或返回设置菜单的选项，例如用于更改最小菌落尺寸。若要继续批量处理，请点击 OK。然后选择一个文件夹以保存收据和结果表格。可使用 "receipts" 文件夹，或创建新文件夹。
    5. 处理完第一张图像后，后续图像将默认采用与之前相同的阈值设置。点击 OK 使用这些设置，或进行调整。如果照片一致性良好且设置准确，请在 "Action Required" 对话框中点击 OK。
      注意：当批量处理中的所有图像完成后，结果表格将自动保存在与收据相同的文件夹中。
    6. 检查软件生成的计数收据，并手动修正任何计数错误。ImageJ 插件在统计上是准确的，但仍可能出现错误。需审阅收据以检查异常值并识别误计数。软件会将 CFU 数据保存为 .csv 文件，与收据位于同一文件夹中。
  3. 使用用户偏好的软件对数据进行分析。

结果

使用定植实验以96孔板格式对数百只果蝇个体进行CFU计数
为了了解大量果蝇个体微生物组的组成，采用配套方案测定CFU，从而可鉴定出存在的菌种、定植果蝇的百分比以及每只果蝇体内细菌的绝对丰度。个体间微生物组组成存在显著差异的原因目前尚不明确，而对定植的统计分布进行量化有助于研究这种变异36,37。为了获得足够数量的生物学重复，开发了一种高通量流程，用于通过CFU计数对大量个体果蝇中的微生物丰度进行定量（图1A）。

CFU 的最终定量结果可能受到果蝇在分析前处理方式的影响，例如表面灭菌、摄取细菌后的时间以及肠道中短暂性细菌的清除等因素。首先，针对Drosophila的共生细菌种类L. plantarum（Lp；参见 Obadia 等人36中的Lp菌株 WF），果蝇被喂食约 ~105 CFU 的Lp，并以每管25只果蝇的密度进行群体饲养。这些果蝇要么在同一管中持续饲养3天，要么每天转移（Transferred）至新鲜的无菌食物中（图1B）。未转移的果蝇随后被分为两组：一组用乙醇清洗以去除表面细菌（Washed），另一组则不进行清洗（Unwashed）。清洗处理导致所测总CFU数量出现非显著性降低（图1B），表明在这些高度受控的接种条件下，果蝇体表在3天内不会被细菌显著定植。其他组的果蝇每天被转移至新鲜食物中，以减少细菌在食物表面生长导致的累积（Transferred）；此外，还有一组在取样前4小时转移至新鲜食物中（Post-Transferred），另一组则在取样前4小时被置于仅含无菌琼脂-水的管中（Cleared），以允许短暂摄入的微生物从肠道中清除。除乙醇表面清洗外，其余每一步处理均显著降低了果蝇体内CFU的数量，从而实现了更严格的定植水平测量。在测量前4小时转移至无菌食物（Post-Transferred）或琼脂-水（Cleared）所产生的效应无显著差异，表明在测量前4小时转移至无菌环境可有效降低细菌负荷。该结果支持如下解释：果蝇肠道中部分细菌为短暂存在，而另一些则更为稳定地定植35。Lp的数量在经过清除处理的果蝇中为每只1 × 104.3 CFU，而在未清洗果蝇中为每只1 × 104.9 CFU（n = 724 只果蝇）。

接下来，使用相同的方法进行了检测 Acetobacter indonesiensis (Ai），一种定植于果蝇肠道的革兰氏阴性菌（图1C；参见菌株 Ai Obadia 等人研究中的 SB00336). 与……相同 Lp-定植的果蝇中，表面消毒对CFU数量的减少无显著影响。同样，每日转移至无菌食物可显著降低细菌载量，而在匀浆前转移至无菌条件4小时可进一步减少细菌载量。细菌丰度的 Ai 范围为 1 × 104.7 清除果蝇中的菌落形成单位/果蝇降至 1 x 105.0 未清洗果蝇中的菌落形成单位（CFUs）（n = 528 只果蝇）。因此，肠道细菌的准确定量取决于转移频率，包括转移当天的频率。用乙醇清洗去除外部细菌负载的影响无显著性，但在不同细菌菌株或不同培养条件下，可能会观察到更显著的效应。这些因素应在实验中加以控制。

还测试了均质化方法对CFU计数的潜在影响。使用含0.5 µm玻璃珠的珠磨机在100 µL PBS中对果蝇进行均质化处理，该过程可能降低细菌细胞的存活率。首先，在PBS中制备来自培养物的Lp细菌悬液，并进行平板培养以计数CFU作为阳性对照。将相同的培养物分别放入珠磨板中：(i) 加珠均质化，(ii) 加珠并加入无菌果蝇均质化，或(iii) 在无珠的PBS中均质化（图1D）。当存在果蝇时，加珠均质化对溶液中活菌数量无显著影响；而在无果蝇条件下对细菌进行均质化则显著杀死了大量细菌细胞。在无珠的PBS中均质化也显著降低了活菌数量。类似地，Ai在有果蝇存在时经均质化后其存活率得以保持，而在无果蝇条件下均质化则导致溶液中活菌数量减少（图1E）。这些结果表明，果蝇组织可在均质化过程中保护细菌免受玻璃珠的破坏作用。然而，图1D和图1E中的实验是在每孔超过108 CFU的条件下进行的。实际操作中发现，当每孔细胞数约为106或更低时，即使在无果蝇的情况下使用玻璃珠，细胞损失也很小。在珠磨过程中途将板置于冰上冷却也有助于提高细胞存活率。这些结果的意义在于提醒读者注意这些潜在问题，并针对其具体应用场景设计适当的对照实验。

96孔板点样法用于高通量CFU定量的准确性
由于目标是测量数百至数千只单个果蝇的CFU丰度，传统的涂布平板方法在时间和材料消耗上均过于耗时费力。点样法是一种有效且高效的CFU培养与计数方法19,31。该点样法使用96通道移液器将2 µL细菌悬液点加到矩形托盘培养基上（图2A）。每个点代表单个样品的细菌载量，因此一块平板即可分析96只果蝇（图2B）。通过使用完全相同的0.0001 OD Lp菌液对两种方法进行接种，比较点样法与传统涂布法的准确性。菌液在PBS中进行5次两倍系列稀释。作为直接对比，将50 µL接种液涂布于圆形平板，或将2 µL菌液点样于矩形MRS平板。随后将平板在30 °C下培养至菌落可计数。根据各稀释度获得的CFU计数结果，反推原始菌液浓度并进行比较（图2C）。以含50–500 CFU的圆形平板作为对照。高通量点样法与传统圆形平板法之间未观察到显著差异。

由于菌落数量密度可能影响其生长和定量，因此测试了CFU密度对最终计数结果的影响。每个点上含有2至25个菌落的点与传统圆形平板法相比，在最终计数上无显著差异（图2C）。平均每个点含有35个菌落的样本，其结果略低于对照组涂布平板（图2C；p = 0.0017）。对各个点的显微照片进行仔细观察表明，这种偏差是由于高密度点中菌落相互重叠所致。基于每个点平均11个菌落的点所获得的测量结果，其浓度最接近涂布平板法所得结果（图2C；涂布平板：均值 = 1 × 104.4 CFUs；SD = 0.086 vs. 每点平均11个菌落的点：均值 = 1 × 104.4 CFUs；SD = 0.12，p = 0.42，Welch's t检验）。

使用配备白光或荧光的专用摄影平台生成用于定量分析的高质量图像
高通量点样实验自然会产生大量待分析区域，需进行准确计数。高质量照片可用于记录实验数据并辅助菌落形成单位（CFU）的计数。本研究利用市售材料开发了一种稳定且操作简便的摄影平台（图3A）。数码相机固定于定制的光照箱（称为FluoroBox）顶部的支架上，镜头垂直向下对准培养皿中心。可根据需要通过滤光片滑轨在镜头前安装彩色发射滤光片。遮光罩可阻挡来自下方LED灯带的直射光，防止镜头眩光。LED灯带从侧面而非上方照射培养皿，以避免皿面反光。除白光外，还使用单色蓝色和绿色LED分别激发绿色和红色荧光蛋白。培养皿由抽屉上的培养皿固定器固定，抽屉配备滑轨，便于培养皿的插入。完整设计文件详见补充文件1和补充文件2。

使用白光LED和数码相机拍摄了Lp菌落的点样板照片，以辅助菌落计数并区分不同的颜色和形态（图3B）。为验证照明强度的均匀性，测量了平板照片中不同区域的琼脂背景强度（图3C）。为了证明菌落可与背景清晰区分，测量了平板不同位置上10个不同菌落直径方向的强度，发现其强度比背景高约~300%（图3C）。该平板接种了携带表达mCherry荧光蛋白质粒的Lp，以及部分不含该质粒的Lp，因此菌落表现为mCherry阳性或mCherry阴性。为区分这两类菌落，使用同一台相机配合绿色LED光（515–525 nm）和红色滤光片（Tiffen #29）对平板进行拍摄，使mCherry阳性菌落产生荧光（图3D）。通过测量一组菌落样本（n = 10）的强度，量化了mCherry阳性与mCherry阴性菌落之间的强度差异，结果显示mCherry阳性菌落的强度比mCherry阴性菌落高约1,000%（图3E）。对于表达GFP的Ai菌落和不表达荧光的Ai菌落，则使用蓝色LED光（465–475 nm）和绿色滤光片（Tiffen #58）进行拍摄（图3F）。GFP阳性菌落的强度比GFP阴性菌落高200%（图3G）。

使用定制 ImageJ 插件 Count-On-It 对点样平板上的菌落形成单位（CFU）进行自动化计数
仅依靠照片有助于菌落计数（例如用于数据存储、数据共享、放大查看、标记叠加图、分离颜色等）。然而，手动计数并整理数百个点样结果的过程可能繁琐、耗时，并且不同操作者之间的最终计数可能存在差异。为了加快计数速度并提高计数结果的可重复性与标准化水平，开发了一款专用的 ImageJ 插件，名为 Count-On-It（图 4A）。该插件可实现对琼脂平板上菌落形成单位（CFU）的准确半自动计数。用户首先使用附加插件 Croptacular 对图像进行裁剪和校正，以完成计数前的图像准备。照片可选择性地进行批量处理，并可针对每块平板调整阈值。插件还提供多种其他选项，帮助用户提高平板计数的准确性，包括调节光波长（RGB 图像）、设定菌落大小范围（以像素为单位）、调整最大长宽比，以及自定义活动选择网格的尺寸。Count-On-It 输出一个结果表格，每块平板以一列 CFU 计数值表示。同时生成一张带叠加标记的照片回执，用于直观记录其计数结果，并辅助进行人工误差校正（图 4B）。尽管仍可能出现误差，但当将人工计数的菌落数与使用该插件计数的结果进行比较时（图 4C），两者总体上具有良好的一致性，手动计数与自动计数之间的线性回归斜率为 0.95，准确率超过 90%（R2 = 0.93），不过当菌落数量超过 20 时，误差有所增加。

Count-On-It 还可结合 FluoroBox 的荧光功能，用于分别计数荧光菌落。软件插件与人工计数 mCherry 阳性菌落的结果相比，R2 为 0.92（图 4D 和 图 4E）。类似地，软件插件与人工计数 GFP 阳性菌落的结果相比，R2 为 0.90（图 4F 和 图 4G）。在同一份样品中可区分荧光与非荧光菌落，且可进一步利用菌落的大小和形状来区分不同的亚群（图 4H–K）。拍摄的照片记录可提供依据，使用户能够快速核对计数的准确性，并手动修正错误。在 图 4C、E、G、I、K 中，未使用照片记录来优化计数准确性，以便读者查看该方法的原始输出结果。例如 图 4G 中，人工计数为 1，而自动计数结果为 21，此类情况可通过照片记录快速发现。本例中，培养皿边缘的反光形成了被误识别为菌落的光斑。针对每种应用情况，在进行高通量计数前，均需确定软件插件的最佳设置参数。

果蝇微生物组实验；示意图显示匀浆、稀释、孵育；结果：菌落形成单位计数。
图 1：定植实验采用 96 孔板格式，用于测量数百只个体果蝇中的菌落形成单位（CFU）。（A）定植实验及高通量定量方法的示意图，方法详见本实验方案部分。（B）采用高通量 CFU 定量法，在不同条件下测定果蝇体内Lactiplantibacillus plantarum（Lp）的丰度。果蝇在相同培养瓶中饲养 3 天后，直接匀浆并涂板（未清洗），或在涂板前用乙醇清洗（清洗），或每日清洗并转移（转移），或每日转移并在涂板前置于无菌食物中（转移后），或在仅含水的培养瓶中放置 4 小时（清除）（总计 n = 724 只果蝇，3 个生物学重复，每处理组约 72 只果蝇）。（C）使用Acetobacter indonesiensis（Ai）重复与（B）相同的实验（n = 528 只果蝇）。（D）将Lp菌悬液用 PBS 配制后，直接涂板计数 CFU，或先经珠磨匀浆，或与无菌（GF）果蝇共同珠磨，或仅在珠磨仪上振荡但不加珠或果蝇（n = 236 个样品孔）。（E）Ai在匀浆后的存活率以与（D）相同的方式检测（n = 282 个样品孔）。图（B–E）的统计学显著性通过 Kruskal-Wallis 检验计算，随后进行两两 Wilcoxon 秩和检验，并采用 Bonferroni 多重比较校正。方框表示四分位距，横线表示中位数，须线表示全距。请点击此处查看此图的放大版本。

菌落定量：机器人装置、带有菌落的培养皿、CFU/ml 结果的统计图。
图 2：96 孔板点样法用于高通量 CFU 定量的准确性。（A）使用 96 通道移液器在矩形托盘板中制备的培养基上点加 2 µL 样品。（B）MRS 琼脂培养板上 Lp 菌落的 96 个点样。（C）基于传统圆形平板（n = 24 个平板）的 CFU 计数所得 Lp 菌悬液浓度，与基于点样平板（n = 680 个点样）的 CFU 计数所得浓度的比较；点样平板经系列稀释，并按每个点样的平均菌落数分组（三个重复平板中，每个单一稀释倍数约计数 48 个点样）。每个数据点代表每点样确切的菌落数，每列代表该稀释倍数下的平均菌落数。水平虚线表示点样菌液的理论 CFU 数。绿色轮廓的数据点表示传统圆形平板的计数结果。红色实心数据点表示每 2 µL 点样 11 个 CFU 的最佳菌落密度。统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）计算，采用 Bonferroni 多重比较校正法，将各列均值与涂布平板对照列均值进行比较。方框表示四分位距，横线表示中位数，须线表示总范围。**p < 0.01。ns = 无显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

使用白光或荧光对平板进行定量成像的荧光显微镜装置示意图及菌落强度图。
图 3：摄影平台利用白光或荧光生成可用于定量分析的平板图像。（A）FluoroBox 设计的总体结构示意图。（B）使用白光拍摄的 Lp 菌落点板照片。（C）单个菌落在白光下的强度分布图，与背景（BKG）强度进行比较（n = 10 个菌落，虚线表示标准差）。（D）与（B）相同的点板，使用单色绿光照射并配合红色滤光片，筛选 mCherry 阳性的 Lp 菌落。（E）单个菌落的强度分布图，显示表达与不表达 mCherry 的菌落之间的差异。（F）含有 Ai 菌落的点板照片，其中部分菌落带有 GFP 标记。（G）单个菌落的强度分布图，显示 GFP 阴性与 GFP 阳性菌落之间的差异。E、F、G：每组曲线图包含 n = 10 个菌落。菌落直径约为 1.5 mm。虚线表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的高清版本。

菌落计数；自动分析与手动计数；图表结果；高通量设置。
图 4：通过 Count-On-It ImageJ 插件对点样平板进行准确计数。（A）插件设置窗口的截图。（B）该插件生成一份收据，用于记录计数过程并辅助错误校正。插图：叠加显示每个点样区域的菌落计数结果；黄色轮廓表示计为单个菌落，红色表示计为多个菌落。（C）使用白光图像时，手动计数与插件自动计数所得菌落数量的对比图，图中每个数据点代表一个单独的点样区域的手动或自动计数结果（拟合斜率 = 0.95，青色线；1:1 线为红色虚线；R2 = 0.93，Pearson 相关系数，p < 0.0001）。（D）使用拍照箱的荧光功能选择 mCherry 阳性菌落时，插件生成的照片收据图像。（E）使用红色荧光时，手动与自动方法对 mCherry 阳性菌落计数结果的对比图（拟合斜率 = 1.1，青色线；1:1 线为红色虚线；R2 = 0.92，Pearson 相关系数，p < 0.0001）。请注意，E、G、I、K 的分析收据尚未用于校正异常值和误差。（F）使用拍照箱的绿色荧光功能并结合插件中绿色通道的选择，获得 GFP 阳性菌落时的插件照片收据图像。（G）使用绿色荧光照明时，手动与自动方法对 GFP 阳性菌落计数结果的对比图（拟合斜率 = 1.1，青色线；1:1 线为红色虚线；R2 = 0.90，Pearson 相关系数，p < 0.0001）。（H）在混合菌落形态中，通过插件设置较高的荧光阈值筛选出 mCherry 阳性菌落。（I）使用红色荧光照明时，手动与自动方法对 mCherry 阳性菌落计数结果的对比图（拟合斜率 = 0.99；R2 = 0.91，Pearson 相关系数，p < 0.0001）。（J）在混合菌落形态中，通过设置较低的荧光阈值筛选出 mCherry 阴性菌落。（K）当设定强度阈值以选择非荧光菌落时，手动与自动方法对 mCherry 阴性菌落计数结果的对比图（拟合斜率 = 1.1；R2 = 0.85，Pearson 相关系数，p < 0.0001）。请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件1：FluoroBox组装说明。 本文件逐步指导读者完成视频中所用可控光照箱的构建。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：FluoroBox 亚克力激光切割文件。 该文件提供了一个切割模板，用于激光切割受控照明箱的亚克力部件。该文件可直接发送给亚克力激光切割供应商。参见材料表中本方案所用的供应商信息。请点击此处下载该文件。

补充文件3：软件使用说明。 本文件逐步指导读者完成本实验方案所提供的 Croptacular 和 Count-On-It 软件的安装与使用。请点击此处下载该文件。

补充编码文件 1：用于珠粒测量托盘的 3D 打印代码（S1-bead-measurer.stl）。请点击此处下载该文件。

补充代码文件 2：矩形板照片裁剪 ImageJ 插件（Croptacular_.ijm）。请点击此处下载该文件

补充代码文件3：圆形培养皿照片裁剪插件 (Circus_.ijm)。请点击此处下载该文件。

补充代码文件 4：矩形 96 孔板斑点计数插件 (Gridiron_.ijm)。请点击此处下载该文件。

讨论

本文所展示的详细技术能够实现 >菌落形成单位（CFU）计数实验中可评估样本数量增加100倍。该技术推动了微生物组实验现有方法的进步 果蝇12,35,36 采用96孔板形式对单只果蝇进行检测。此外，该方法应用了更为高效的点样接种技术19,31 以及结合摄影和菌落计数平台的自动化工作流程。该方法的重要性在于 黑腹果蝇 将实验标准化为96孔板格式，可实现大量生物学重复的同步处理，并通过自动化完成菌落形成单位（CFUs）的高通量定量。

96孔平台表明，增加传代频率以及 "透明化" 短暂性细菌的存在会导致样本间平均丰度及变异性的显著降低（图1B,C)，表明该改进后方案的严谨性。共饲养果蝇的一个局限性在于果蝇之间可能发生细菌的水平转移。一种建议的解决方案是将果蝇单独饲养于96孔板中，例如Whole Animal Feeding Flat38.

尽管用乙醇清洗果蝇时未观察到细菌载量显著减少，但这些果蝇仅在外界细菌存在条件下饲养了3天。更长时间的饲养可能使细菌载量进一步积累39。因此，仍建议使用乙醇进行清洗。

将果蝇转移至96孔板是建立实验流程的关键第一步（图1A）。果蝇清洗后，需逐个分配到各孔中。此阶段使用板图有助于记录每个孔中的实验条件，并添加备注，例如"果蝇丢失"。匀浆是另一个关键步骤，需注意若干重要事项。当细菌与果蝇共存时，其可在匀浆过程中存活（图1D、E），推测当细菌位于果蝇肠道内时，该原理同样适用。然而，若仅将细菌置于珠磨板中进行匀浆，细菌则会被杀死，表明在某些情况下匀浆过程可导致细菌细胞死亡；若研究中涉及对解剖所得肠道进行匀浆，则此局限性需特别关注。值得注意的是，匀浆过程中菌落形成单位（CFU）的损失程度取决于样品中CFU的数量，当每孔使用约105 CFU时，损失最小。进一步减少CFU损失的方法是在匀浆进行到一半时暂停，并将板置于冰上冷却。

根据对照实验，本方案中匀浆处理时间为5分钟，实验中将已知数量的菌落形成单位（CFUs）与无菌果蝇混合，该时间在经验上适用于果蝇细菌的处理。较短的振荡时间会导致较大的果蝇组织碎片残留，干扰移液操作；而显著延长的匀浆时间（约10分钟）则会使CFU计数的变异性增加。观察发现，由于锥形板孔体积较小且形状倾斜，与圆柱形2 mL离心管相比，其珠磨破碎效率有所降低。该通用方法存在多种可调整的参数，包括所用的细菌菌株、珠磨容器、研磨珠类型以及果蝇基因型等。不同用户需根据自身实验条件使用阳性对照来确立适宜的实验方案。

点板法以特定方式进行：将 L. plantarum WF 在 PBS 中进行 1:2 稀释后，点样至 MRS 平板上，并在 30 °C 下培养 2 天（若需获得更小的菌落大小，可采用较短的培养时间）。该方法需要前期投入一些设备，主要是珠磨机和 96 通道移液器（图 2A），这两者对于稀释系列和点板操作均是必需的。然而，也存在成本较低的替代方案，例如使用带槽针头的 96 孔板复制器。稀释系列是一个关键步骤，直接影响 CFU 计数结果的准确性。就可能的失败模式而言，移液吸头可能被果蝇残体或玻璃珠堵塞，或吸头未能与移液器正确密封，或其他原因导致失效。所有这些问题都会导致受影响孔中的菌落计数偏低，应加以监测。在稀释系列的每一步中充分混匀也至关重要。每次稀释应通过将平板置于平板振荡器上振荡，或通过上下吹打 15–20 次进行充分混匀，后者还可起到冲洗吸头的作用。通过从最稀释的平板向最浓的平板依次点样，可实现吸头在整个稀释系列中的重复使用。采用 1:2 稀释时，菌落计数在 2–25 个菌落范围内准确，覆盖一个数量级（图 2C）。因此，使用 1:10 稀释可节省时间和材料。另一个可利用的变量是培养时间，可通过调整培养时间以产生更小的菌落，从而防止相邻菌落融合，扩大可计数点的范围。

拍摄平板的高质量照片至关重要，因为照片将作为分析菌落形成单位（CFUs）的原始数据，并可无限期存档。FluoroBox 设计用于拍摄光照强度均匀的平板照片，从而最大限度减少琼脂表面的反光。此外，该设备可通过单色 LED 光源和彩色摄影滤光片选择性地拍摄荧光菌落图3A）。构建类似FluoroBox的装置，通过控制光照和相机设置，可显著提高菌落形成单位（CFU）图像的可重复性，这对于自动化分析至关重要。利用所拍摄的照片，可分析菌落形态、荧光强度以及时间或密度对菌落生长的影响等多种特性。若不使用荧光细菌，照片拍摄箱可省去彩色滤光片和单色光源，从而降低成本和复杂性。若实验室使用不同的荧光染料，可替换相应的激发光源和发射滤光片。通过应用程序将相机连接至平板电脑的WiFi功能，不仅可利用自动快门功能避免抖动，还便于数据传输。图像可通过无线文件传输软件先传至平板电脑，再传至笔记本电脑。具备上述功能的推荐相机已在下文列出 材料表.

Count-On-It 是一个用 ImageJ 编写的插件。该自动菌落形成单位（CFU）计数软件将平板图像分割为均匀的 96 孔网格，统计每个网格单元中的菌落，并将结果批量导出为一个简单的电子表格。由于点阵在平板上的位置以及拍摄照片时的位置总会存在差异，用户必须使用 Croptacular 插件手动调整网格以匹配照片。这也有助于排除平板边缘附近存在反光的区域。设定阈值是获得最准确 CFU 计数的关键。如果阈值设得过高，菌落会合并；如果阈值设得过低，菌落则会被排除。设定阈值后，宏程序会应用高斯模糊以柔化边缘并减少混叠，使用分水岭滤波器分离重叠的菌落，最后通过分析颗粒来计数菌落斑点。

有时，某个特定区域的菌落数量过于密集。Count-On-It 提供了一种处理方法。为了估算网格单元中部分融合菌落的菌落数量，首先计算整个平板上圆形菌落的平均面积，记为 Cavg。然后将菌落 A1 的面积除以圆形菌落的平均面积，即 A1/Cavg。 将所得数值四舍五入至最接近的整数，即为该菌落团块中所含菌落数量的估计值。这一功能是阈值会影响计数结果的原因之一：阈值对融合菌落的划分方式不同，会导致单个菌落的平均面积与融合菌落面积之间的相对比例发生变化。

所介绍的方法存在若干局限性。其中包括需要使用能够从96孔板中精确分配液体培养基的设备。此类设备（如96通道移液器或槽式复制针具）的购置成本可达数千美元。虽有较便宜的替代方案，但其准确性较低。自动计数 通过 Count-On-It 也存在一些局限性。例如，若混合菌群中的两种菌落类型仅依据大小进行区分，则斑点计数法无法将菌落正确归类。在此情况下，含有斑点的菌落需从计数中剔除。基于菌落形态进行进一步区分将是该方法有价值的扩展方向，但目前尚未实现。使用选择性培养基，包括菌株特异性营养成分和抗生素，可简化对复杂图像分析的需求。

维持果蝇培养 在96孔板中进行实验可增加单次实验中可检测的样本数量和条件数量，并有助于实现高通量筛选 果蝇-细菌互作表型。我们设想，通过使用选择性培养基，该方法可进一步扩展，以区分复杂混合物中的多种细菌菌株。该方法不仅限于果蝇微生物组的研究。菌落形成单位（CFU）的定量在微生物学的许多应用中十分常见，从饮用水中大肠菌群计数到病原体鉴定均有涉及。本文所介绍的CFU平板检测系统支持高通量筛选，以及结果的自动化采集、处理、存储和输出。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Kerwyn Casey Huang 博士、Andrés Aranda-Díaz 博士、Ted Cooper 以及 Ludington 实验室的成员为本实验方案的开发提供了宝贵的建议。本研究获得了美国国家科学基金会（NSF）IOS 项目 2032985 号、美国国立卫生研究院（NIH）DP5OD017851 项目、加拿大卡内基机构资助项目以及卡内基科学研究所基金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>珠磨破碎与点种平板
果蝇培养管杰内西32-121可高压灭菌的
果蝇培养瓶塞杰内西59-201可高压灭菌的
手持涂抹器3M3M PA1
热封机Eppendorf5390
Mini-Beadbeater 96BioSpec1001
Mini-BeadBeater 玻璃珠，0.5 mmBioSpec 11079105
MPS 1000 微型PCR板离心机LabnetLI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 半自动移液器Mettler Toledo30296705可选用成本较低的替代方案，包括 VP Scientific 公司的带槽 96 孔针工具
TempPlate 半裙边 96 孔 PCR 板，直边，本色美国科学1402-9220必须使用聚丙烯材质以适用于热封仪
热封压合箔4titude4ti-0591保持无菌
托盘板，128 × 85 mm，聚苯乙烯，无菌SPL Life Sciences31001用于制备矩形琼脂平板
<强>光盒构建
¼”-20 × ½” 螺栓（X2）亚马逊ASIN: B07BP1WR3H安装相机支架，品牌不限，任何1/4"-20 1/2" 螺栓起作用了。
¼”-20 × ½” 连接器螺母 亚马逊UPC：799862376780又称帽形螺母或连接螺栓。用于将橡皮筋固定在板架上。品牌不限。
¼”-20 × ¾” 螺栓（X3）亚马逊ASIN: B003QZSZY4对于培养皿架，品牌不重要。
1/8” x ½” 洗板机亚马逊UPC: 611982484599用于固定盒体外部盖螺母的垫圈。品牌不限。安装前喷涂黑色油漆，以与亚克力材料协调一致。
<强>18号导线 双导体电源线 <强>18号规格电源线 – 10英尺Superbrightleds.comWP18-2
22-10 AWG 红色接线帽 - WN-R2210 – <强>数量 4Superbrightleds.comWN-R2210
22-18 AWG 3/16英寸公制雌型快速连接端子 - 22-18 AWG – <强>数量 3Superbrightleds.comSCFP-2218
4" 免焊接夹式跳线连接器 - 8毫米单色LED灯带 <强>数量 3Superbrightleds.comSBL-MA2P-8-2
4" 免焊接夹式尾线适配器 - 8毫米单色LED灯带 – <强>数量 3Superbrightleds.comSBL-MA2P-8-1 
6” 抽屉把手亚马逊ASIN: B07Z331P99任何抽屉把手均可使用。
6” 抽屉滑轨BtibpseUPC：712243424979修剪抽屉滑轨上的软闭合橡胶塞。
8-32 × ½” 顶盖螺母（x4）亚马逊ASIN: B00HYLZB98在盒子外侧安装抽屉滑轨螺栓。品牌不限。使用尼龙材质以避免划伤亚克力。安装前喷涂黑色漆，使其与亚克力颜色协调。
8-32 × ½” 尼龙螺栓（x4）亚马逊ASIN: B07KX9T7NF用于安装抽屉滑轨。品牌不限，任何符合规格的螺栓或机螺钉均可使用。尼龙材质不会损伤亚克力板，并可将螺栓切割至与螺母齐平。安装前喷涂黑色油漆，以与亚克力板颜色协调。
丙烯酸胶水SCIGRIPEan: 7844908489337SCIGRIP Weld-On #4 粘合剂（品脱装）及带针头的 Weld-On 涂布瓶
黑色扎带 - 10 个装 - 4 英寸长 Superbrightleds.comCT-B04-10
相机L型支架WLPREOE，Vikerer，无品牌ASIN: B09X46YKQZ支架应 "反转的" 从其预定构型偏移，使相机位于 "外部" L 的。有些托槽分为两个部件并允许这种交替配置，而有些则不允许，因此您需要选择可以翻转的托槽。此外，还应具备 1/4" 用于固定的孔。WLPREOE、Vikerer、无品牌。亚马逊序列识别号仅作示例。
佳能 T 系列相机，用于有线连接选项 OR佳能、松下、索尼、尼康等1894C002佳能Ti系列相机是一个不错的选择，可连接电脑使用。建议搭配18-55mm标准套机镜头。推荐选择佳能T5至T7（当前型号）的二手相机。
定制长度单色LED灯带 - Eco系列灯带 - 24V - IP20 - 250 流明/英尺 - 蓝色 - 2米Superbrightleds.comSTN-BBLU-B6A-08C1M-24V
定制长度单色LED灯带 - Eco系列灯带 - 24V - IP20 - 250 流明/英尺 - 绿色 – 2米Superbrightleds.comSTN-BGRE-B6A-08C1M-24V
定制长度单色LED灯带 - Eco系列灯带 - 24V - IP20 - 250 流明/英尺 - 自然白光 4000K – 2米 Superbrightleds.comSTN-A40K80-B6A-08C1M-24V
钻具 ¼”, 1/8” 钻头黑色 & Decker‎BDCDD12PK品牌不重要。 
哑光黑色喷漆，  2X 超哑光Rustoleum331182将所有内部表面涂成哑光黑色。品牌不限。
激光切割亚克力墙Big Blue Sawwww.bigbluesaw.com使用附带的 PDF 文件，删除顶板上除相机所需孔洞外的所有镂空部分 
Mean Well LED开关电源 - LPV系列 20-100W单路输出LED电源 - 24V直流 - 20瓦 Superbrightleds.comLPV-20-24
Panasonic ZS100，用于连接手机、平板电脑或计算机的 Wi-Fi 功能佳能、松下、索尼、尼康等DMC-ZS100K松下相机可通过无线方式连接至计算机，以实现数据传输和远程快门控制。二手设备亦可良好使用。
快速释放板Neewer 铝合金 50 毫米快速释放板 QR 夹具，带 3/8 英寸和 1/4 英寸螺纹ASIN: B07417F21D将此添加到支架上，以便于拆卸相机以更换彩色滤光片。亚马逊序列识别号仅作示例。
橡皮筋，各种尺寸BAZIC 产品Alliance Rubber 26649橡皮筋套在培养皿架上。品牌不限。
螺钉/粘合式扎带安装底座 - 3/4 英寸底座 – <强>数量 4Superbrightleds.comCTMB-20
SPST 圆形摇杆开关 - 无LED – <强>数量 3Superbrightleds.comRRS-SP
Tiffen 29 滤光片（红色）72 毫米 Tiffen72R29
Tiffen 58 滤光片（绿色）72 毫米Tiffen7258
<强>软件
ImageJ64https://imagej.net/downloadsN/A免费。引用即可：Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … 卡多纳，A.（2012）。Fiji：一个用于生物图像分析的开源平台。《自然方法》，9(7)，676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX苹果N/A在 Finder 中具有实用的批量重命名功能，可对一组照片进行重命名，以便在 Count-on-it 中进行组织和分析。
UnixBSDN/A64 位
Windows微软N/A64 位

参考文献

  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
  3. Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  5. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  6. Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740(2021).
  7. D'hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892(2018).
  8. Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398(2020).
  9. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272(2011).
  10. Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710(2018).
  11. Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
  12. Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219(2016).
  13. Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
  14. Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
  15. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  16. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110(2018).
  17. Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
  18. Ryu, J. -H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  19. Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
  20. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  21. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
  22. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  23. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6(2014).
  24. Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
  28. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
  29. Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109(2017).
  30. Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
  31. Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
  32. Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163(2017).
  33. Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
  34. Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
  35. Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
  36. Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
  37. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633(2017).
  38. Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
  39. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).

重印与许可

标签

ImageJ
96孔板格式下的快速菌落形成单位计数应用于 黑腹果蝇 微生物组
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。