שיטה זו מכמתת את השפע המיקרוביאלי באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות ליחידות יוצרות מושבות לוחות (CFUs) ומיושמת על המיקרוביום Drosophila בדגימות הומוגניות של זבובים שלמים. יחידות CFU נספרות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המסופקת כאן.
המעיים של בעלי חיים מיושבים על ידי מיקרובים קומנסליים, שמשפיעים על התפתחות המארח, בריאותם והתנהגותם. כימות מדויק של הקולוניזציה חיוני לחקר יחסי הגומלין המורכבים בין המארח למיקרוב הן כדי לאמת את ההרכב המיקרוביאלי והן כדי לחקור את השפעותיו. Drosophila melanogaster, בעל מגוון מיקרוביאלי מקומי נמוך וחסכוני לגידול עם הרכב מיקרוביאלי מוגדר, התגלה כאורגניזם מודל לחקר המיקרוביום של המעיים. ניתוח המיקרוביום של אורגניזם בודד דורש זיהוי של אילו מינים מיקרוביאליים נמצאים וכימות השפע המוחלט שלהם. מאמר זה מציג שיטה לניתוח של מספר רב של מיקרוביום זבוב בודד. הזבובים מוכנים בלוחות של 96 בארות, מה שמאפשר לטפל במספר רב של דגימות בבת אחת. ניתן לכמת את השפע המיקרוביאלי על ידי ציפוי של עד 96 הומוגנטים של זבובים שלמים על צלחת אגר אחת במערך של כתמים, ולאחר מכן ספירת היחידות היוצרות את המושבה (CFUs) הגדלות בכל נקודה. מערכת ציפוי זו משולבת עם פלטפורמת כימות CFU אוטומטית, המשלבת צילום של הלוחות, הבחנה של מושבות פלואורסצנטיות וספירה אוטומטית של המושבות באמצעות תוסף ImageJ. היתרונות הם ש-(1) שיטה זו רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים בין הטיפולים, (2) שיטת הציפוי הנקודתי מדויקת כמו שיטות הציפוי המסורתיות, ו-(3) תהליך הספירה האוטומטי מדויק ומהיר יותר מספירה ידנית. תהליך העבודה המוצג כאן מאפשר כימות בתפוקה גבוהה של יחידות CFU במספר רב של משכפלים וניתן ליישם אותו במערכות מחקר מיקרוביולוגיות אחרות, כולל מבחנה ומודלים אחרים של בעלי חיים קטנים.
הקשר בין המיקרוביוטה של המעיים לבין בעלי החיים המארחים שלהם נמצא יותר ויותר בחזית המחקרים הביולוגיים1, המראים כי הרכב המתח של המיקרוביום חשוב לפיזיולוגיה של המארח 2,3,4. קצב הגילוי הוגבל על ידי גורמים מבלבלים כגון שונות טבעית גבוהה בין אינדיבידואלים ומגוון גבוה של חיידקים מתיישבים 5,6,7. זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, התגלה כמודל מבטיח בזכות המיקרוביום בעל המגוון הנמוך הטבעי שלו, קלות הטיפול והגנטיקה החזקה של המארח 8,9,10,11. זבובים יכולים להיות נקיים מחיידקים ולשייך אותם מחדש למיקרוביוטה12 מוגדרת, והוכח כי הפלורה משפיעה על התכונות הפיזיולוגיות של הזבובים13,14. הפלורה המולדת מורכבת מקבוצה מוגבלת של חיידקים שכולם ניתנים לתרבות, וקרובי משפחה של אלה הם גם אנדוגניים למעיים של יונקים, כולל לקטובצילי, פרוטאובקטריה ואנטרוקוצ’י15.
חקר השפעת המיקרוביום על תכונות הפונדקאי דורש כימות של המיקרוביום הן מבחינת המינים הקיימים והן מבחינת השפע המוחלט שלהם16. הדרכים השולטות לניתוח המיקרוביום של הזבובים הן יחידות יוצרות מושבה (CFU) ספירות17, 16S rRNA גן אמפליקון9, ו- qPCR של הגן 16S rRNA18. ניתן להשיג ספירות CFU ללא ריאגנטים יקרים, והם מאשרים את הכדאיות של תאי החיידקים19. לטכניקות 16S הכוללות qPCR יש יתרונות בכך שניתן לברר זהויות טקסונומיות של מיקרובים ללא התחשבות בדרישות הגידול שלהם או במורפולוגיות של מושבות20.
במקרה שבו ניסויים משתמשים בזבובים עם מיקרוביום מוגדר של חיידקים ידועים (זבובים גנוטוביוטיים), לספירת CFU יש יתרונות מיוחדים על פני ריצוף21. ריצוף הוא יקר, ודורש מיצוי דנ”א, הכנת ספרייה מבוססת PCR וריצוף בתפוקה גבוהה כדי להשיג שפע יחסי22. בשל העלות הגבוהה, בדרך כלל יש לבצע שיטות ריצוף בתפוקה גבוהה בכמויות גדולות כדי להפחית את המחיר למדגם23. שיטות נוספות כגון qPCR נדרשות כדי להשיג שפע מוחלט16. לעומת זאת, ספירות CFU הן מהירות וזולות ונותנות את המספרים המוחלטים של תאים בני קיימא. Drosophila8 ומודלים אחרים של מיקרוביום קטן24, כולל התולעת, Caenorhabditis elegans 25,26, ודג הזברה הזחלי, Danio rerio, שגדל באופן גנוטוביוטי27, יש מגוון מוגבל של חיידקים, אשר ידועים מאפייני גדילה28. במקרים אלה, במיוחד עם בעלי חיים גנוטובוטיים, ספירת CFU יכולה להבדיל בין כל מיני החיידקים בתוך קהילות המעיים הרב-מיניות21,27,29. שיטות ספירת CFU בתפוקה גבוהה יותר ישפרו עוד יותר את העלות-תועלת והמהירות של מדידת הרכב המיקרוביום, וניתן יהיה ליישם אותן בניסויים רבים אחרים במיקרוביולוגיה.
ספירת CFUs על ידי ציפוי דילול סדרתי של תרחיף חיידקים על מדיית גידול מבוססת אגר היא שיטה סטנדרטית בכל תחום המיקרוביולוגיה. המושבות שגדלות על הלוחות נספרות ידנית. הדילולים מאפשרים לחוקר לבחור צפיפות מושבות הניתנת לספירה (למשל, ~100 יחידות יוצרות מושבה לכל צלחת), כלומר המושבות אינן גדלות זו לזו וניתן לספור אותן בפרק זמן סביר. רוב המיקרוביולוגים משתמשים למעשה באותה שיטת ספירת CFU שפותחה לפני 140 שנה במעבדתו של רוברט קוך, ועבור יישומים רבים, שיטה זו עדיין מספקת. עם זאת, מתעוררת בעיה כאשר מבקשים לכמת מספר רב של דגימות. דגימה בודדת עשויה לדרוש ציפוי של 1 עד 10 דילולים סדרתיים של הדגימה כדי לקבל יחידות CFU הניתנות לספירה, כך שניסויים הכוללים יותר מכמה עשרות דגימות הופכים למיסוי. שיטות שונות פותחו כדי להגביר את היעילות של ספירת CFU. ציפוי ספירלי אוטומטי מבטל את הצורך בדילולים סדרתיים30, מה שהופך רק צלחת אחת לנחוצה לספירת CFU אך מגדיל את הזמן לצלחת הדגימה. זיהוי דילול טורי של צלחת יחידה (SP-SDS) מאפשר הערכות CFU מפחות צלחות לכלדגימה 31. שיטות אלה מהוות שיפור בשיטת ציפוי ההתפשטות המסורתית, אך עדיין דורשות טיפול וציפוי של דגימות חיידקים בנפרד ולכן אינן אידיאליות לתפוקה גבוהה. טיפול בדגימות בלוחות 96 בארות וציפוי ספוט של אותן 96 דגימות על לוחות אגר מלבניים משפר מאוד את התפוקה של דגימות19.
מיקרוביום מורכב בדרך כלל ממספר זנים ומינים. בעוד שלעתים קרובות ניתן להבחין בין מינים על ידי מורפולוגיה של מושבות או אמצעי גדילה, ניתן להשתמש בפלואורסצנציה כדי להבחין עוד יותר בין סוגים שונים של חיידקים ותכונות הגדילה שלהם32. לדוגמה, גנוטיפים שונים של אותו המין יכולים להיות מסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים שונים המקודדים גנטית. שיטות הדמיית לוחות המשלבות פלואורסצנציה מאפשרות לחוקרים לנצל את הטכניקות הגנטיות הללו במבחנים מבוססי CFU32. שילוב פלואורסצנטיות בשיטות ספירת CFU בתפוקה גבוהה ישפר עוד יותר את התועלת שלהן.
ספירת CFUs באופן ידני הופכת מסורבלת כאשר יש מספר רב של דגימות. ספירה אוטומטית של CFUs יכולה להתבצע על ידי צילום הצלחת ועיבוד התמונה באמצעות תוכנה מיוחדת33. Sieuwerts et al. שילבו את יעילות הציפוי המשופרת של ציפוי נקודתי עם ספירת מושבות אוטומטית באמצעות צילום דיגיטלי קונבנציונלי ותוכנת ImageJ19.
שיטה בעלת תפוקה גבוהה לסינון הפנוטיפים של מיקרובים ספציפיים ואגודות מארחות תסייע למחקרים על התכנסות קהילת המיקרוביום וההשפעה על בריאות המארח וכושרו. לצורך מחקרים במיקרוביום דרוזופילה , פלטפורמה מיקרוביולוגית בעלת תפוקה גבוהה תשלב טיפול בדגימות זבובים בפורמט של 96 לוחות, תזה של זבובים ללא תזה חיידקית, יעילות של ציפוי נקודתי, היכולת להשתמש בפלואורסצנטיות ולהבחין בין פלואורופורים מרובים, סביבת אור מבוקרת להדמיה ניתנת לשחזור של לוחות CFU, ותוכנה אוטומטית אמינה לספירת מושבות. מאמר זה מתאר שיטה הממוטבת לבדיקה של יחידות יוצרות מושבה בזבובים גנוטוביוטיים, שהיא פשוטה, מהירה ואוטומטית. פרוטוקול זה מתווה זרימת עבודה חדשנית המשלבת את מיטב השיטות שפורסמו בעבר וממוטבת לחקר מיקרוביום המעי בדרוזופילה.
הטכניקות המפורטות המוצגות כאן מאפשרות גידול של פי >100 במספר הדגימות שניתן להעריך בניסוי ספירת CFU. טכניקה זו מקדמת שיטות קיימות לניסויים במיקרוביום בדרוזופילה 12,35,36 על ידי שימוש בפורמט של צלחת 96 בארות כדי לבחון זבובים בודדים. יתר על כן, הוא מיישם שיטת ציפוי ספוטיעילה יותר 19,31 וזרימת עבודה אוטומטית עם פלטפורמת צילום וספירת מושבות. המשמעות של שיטה זו עבור Drosophila היא סטנדרטיזציה של ניסויים לפורמט לוח 96 באר, המאפשר טיפול בו זמנית של מספר רב של שכפולים ביולוגיים עם אוטומציה כדי להשיג כימות תפוקה גבוהה של CFUs.
פלטפורמת 96 הקידוחים מראה שתדירות מוגברת של העברה ו”ניקוי” של חיידקים חולפים גורמת להפחתה משמעותית הן בשפע הממוצע והן בשונות בין הדגימות (איור 1B,C), מה שמדגים את ההקפדה של פרוטוקול משופר זה. מגבלה אחת של שיכון משותף של זבובים היא העברה אופקית של חיידקים בין זבובים. הפתרון המוצע הוא לשמור על זבובים בנפרד בפורמט של 96 בארות, כגון כל האכלת בעלי חיים שטוחה38.
למרות שלא נצפתה ירידה משמעותית בעומס החיידקים כאשר זבובים נשטפו באתנול, זבובים אלה נשמרו רק בנוכחות חיידקים חיצוניים במשך 3 ימים. דיור לפרקי זמן ארוכים יותר יכול לאפשר עומס חיידקים גדול יותר לצבור39. לכן, כביסה באתנול עדיין מומלץ.
העברת זבובים לתוך לוח 96 בארות היא הצעד הראשון הקריטי להגדרת זרימת העבודה (איור 1A). לאחר שהזבובים נשטפים, הם מופצים לבארות בזה אחר זה. תרשים לוחות שימושי בשלב זה כדי לציין אילו תנאים קיימים בכל באר ולהוסיף הערות כגון “הזבוב אבד”. הומוגניזציה היא צעד קריטי נוסף עם כמה אזהרות חשובות. חיידקים שורדים את תהליך ההומוגניזציה כשהם נמצאים בנוכחות זבוב (איור 1D,E), וככל הנראה העיקרון הזה נכון גם כשהחיידקים נמצאים בתוך המעיים של הזבוב. עם זאת, חיידקים מומתים גם כאשר הם הומוגניים בצלחות מקציף חרוזים בלבד, מה שמוכיח כי ההומוגניזציה יכולה להרוג את תאי החיידקים בנסיבות מסוימות, מגבלה שעשויה להיות חשובה אם מדובר בהומוגניות של מעיים מנותחים, למשל. יש לציין כי אובדן יחידות ה-CFU בעת הומוגניזציה תלוי במספר יחידות ה-CFU במדגם, וההפסד הוא מינימלי כאשר משתמשים ב~105 יחידות יוצרות מושבה לכל באר. ניתן להשיג שימור נוסף של יחידות יוצרות מושבה על ידי עצירת הומוגניזציה באמצע הדרך וקירור הצלחת על קרח.
הומוגניזציה בוצעה במשך 5 דקות בפרוטוקול זה בהתבסס על ניסויי בקרה שבהם מספר ידוע של יחידות יוצרות מושבה עורבבו עם זבוב נטול חיידקים, וזה עבד באופן אמפירי עבור חיידקי זבובים. פחות מכות גרמו לנוכחות חלקי זבוב גדולים יותר, מה שמפריע לפיפטות, בעוד שזמני הומוגניזציה ארוכים משמעותית של ~ 10 דקות הפכו את ספירת ה- CFU למשתנה יותר. הנפח הקטן יותר והצורה הזוויתית של בארות צלחת חרוטית נצפו כדי להפחית את היעילות של מכות חרוזים בהשוואה צינורות גליליים 2 מ”ל. וריאציות רבות על גישה כללית זו אפשריות, כולל אילו זני חיידקים, איזה מיכל מכות חרוזים, אילו חרוזים, ואיזה גנוטיפ זבוב משמשים. מקרי משתמש בודדים צריכים להשתמש בפקדים חיוביים כדי לבסס את הגישה שלהם.
שיטת הציפוי הנקודתי הופעלה באופן ספציפי: דילולים של 1:2 של L. plantarum WF ב- PBS זוהו על לוחות MRS והודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים (ניתן ליישם זמני דגירה קצרים יותר כדי ליצור גדלי מושבות קטנים יותר). השיטה דורשת השקעה מסוימת מראש בציוד, בעיקר מקציף החרוזים והפיפטור בעל 96 הערוצים (איור 2A), הנחוץ הן לסדרת הדילול והן לציפוי הנקודתי. עם זאת, קיימות אפשרויות זולות יותר, כולל משכפל לוחות 96 באר עם פינים מחורצים. סדרת הדילול היא שלב קריטי המשפיע על הדיוק של תוצאות ספירת CFU. מבחינת מצבי כשל, ניתן לסתום את קצות הפיפטה עם חלקי זבוב או חרוזי זכוכית ועל קצות הפיפטה לא לאטום כראוי על הפיפטור או להיכשל מסיבה אחרת. כל הבעיות הללו גורמות למספר חסר של הבארות המושפעות ויש לעקוב אחריהן. ערבוב הולם בכל שלב בסדרת הדילול הוא גם חיוני. כל דילול צריך להיות מעורבב ביסודיות או על ידי הנחת הצלחת על שייקר צלחת או על ידי pipetting למעלה ולמטה 15-20 פעמים, אשר משמש גם לשטוף את הקצוות. על ידי איתור מהצלחת המדוללת ביותר לצלחת המדוללת ביותר, ניתן לעשות שימוש חוזר בקצוות עבור כל סדרת הדילול. עם דילולים של 1:2, הספירה מדויקת על פני טווח של 2-25 מושבות, המשתרעות על סדר גודל (איור 2C). לכן, דילולים של 1:10 חוסכים זמן וחומרים. משתנה נוסף שניתן לנצל הוא זמן הדגירה, אשר ניתן להתאים כדי לייצר מושבות קטנות יותר, ובכך להגדיל את טווח הנקודות הניתנות לספירה על ידי מניעת מיזוג של מושבות סמוכות.
תמונה איכותית של הצלחת היא חיונית מכיוון שהיא הופכת לנתוני המקור הגולמיים שמהם מנותחים ה- CFUs וניתן לאחסן אותם בארכיון ללא הגבלת זמן. ה- FluoroBox נועד להפיק תמונות של הלוחות בעוצמת אור אחידה, הממזערת את הבוהק על משטח האגר. בנוסף, העיצוב מסוגל לצלם באופן סלקטיבי מושבות פלואורסצנטיות באמצעות נורות LED בצבע יחיד ומסנני תמונות צבעוניים (איור 3A). בניית מערך כמו FluoroBox, עם הגדרות תאורה ומצלמה מבוקרות, יכולה להגדיל מאוד את יכולת השחזור של תמונות CFU, החשובות לניתוח אוטומטי. מורפולוגיות של מושבות, עוצמת פלואורסצנטיות והשפעות הזמן או הצפיפות על צמיחת המושבה הן רק כמה מהתכונות שניתן לנתח באמצעות התצלומים. ניתן לבנות את תיבת התמונות ללא מסנני הצבע ונורות בצבע יחיד אם לא נעשה שימוש בחיידקים פלואורסצנטיים, מה שמפחית את העלות והמורכבות. אורות עירור ומסנני פליטה שונים יכולים להיות מוחלפים לאלה המומלצים כאן אם פלואורופור אחר משמש מעבדה. מצלמה המחוברת לטאבלט באמצעות WiFi באמצעות אפליקציה שימושית הן עבור תכונת התריס האוטומטי למניעת רעידות והן עבור העברת נתונים קלה. ניתן להעביר תמונות לטאבלט ולאחר מכן למחשב נייד באמצעות תוכנת העברת קבצים אלחוטית. מצלמות מומלצות עם יכולות אלה מצוינות בטבלת החומרים.
Count-On-It הוא תוסף שנכתב ב-ImageJ. תוכנת ספירת CFU האוטומטית מפלחת את תמונת הלוח לרשת אחידה של 96 בארות, סופרת את המושבות בכל תא רשת ומאצוות את התוצאות לגיליון אלקטרוני פשוט. מכיוון שתמיד יש שונות במיקום של רשת הספוט על הצלחת ובתמונה, על המשתמש להתאים ידנית את הרשת לתמונה באמצעות התוסף Croptacular. זה גם עוזר לא לכלול אזורים ליד קצה הצלחת, אשר יש בוהק. קביעת הסף היא המפתח לקבלת ספירת CFU המדויקת ביותר מהתמונה. אם הסף נקבע גבוה מדי, המושבות יתמזגו; אם הסף נקבע נמוך מדי, המושבות לא ייכללו. לאחר קביעת הסף, המאקרו מחיל טשטוש גאוס כדי לרכך את הקצוות ולהקטין את הכינוי, מסנן קו פרשת המים מחלק מושבות חופפות, והכתמים נספרים באמצעות חלקיקי ניתוח.
לפעמים, צפיפות המושבות גבוהה מדי במקום מסוים. Count-On-It מספק דרך להתמודד עם זה. כדי להעריך את מספר המושבות בתא רשת עם מושבות ממוזגות חלקית, ראשית השטח הממוצע של גוש עגול מכל הלוח נלקח כממוצע C. לאחר מכן, השטח של כתם A 1 מחולק בשטח הממוצע של כתם עגול A1/Cממוצע. מספר זה מעוגל למספר השלם הקרוב ביותר, וזהו האומדן עבור מספר המושבות הנמצאות בכתם. פונקציה זו היא אחת הסיבות לכך שהסף יכול להשפיע על תוצאות הספירה: שטח המושבה הממוצע היחסי לעומת אזור הכתמים הממוזג יהיה שונה בהתאם לאופן שבו הסף השפיע על כתמים ממוזגים.
לשיטות המוצגות יש מספר מגבלות. אלה כוללים את הצורך בציוד להוצאת מדיה נוזלית במדויק מלוחות 96 באר. ציוד זה, או פיפטור 96 ערוצים או כלי פין משכפל מחורץ, יכול לעלות אלפי דולרים להשיג. קיימות חלופות זולות יותר אך הן פחות מדויקות. ספירה אוטומטית באמצעות Count-On-It מציגה גם כמה מגבלות. לדוגמה, אם שני סוגי מושבות באוכלוסייה מעורבת היו מופרדים על סמך גודל בלבד, ספירת כתמים לא תוכל להקצות מושבות לסוג הנכון. במקרה זה, כתמים עם כתמים יהיה צורך לחסל מן הספירות. הבחנה נוספת של מושבות על בסיס מורפולוגיה תהיה הרחבה רבת ערך של השיטה שאינה מיושמת כיום. השימוש במדיה סלקטיבית הכוללת חומרים מזינים ספציפיים לזן ואנטיביוטיקה מפשט את הצורך בניתוח תמונה מורכב.
קיום ניסויים של זבוב הפירות בלוחות של 96 בארות מכפיל את מספר הדגימות והתנאים שניתן לבדוק בניסוי יחיד ויכול להקל על מסכי תפוקה גבוהה בפנוטיפים של קשר דרוזופילה-חיידקים. אנו מדמיינים שניתן להרחיב שיטה זו על ידי שימוש במדיה סלקטיבית כדי להבדיל בין זני חיידקים רבים בתערובות מורכבות. השיטה אינה מוגבלת לחקר המיקרוביום של הזבוב. כימות של יחידות יוצרות מושבה נפוץ ביישומים רבים של מיקרוביולוגיה, החל מספירות קוליפורמים במי שתייה וכלה בזיהוי פתוגנים. מערכת ציפוי CFU המוצגת כאן מאפשרת מסכים בתפוקה גבוהה, כמו גם רכישה, עיבוד, אחסון ואספקה אוטומטיים של תוצאות.
The authors have nothing to disclose.
ד”ר קרווין קייסי הואנג, ד”ר אנדרס ארנדה-דיאז, טד קופר וחברי מעבדת לודינגטון נתנו מידע חשוב על פיתוח פרוטוקול זה. המימון ניתן על ידי מענק NSF IOS 2032985, מענק NIH DP5OD017851, מענק של מכון קרנגי בקנדה והקדש של מכון קרנגי למדע.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |