本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内 （在小鼠中）通过感染、无菌性损伤和癌症模型，确定细胞死亡通路（如焦亡、凋亡、坏死性凋亡和PANoptosis）的启动机制。
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本文内容
摘要
摘要
先天免疫在应对病原体和无菌性损伤时提供关键的第一道防御屏障。这一反应的关键机制之一是启动先天免疫相关的程序性细胞死亡（PCD），以清除受感染或受损的细胞并促进免疫反应的传播。然而，过度的PCD与炎症和病理变化相关。因此，理解PCD的激活与调控机制，是阐明先天免疫反应特征以及在多种疾病谱中发现新的治疗靶点的核心环节。
本方案提供了通过监测半胱天冬酶（caspase）来表征天然免疫程序性细胞死亡（PCD）活化的方法。半胱天冬酶是一类依赖半胱氨酸的蛋白酶，通常与多种程序性细胞死亡通路相关，包括 凋亡 、焦亡、坏死性凋亡和PANoptosis。早期研究将caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10归类为凋亡中的起始caspase，而将caspase-3、caspase-6和caspase-7归类为效应caspase；后续研究发现，炎症性caspase（包括caspase-1、caspase-4、caspase-5和caspase-11）可驱动焦亡。目前研究已知，caspase与其他天然免疫及 细胞死亡分子在既往定义的PCD通路之间存在广泛的交叉对话，这揭示了在天然免疫与PCD机制理解方面的一个关键知识空白， 并推动了PANoptosis的提出与界定。PANoptosis是一种独特的由PANoptosome复合物调控的天然免疫炎症性程序性细胞死亡通路，该复合物整合了来自其他细胞死亡通路的组分，包括caspase 等。
本文提供了评估细胞在不同刺激下caspase激活状态的方法。这些方法可用于表征体外（in vitro）和体内（in vivo）的程序性细胞死亡（PCD）通路，因为活化的caspase会发生蛋白水解性剪切，可通过使用合适的抗体和印迹条件进行Western印迹检测并加以可视化。我们已建立了一种实验方案和Western印迹工作流程，能够从同一细胞群体中同时评估多种caspase的激活情况，从而对PCD过程进行全面表征。该方法可广泛应用于发育、稳态、感染、炎症和癌症等研究领域，以评价健康和疾病状态下细胞生命活动中的PCD通路。
引言
先天免疫系统在感染过程中以及对无菌性刺激（如组织损伤和稳态失衡）的反应中，充当第一道防御屏障。细胞表面和细胞质中的先天免疫感受器可识别病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs），从而触发炎症信号通路和细胞反应。先天免疫反应的关键过程之一是诱导细胞死亡，以清除受感染或受损的细胞，并进一步驱动先天性和适应性免疫反应。程序性细胞死亡（PCD）在不同物种间高度保守，凸显了其作为先天免疫机制在进化上的重要性。
所有细胞类型中均可激活多种天然免疫程序性细胞死亡（PCD）通路。Caspase 是一类高度保守的细胞内半胱氨酸依赖性蛋白酶家族，在多种 PCD 通路中发挥关键作用，包括传统上非炎症性的凋亡通路，以及焦亡、坏死性凋亡和 PANoptosis 等炎症性 PCD 通路1,2,3,4,5。目前已明确存在 11 种人类 caspase 和 10 种小鼠 caspase，此外还可能存在功能性的伪 caspase；大多数 caspase 以无活性的单体或二聚体前体形式组成性表达，需经切割才能激活6
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方案
动物使用和操作程序已获得圣裘德儿童研究医院动物使用与护理委员会的批准。
1. 溶液的配制
- 制备L929条件培养基。
- 将1 × 106个L929细胞（参见材料表）接种于含有50 mL L929培养基的182 cm2组织培养瓶中（培养基的配制方法见表1）。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养。
- 7天后收集上清液，并用0.45 µm滤器过滤。分装为每份50 mL（冻存的样品可在−80 °C保存长达1年）。
- 配制500 mL骨髓来源巨噬细胞（BMDM）培养基（表1）。
- 配制500 mL BMDM刺激培养基（表1）。
- 配制500 mL用于感染的培养基（表1）。
- 配制100 mL 1 M Tris缓冲液（表1）。
- 配制4×十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液（表1）。
- 配制1 mL 1 M 1,4-二硫苏糖醇....
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结果
PAN凋亡已被发现可响应多种细菌、病毒和真菌感染以及其他炎性刺激，同时也存在于癌细胞中44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61<.......
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讨论
监测caspase的切割与活化是了解天然免疫程序性细胞死亡（PCD）激活过程的最全面方法之一，该过程是天然免疫反应的重要组成部分。本文所述方案展示了一种策略，可用于监测流感病毒（IAV）、单纯疱疹病毒1型（HSV1）和F. novicida感染以及非感染性刺激物LPS联合ATP所诱导的caspase活化。然而，已有大量研究证明，多种其他刺激物也可诱导PCD，并适用于本方法44,48,49,50,51,52,53,54,56.......
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披露
T.-D.K. 是辉瑞公司的顾问。
致谢
感谢Kanneganti实验室成员的评论和建议，并感谢J. Gullett博士提供的科学编辑支持。本实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为AI101935、AI124346、AI160179、AR056296和CA253095（授予T.-D.K.），以及由美籍黎巴嫩裔和叙利亚裔慈善协会（American Lebanese Syrian Associated Charities）资助（授予T.-D.K.）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 μm 滤膜 | Millipore | SCHVU05RE | |
| 10 mL 注射器 | BD Biosciences | 309604 | |
| 12% 聚丙烯酰胺凝胶（10 孔） | Bio-Rad | 4561043 | |
| 12 孔板 | Corning | 07-200-82 | |
| 18 G 针头 | BD Biosciences | 305195 | |
| 25 G 针头 | BD Biosciences | 305122 | |
| 50 mL 离心管 | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| 70 μm 细胞滤网 | Corning | 431751 | |
| 150 mm 组织培养皿 | Corning | 430597 | |
| 182 cm2 组织培养瓶 | Genesee Scientific | 25-211 | |
| 白色附件透析托盘 | Cytiva | 29-0834-18 | |
| 抗–胱天蛋白酶-1 抗体 | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| 抗–胱天蛋白酶-11 抗体 | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| 抗–胱天蛋白酶-3 抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗–胱天蛋白酶-7 抗体 | Cell Signaling Technology | 9492 | |
| 抗–胱天蛋白酶-8 抗体 | Cell Signaling Technology | 4927 | |
| 抗–胱天蛋白酶-9 抗体 | Cell Signaling Technology | 9504 | |
| 抗–活化胱天蛋白酶-3 抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗–活化胱天蛋白酶-7 抗体 | Cell Signaling Technology | 9491 | |
| 抗–活化胱天蛋白酶-8 抗体 | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| 抗小鼠 HRP 标记二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| 抗兔 HRP 标记二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| 抗大鼠 HRP 标记二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-035-003 | |
| 抗–β-肌动蛋白抗体 (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL 胰蛋白酶大豆肉汤 | BD Biosciences | 211768 | |
| 珠浴器 | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| Biophotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | BO126 | |
| 细胞刮刀 | CellTreat Scientific Products | 229315 | |
| 化学发光成像仪（Amersham 600） | Cytiva | 29083461 | |
| CO2 培养箱 | VetEquip | 901703 | |
| 比色皿 | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| 解剖剪刀 | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| 电泳装置 | Bio-Rad | 1658004 | |
| 乙醇 | Pharmco | 111000200 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1620 | |
| 滤纸 | Bio-Rad | 1703965 | |
| 镊子 | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| 新凶手弗朗西斯菌（U112 菌株） | BEI Resources | NR-13 | |
| 凝胶释放器 | Bio-Rad | 1653320 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750060 | |
| 甘油 | Sigma | G7893 | |
| 甘氨酸 | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| 加热块 | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
| 单纯疱疹病毒 1 型（HF 菌株） | ATCC | VR-260 | |
| 高糖 DMEM | Sigma | D6171 | |
| 人抗–胱天蛋白酶-1 抗体 | R&D Systems | MAB6215 | |
| 人抗–胱天蛋白酶-8 抗体 | Enzo | ALX-804-242 | |
| 加湿培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| 图像分析软件 | ImageJ | v1.53a | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| 甲型流感病毒（A/Puerto Rico/8/34，H1N1 [PR8]） | 根据 Hoffmann 等人方法构建 | ||
| L929 细胞 | ATCC | CCL-1 | 用于制备 L929 条件培养基的细胞系 |
| L-半胱氨酸 | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
| Luminata Forte Western HRP 底物 | Millipore | WBLUF0500 | 标准灵敏度 HRP 底物 |
| MDCK 细胞 | ATCC | CCL-34 | 用于测定 IAV 病毒滴度的细胞系 |
| 甲醇 | Sigma | 322415 | |
| 微量离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 脱脂奶粉 | Kroger | ||
| NP-40 溶液 | Sigma | 492016 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| 青霉素和链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 培养皿 | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| 电源 | Bio-Rad | 164-5052 | |
| 蛋白酶抑制剂片剂 | Sigma | S8820 | |
| PVDF 膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 摇床 | Labnet | S2035-E | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| 氯化钠 | Sigma | S9888 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | 30970 | |
| 氢氧化钠 | Sigma | 72068 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | |
| 方形培养皿 | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| 洗脱缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
| Super Signal Femto HRP 底物 | Thermo Fisher Scientific | 34580 | 高灵敏度 HRP 底物 |
| 台式离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| Trans-Blot 半干转印系统 | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Tris | Sigma | TRIS-RO | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| 大肠杆菌 0111:B4 超纯脂多糖（LPS） | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| Vero 细胞 | ATCC | CCL-81 | 用于测定 HSV1 病毒滴度的细胞系 |
参考文献
- Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171(1996).
- Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21....
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