方法文章

一种用于小鼠胸腺内注射的微创、准确且高效的技术

DOI：

10.3791/64309

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2022年8月23日

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1Department of Radiology, Hackensack University Medical Center, 2Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 3Department of Pediatrics, Hackensack University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本方案描述了一种建立用于小鼠胸腺内注射的介入放射学操作方法，旨在避免开放性手术的风险，并提高盲穿经皮注射的准确性。

摘要

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在小鼠模型中进行胸腺内注射是研究胸腺功能及免疫功能（包括遗传性和获得性T细胞疾病）的重要技术。该技术需要将试剂和/或细胞直接递送至活体小鼠的胸腺中。传统的胸腺内注射方法包括开胸手术或微创经皮盲注，但两者均存在显著局限性。超声频率成像设备的发展使得在小鼠中实现影像引导下的经皮注射成为可能，显著提高了经皮注射的准确性，并能够靶向更小的结构。然而，影像引导注射依赖于集成导轨系统的使用，导致操作僵化且耗时较长。本文介绍一种独特、安全且高效的小鼠经皮胸腺内注射方法，无需依赖导轨系统即可完成注射。该技术利用高分辨率微型超声设备对小鼠胸腺进行无创成像，并采用徒手操作技术，在超声引导下由放射科医师将针尖直接置入小鼠胸腺。小鼠在成像前需进行清洁和麻醉处理。对于熟练掌握超声引导操作的放射科医师而言，该技术的学习周期非常短，通常一次操作即可掌握。该方法对小鼠的发病率和死亡率较低，且比目前依赖机械辅助的经皮注射技术更为快速。该方法可高效、精确且可靠地对各种大小的胸腺（包括老年小鼠或免疫缺陷小鼠等体积非常小的胸腺）进行经皮注射，同时最大程度减少动物应激。如需，该技术还可实现对单个胸腺叶的注射，并因其操作省时，适用于大规模实验研究。

引言

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胸腺在T细胞发育和免疫中具有重要作用。T细胞缺乏症可由胸腺退化、遗传性疾病、感染以及癌症治疗等多种因素引起，导致高死亡率和高发病率1,2。小鼠模型在基础和转化免疫学研究中不可或缺，数十年来已被广泛用于研究胸腺生物学和T细胞发育，并用于开发针对胸腺功能障碍和T细胞缺乏症患者的治疗方法3,4,5。

胸腺研究的一个核心部分是在小鼠模型中向胸腺内注射细胞、基因或蛋白质等生物材料6,7,8,9,10,11,12传统的胸腺内注射方法采用开胸术，随后在直视下进行胸腺内注射，或通过 "盲法" 经皮穿刺纵隔注射。手术入....

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方案

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所有操作均按照创新发现中心的动物护理指南进行（IACUC方案290）。在本研究中，分别使用C57BL/6小鼠（雌性，4-6周龄）、C57BL/6小鼠（雌性，6月龄）、J:NU雌性小鼠、NOD scid gamma（NSG）雌性小鼠以及B6;CAG-luc, -GFP小鼠作为年轻小鼠模型、老龄小鼠模型、无胸腺裸鼠模型、免疫缺陷模型和生物发光细胞来源。小鼠购自商业来源（见材料表）。该操作通常需要两人配合完成（一人负责无菌注射操作，另一人负责小鼠处理）。

1. 动物准备

  1. 使用3%–4%异氟烷气体对小鼠进行麻醉诱导，并以1%–3%异氟烷气体维持麻醉状态 通过 一个鼻锥和精密校准的蒸发器（参见 材料表).
  2. 通过后肢足垫夹捏无反应确认适当的麻醉深度/意识丧失。
  3. 用脱毛膏在小鼠前胸部区域涂抹一层薄薄的脱毛膏，作用时间少于1分钟，然后用湿润的纸巾彻底擦去脱毛膏及脱落的毛发。
    注意：使用过多乳膏会导致胸部区域皮肤发炎。
  4. 一次将一只小鼠仰卧放置于小动物超声成像仪的加热平台上（参见 材料表）并将鼻锥安装到位（图1).
  5. 用医用胶带将小鼠的前肢和....

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结果

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成功实施该技术依赖于遵循几个关键步骤。首先，必须可靠地识别胸腺组织本身。在年轻小鼠中，由于胸腺体积较大，这一步较为直接（图3A）。而在年老小鼠或免疫缺陷小鼠中，识别可能更具挑战性；然而，使用现代超声设备仍然完全可以实现（图3B、C）。其次，至关重要的是设定针头的进针路径，使其在针尖穿过胸壁各层并进入胸腺的过程中能够持续被可视化。成功的注射要求在整个推进过程中始终清晰显示针头位置。这可确保操作者确认针头未穿过心脏、主动脉或下腔静脉等重要结构（图4）。此原则同样适用于注射过程本身：注射期间必须始终观察到针尖位于目标位置，以确认物质已准确注入胸腺内（图5）。

存在一些轻微的常见问题，若能及时识别则可相对容易地加以避免。在将小鼠固定于操作台和鼻罩时，需尽量使其胸廓保持中立位（即无明显向左或向右旋转）。若胸廓旋转过度，则可.......

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讨论

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超声引导下的徒手注射是一种高效且无菌地将研究物质递送至胸腺的高精度技术。在对注射部位皮肤进行初步消毒后，由于使用了无菌手套、无菌超声探头套和无菌超声耦合剂，整个操作过程中可保持无菌状态。与常用的盲穿经皮注射方法10,17或依赖外科切口直接观察胸腺18,19的小鼠胸腺内注射技术相比，徒手超声引导技术结合了高度的安全性、快速性和极高的操作精确度。使用导轨平台进行超声引导注射14可达到相似的安全性和准确性，但这种繁琐的方法通常在小鼠麻醉并放置于成像平台后，每只注射至少需要5分钟，而徒手技术则可使熟练操作者在每只小鼠上约20至30秒内完成注射15。

掌握胸腺内注射的各种方法，包括超声引导下徒手注射技术，需要丰富的经验和培训。然而，具有超声引导操作临床经验的放射科医.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢Raymond H. Thornton在本技术早期研究所做出的深刻而全面的工作。本研究获得了美国国家癌症研究所（NCI 1R37CA250661-01A1）、儿童白血病研究协会、哈肯萨克梅里迪安医学院以及HUMC基金会/Tackle Kids Cancer的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aquasonic 100 超声耦合剂帕克实验室（美国新泽西州费尔菲尔德）01-01无菌超声传导凝胶
B6;CAG-luc, -GFP 小鼠杰克逊实验室（美国缅因州巴港）025854生物发光细胞来源
BD 胰岛素注射器（带针头）BD公司（美国新泽西州富兰克林湖）328431超细针头 - 12.7 毫米，30 G
C57BL/6 小鼠 - 老年杰克逊实验室（美国缅因州巴港）0006646个月大；衰老模型
C57BL/6 小鼠 - 幼年杰克逊实验室（美国缅因州巴港）0006644-6周龄；幼年模型
Chloraprep 一步法 0.67 mLCareFusion（美国德克萨斯州埃尔帕索）260449氯己定葡萄糖酸盐涂抹器
Curity 棉签Cardinal Health（美国俄亥俄州都柏林）A5000-2无菌，6"
D-荧光素Gold Biotechnology（美国密苏里州圣路易斯）LUCK-1G
异氟烷Henry Schein（美国纽约州梅尔维尔）1182097
IVIS Lumina X5PerkinElmer（美国纽约州梅尔维尔）n/a活体生物发光成像系统
J:NU小鼠杰克逊实验室（美国缅因州巴港）007850无胸腺裸鼠模型
Kendall 低致敏性纸质胶带Cardinal Health（美国俄亥俄州都柏林）1914C
Kimtech 外科丁腈手套金佰利专业公司（美国德克萨斯州欧文市）56892无菌手套
Nair 脱毛乳液Church and Dwight（美国新泽西州特伦顿）n/a脱毛剂
NOD scid gamma（NSG）小鼠杰克逊实验室（美国缅因州巴港）005557免疫缺陷模型
磷酸盐缓冲液（PBS），1×康宁公司（美国纽约州康宁市）21-040-CV
Puralube Vet 软膏医学与兽医国际PH-PURALUBE-VET眼膏
鞘Sheathing Technologies（美国加利福尼亚州摩根山）10040无菌超声探头套
Sure-Seal 诱导室Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)EZ-17 85麻醉诱导室
传感器 MX550DFUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）n/aVevo 3100 成像探头（25–55 MHz，中心发射：40 MHz）
PBS 中的 0.4% 台盼蓝溶液MP Biomedicals（美国俄亥俄州索伦）91691049
Vevo 3100 成像系统FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）n/a超声成像系统
Vevo 3100 实验室软件FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）n/a用于成像与分析的 3.2.7 版本
Vevo Compact 双麻醉系统FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）n/a基于异氟烷的台式麻醉装置
Vevo 成像系统FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）n/a操作平台

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
  2. Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology.

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