一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合检测方法用于评估抗癌适配体的选择性与特异性

摘要

在抗癌适配体开发过程中，一个必要的步骤是检测其与靶标的结合能力。我们展示了一种基于流式细胞术的检测方法来研究这种结合，并强调了实验中必须包含阴性对照适配体，以及对该特定蛋白呈阳性或阴性的癌细胞的重要性。 

摘要

开发抗癌适配体（aptamer）的一个关键挑战是高效确定所开发适配体对靶标蛋白的选择性和特异性。由于适配体相较于单克隆抗体具有多项优势，其开发在癌症研究人员中已获得极大关注。配体的指数富集系统进化（SELEX）是开发针对目标蛋白的特异性适配体最常用的方法。在完成SELEX之后，快速且高效的结合实验可加速识别过程，确认适配体的选择性和特异性。

本文介绍了一种基于流式细胞术的适配体与上皮细胞黏附分子（EpCAM）特异性结合的逐步检测方法。跨膜糖蛋白EpCAM在大多数癌瘤中高表达，在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥重要作用，因此是靶向药物递送至肿瘤的潜在理想靶点。为了评估该适配体对膜结合型EpCAM的选择性和特异性，需要使用EpCAM阳性与阴性细胞。此外，还需一种与EpCAM结合适配体长度相似且二维（2D）结构相近但无结合能力的非结合型EpCAM适配体作为对照。该结合实验包括多种缓冲液（封闭缓冲液、洗涤缓冲液、孵育缓冲液和FACS缓冲液）以及一系列孵育步骤。

将适配体与细胞系共同孵育。经过孵育和洗涤步骤后，将使用灵敏的流式细胞术检测来评估细胞。结果分析显示，EpCAM特异性适配体结合EpCAM阳性细胞，而不结合EpCAM阴性细胞。在EpCAM阳性细胞中，与非结合性适配体对照相比，EpCAM适配体的结合表现为向右的峰位移动；而在EpCAM阴性细胞中，EpCAM结合性与非结合性适配体的相应峰位重叠。这证明了EpCAM适配体的选择性和特异性。尽管本实验方案主要针对EpCAM适配体，但该方案同样适用于其他已发表的适配体。

引言

癌症仍然是全球主要的死亡原因之一¹。尽管近几十年来癌症治疗取得了显著进展，抗癌药物的研发仍是一个备受争议的话题。这是因为化疗作为癌症治疗的主要手段，常伴随严重的副作用，限制了患者对治疗的依从性。此外，化疗诱导的肿瘤耐药性也限制了其作为唯一医疗干预手段的应用。单克隆抗体（mAbs）的应用提高了癌症治疗的应答效果²。使用mAbs的初衷是提高化疗药物的疗效并最小化其不良反应。然而，mAbs的使用也面临挑战，不仅因其可能引发免疫反应，还由于其依赖动物生产、成本高昂以及储存条件苛刻³。20世纪90年代适配体（aptamers）的引入为癌症治疗带来了新的希望，因为适配体的应用有望解决与mAbs相关的一系列难题⁴。

适配体是一类为特定靶标专门设计的短链核酸序列。配体的系统性指数富集（SELEX）是适配体开发中常用的方法。在SELEX过程中，将目标蛋白与含有随机核苷酸序列的文库共同孵育，通过一系列迭代循环，筛选出针对该蛋白的特异性适配体。适配体在靶标选择性和特异性方面与单克隆抗体（mAbs）相似，因此在药物研发领域展现出广阔的应用前景。针对癌症生物标志物的适配体可作为单一药物或癌症诊断工具使用^5,6....

方案

注意：实验开始前，请穿戴个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。有关本实验方案中所用材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 实验所需缓冲液

1. 在实验当天新鲜配制本实验所需的缓冲液——用于适配体折叠的SELEX缓冲液、封闭缓冲液（BB）、洗涤缓冲液（WB）和结合缓冲液（BiB）（表1），并将它们置于冰上或4 °C保存。
   注意：每种适配体都需要特定的折叠条件，包括SELEX缓冲液组成及折叠温度条件。应仔细参照最初描述该适配体的原始文献中的方法进行完全复现¹⁰。本实验中，所有缓冲液均使用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制。每次实验所需缓冲液的体积取决于所测试的细胞系数量、重复次数以及适配体浓度的数量。

....

	成分		所需体积

结果

新药发现与开发的一个重要方面是确保候选药物的选择性和特异性。这意味着候选药物应能够区分不同类型的细胞，并仅影响目标细胞群体（选择性）。通过使用在目标蛋白表达方面存在差异的细胞系来研究选择性。本研究中，选择 MDA-MB-231 和 HEK 293T 细胞系作为 EpCAM 阳性和阴性细胞。特异性是另一个关键指标，表明目标蛋白仅对单一候选药物产生响应。在此，通过使用不结合 EpCAM 的适配体 TENN 作为对照，结果显示只有 TEPP 能够与 EpCAM 结合。在 EpCAM 阳性细胞（MDA-MB-231）中，叠加代表 TEPP 和 TENN 处理细胞的直方图可见，TEPP 处理组的细胞峰向右偏移，而 TENN 处理组则无此现象。这表明适配体 TEPP 与目标蛋白 EpCAM 发生了结合（图 4D）。在阴性对照 HEK 293T 细胞中，TEPP 与 TENN 处理组的直方图叠加后未观察到任何偏移（图 4E）。这说明在表达 EpCAM 的细胞中，TEPP 作为 EpCAM 适配体与其受体特异性结合，而在不表达 EpC.......

讨论

开发新适体（aptamer）面临的主要挑战在于缺乏适用于该过程各个步骤的标准化指南。McKeague 等人最近揭示了其中一些相关难题，这些问题导致在发表文献中数据呈现不清晰，并难以重复相关研究。他们提出了在表征适体时必须考虑的基本指南¹⁹。适体结合实验是筛选和/或表征适体的关键步骤²³，该方法被该领域研究人员广泛使用。由于目前尚无单一指南用于展示逐步操作流程，本视频方案中演示了一种常用于研究适体-蛋白质结合的流式细胞术方法。

有多种方法可用于检测适配体与其靶标之间的相互作用，流式细胞术便是其中之一。其他方法包括荧光偏振、表面等离子共振、毛细管电泳和等温滴定 calorimetry²⁴。选择合适的方法取决于适配体的具体应用。然而，需要注意的是，每种方法都有其局限性，联合使用多种检测手段更有利于小分子适配体的表征²⁴。本文所述方法具有多项优势，是目前最可靠、精确且准确的方法之一，同时兼具快速和成本.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带盖的1.5 mL 微量离心管	Sigma-Aldrich	T6649
15 mL CellStar 蓝色螺旋盖锥底管	Greiner Bio One	188271
5 mL 血清移液管	Greiner Bio One	606180
BD FACSCanto II 流式细胞仪	Becton Dickinson	N/A
BD FACSDiva V9.0	BD Biosciences	N/A
牛血清白蛋白（BSA），冻干粉末	Sigma-AldrichTM	A7906-50G
亮线血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）高糖培养基粉末	Life Technologies	12100046
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Life Technologies	21300025
FlowJo, LLC 10.8.1	BD Biosciences	N/A
胎牛血清（FBS）	Bovogen	SFBS-F
HEK293T	American Type Culture Collection	ACS-4500
Heracell 150i CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	N/A
Heraeus Megafuge 16R 离心机	Thermo Fisher Scientific	N/A
氯化镁（MgCl2）	Sigma-Aldrich	M8266
MDA-MB-231	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
微孔板，聚苯乙烯，96 孔，F 型底（烟囱孔），黑色	Greiner Bio One	655076
MiniAmp 热循环仪	Thermo Fisher Scientific	A37834
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂	Life Technologies	18912014
无热原且无 RNase 的超纯水	Milli-Q
T75 细胞培养瓶	Cellstar	658170
TENN	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPP	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
转移 RNA（tRNA）	Sigma-Aldrich	R8508-5X1ML
台盼蓝溶液	Life Technologies	15250061
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400054