用于生物医学应用的荧光寿命宏成像仪

摘要

本文介绍了一种新型快速光学成像仪在长衰减发射样品宏观光致发光寿命成像中的应用。文中描述了该成像仪的集成、图像采集与分析流程，以及用于成像的传感器材料的制备与表征，并展示了该成像仪在生物样品研究中的应用。

摘要

本文介绍了一种新型光致发光寿命成像仪，旨在绘制分子氧（O₂）在生物组织和材料中的空间分布图。该系统结合了高灵敏度时间相关单光子计数技术与快速扫描光学显微成像，能够以微米级空间分辨率和纳秒级时间分辨率实现非侵入性、实时的氧浓度动态监测。通过检测磷光探针的发光衰减特性，该成像仪可量化局部氧分压，并适用于活体组织、细胞培养及功能性材料的研究。文中详细描述了仪器的设计原理、校准方法及典型应用案例，包括肿瘤模型中缺氧区域的可视化和光催化材料表面反应活性的表征。该技术为生理学、病理学及材料科学领域提供了高精度的氧传感解决方案。 关键词：光致发光寿命成像，分子氧，O₂，时间相关单光子计数，缺氧成像，磷光探针，氧传感，生物组织成像，功能材料分析₂)浓度在不同磷光样品中的变化，涵盖固态、O₂-对用可溶性O染色的活体动物组织样本的敏感涂层₂-敏感探针。特别是使用了基于纳米颗粒的近红外探针NanO2-IR，该探针可由625 nm发光二极管（LED）激发，并在760 nm处发射信号。成像系统基于Timepix3相机（Tpx3Cam）和光学-机械适配器构建，后者还包含一个图像增强器。O₂ 磷光寿命成像显微技术（PLIM）在多种研究中常被需要，但现有平台在准确性、通用灵活性和易用性方面存在局限性。

本文介绍的系统是一种基于集成光学传感器与读出芯片模块Tpx3Cam的快速、高灵敏度成像仪。该系统可从表面染色的肠组织样本或结肠腔内染色片段中产生高强度的磷光信号和稳定的寿命值，实现对组织氧合状态的精细 mapping₂ 水平在约20秒或更短时间内完成。本文还展示了在无意识动物体内移植肿瘤的缺氧成像方面的初步实验结果。我们还描述了如何对成像仪进行重新配置以用于O₂基于Pt-卟啉染料的对氧敏感材料，采用390 nm LED作为激发光源，650 nm带通滤光片用于发射光检测。总体而言，PLIM成像系统能够对所用探针的寿命值进行准确的定量测量，并生成相应的二维O₂分布图₂ 浓度。它也适用于代谢成像 离体 组织模型和活体动物。

引言

O₂ 是生命系统的关键环境参数之一，了解 O₂ 的分布及其动态变化对许多生物学研究具有重要意义^1,2,3。利用磷光探针^4,5,6,7,8 和荧光寿命成像显微技术（PLIM）^{9,10,11,12,13} 评估组织氧合状态在生物和医学研究中正日益受到关注^{3,9,14,15,16,17,18,19}。这是因为 PLIM 与荧光或磷光强度测量不同，不受探针浓度、光漂白、激发光强度、光学对准、散射和自发荧光等外部因素的影响。

然而，现有的 O₂ PLIM 平台受限于其灵敏度、图像采集速度、准确性和整体可用性。时间相关单光子计数（TCSPC）结合光栅扫描程序，常用于 PLIM 和荧光寿命成像显微技术（FLIM）设备中^20,21,22。然而，由于 PLIM 需要较长的像素驻留时间（在毫秒量级），其图像采集时间远长于 FLIM 应用所需的时间^20,22,23。其他技术，如门控 CCD/CMOS 相机，则缺乏单光子灵敏度且帧率较低^20,24,25,26。此外，现有的 PLIM 系统大多以显微形式使用，而宏观系统则较为少见²⁷。

基于TCSPC的PLIM宏观成像系统²⁸被建立以克服上述诸多限制。该成像系统的构建得益于一种新型光机械适配器Cricket的使用，其具备以下特点：i）两个C接口适配器，可方便地将相机模块连接至后端，物镜连接至前端；ii）内部设有图像增强器的安装空间，并在外侧设有为其供电的电源插座；iii）前端C接口适配器后方留有内部空间，可容纳标准25 mm发射滤光片，置于增强器前方；iv）内置光束准直光学元件及环形调节装置，可实现物镜与相机之间的光学对准和聚焦，从而在相机芯片上获得清晰的图像。

在组装好的成像仪中，相机模块连接到Cricket适配器的背面，该适配器内部包含一个图像增强器，其结构依次为光电阴极、微通道板（MCP）、放大器以及快速闪烁体P47荧光粉。Cricket内部安装有760 nm ± 50 nm的发射滤光片，物镜NMV-50M11''则连接在前端的C型接口适配器上。最后，通过环形调节器对物镜和相机进行光学对准。

增强器的作用是探测入射光子，并将其转换为相机芯片上的快速光脉冲，这些光脉冲被记录下来并用于生成发射衰减曲线和寿命图像。该相机模块包含一个基于先进TCSPC技术的光学传感器阵列（256像素 × 256像素）以及新一代读出芯片^{29,30,31,32,33}，能够在每个成像像素上同时记录光子脉冲的到达时间（TOA）和超过阈值的时间（TOT），时间分辨率为1.6 ns，读出速率达到80 Mpixel/s。

在此配置中，配备增强器的相机具有单光子灵敏度。该系统由数据驱动，并基于快速像素探测器读出（SPIDR）系统³⁴。成像仪的空间分辨率此前已使用平面磷光氧（O₂）传感器和分辨率板掩模进行表征。仪器响应函数（IRF）是在与其他所有测量相同的设置下，通过成像平面荧光传感器测得的。染料的寿命约为2.6 ns，足够短，可用于PLIM模式下的IRF测量。该成像仪可对最大尺寸为18 mm × 18 mm的物体进行成像，其空间分辨率和时间分辨率分别为39.4 µm和30.6 ns（半高全宽）²⁸。

以下方案描述了宏成像仪的组装及其用于绘制O的后续使用₂ 生物样品中经先前表征的近红外O染色后的浓度₂ 探针，NanO2-IR³⁵探针是一种明亮、光稳定且可穿透细胞的O₂基于铂(II)苯并卟啉（PtBP）染料的传感探针。该探针在625 nm处可被激发，发射波长为760 nm，对O₂具有稳定的光学响应₂ 在生理范围内（0%–21% 或 0–210 µM O₂）₂）。该成像仪还可用于表征基于Pt(II)-卟啉染料的不同传感材料。总体而言，该成像仪结构紧凑、灵活性高，类似于普通摄影相机。在当前配置下，该成像仪适用于多种宽场PLIM应用。若将LED替换为快速激光光源，可进一步提升成像仪性能，并有望实现纳秒级FLIM应用。

方案

所有涉及动物的操作均在爱尔兰健康产品监管局（HPRA）签发的许可下进行，符合欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）的要求，并经科克大学动物实验伦理委员会批准。

1. 样品制备

1. 活体组织样本的探针染色 离体​
   1. 对于 离体 应用时，使用从4周龄雌性Balb/c小鼠新鲜分离的组织样本。
   2. 实验当天，通过断头法处死一只小鼠，迅速解剖取出结肠（大肠）片段，大小约10 mm。立即用PBS缓冲液清洗，放入添加了10 mM Hepes缓冲液（pH 7.2）的DMEM培养基中，并在37 °C下孵育³⁶.
   3. 将活体组织样本转移至微型培养皿中，加入2 mL含1 mg/mL NanO2-IR探针的完全DMEM，确保覆盖肠组织浆膜面，于37 °C孵育30分钟。
      注意：死后组织中的细胞在培养条件下可保持活性数小时。NaNO2-IR 具有轻微细胞毒性，因此所有实验均在组织分离后 4 小时内完成。
   4. 对于深层组织管腔内 离体 染色后，将肠段转移至干燥的培养皿中，并用滤纸吸去多余的DMEM。
   5. 注射含1 mg/mL NanO2-IR的DMEM溶液1 µL³⁵ 使用 Hamilton 注射器将样品注入管腔，并将样品孵育 15 分钟或最长 4 小时。
      注意：NaNO2-IR 具有轻微的长期细胞毒性作用；因此，所有实验应在组织分离后 4 小时内完成。
2. 活体动物中染色肿瘤组织的制备
   1. 对于 体内 应用：在含0.05 mg/mL NaNO2-IR探针的无血清培养基中，对CT26细胞预染色18小时。
   2. 取一只小鼠，剃除其右侧 flank 部位的毛发，用注射器注射 200 µL 含 1 × 10⁵ 未染色细胞和 1 × 10⁵ 经NanO2-IR预染色的细胞
   3. 让肿瘤在小鼠体内生长，定期使用游标卡尺监测肿瘤大小，并监测动物体重³⁷移植肿瘤的动物在肿瘤生长第七天即可进行成像。
      注意：肿瘤体积使用以下公式计算：(1):
      V = (L × W²)/2     (1)
      ​其中 L 是肿瘤的直径，且 W i垂直于直径的直径 L.
   4. 成像前通过颈椎脱位法处死动物。

2. PLIM 成像系统设置

1. 取 Cricket 适配器，卸下其背面的 C 接口适配器，以接触内部的像增强器外壳。将 MCP-125 像增强器插入该腔室，然后重新装回 C 接口适配器。
2. 移除 Cricket 设备前端的 C 接口适配器，插入 760 nm ± 50 nm 发射滤光片，然后重新装回 C 接口适配器以固定滤光片。
3. 将 Tpx3Cam 相机模块连接到 Cricket 模块的背面 通过 其C型接口适配器
4. 将镜头连接到 Cricket 模块的前端 通过 其C型接口适配器。
5. 将整个相机组件安装在光学黑箱顶部，镜头朝下，对准用于放置待成像样品的载物台（图1).
6. 将624 nm高亮度LED安装在连接至黑盒内面包板的支架上。
7. 将LED连接至电源和脉冲发生器。打开LED电源，并调节聚焦，以确保对成像样品进行有效且均匀的激发。
8. 将相机连接至另一个脉冲发生器，并同步发送至相机和LED的脉冲信号³⁸.
9. 使用 Cricket 装置上的专用电缆和插口，将增压器连接至标准电源，并设置 增益 到 2.7 V.
10. 利用镜头和Cricket适配器的聚焦功能，将相机光学系统对焦于样品台，以获得对比度和亮度良好的清晰样品图像。
11. 对于使用Pt-卟啉染料的成像，将Cricket模块中的625 nm LED更换为390 nm LED用于激发，并将760 nm ± 50 nm滤光片更换为650 nm ± 50 nm滤光片。

3. 图像采集

1. 将样品置于相机镜头前方。
   注意：使用可调节x-y-z轴的载物台作为样品 holder，以便调整样品位置以获得良好的聚焦。
2. 关闭房间内的所有灯光。
3. 打开 Sophy 软件以调节操作参数，例如聚焦和样品对准。
   注意：Sophy 软件随相机一并提供，用于设置成像参数并记录数据。请通过检查相机代码确认软件已与相机连接。然而，我们使用了另一种程序进行数据采集。
4. 在 模块，选择 无限帧，并设置 像素操作模式 到 阈值以上时间.
5. 在 模块，前往 预览，并选择 活性模块。这打开了 Medpix/Timpix 帧 窗
6. 在此窗口中，更改 颜色标尺，以及 旋转 将图像调整至所需的方向。
7. 打开增压器，并开始记录。
   注意：使用 Sophy 软件的记录界面，通过视觉确认样品的对齐和聚焦状态，并优化记录时的 LED 激发参数。
8. 停止录制，并关闭 Sophy 软件。
9. 前往 末端，并使用定制软件以二进制格式采集原始数据并进行后续处理（https://github.com/svihra/TimePix3）。
   1. 在 末端，运行以下命令以记录数据：
      Cd 文档/SPIDR/主干/发布/
       ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {文件名} - t {采集时间}
      注意：输入时 "ls," 检查当前目录中的文件列表；确认可见 Tpx3daq。
   2. 等待所有帧记录完成。
   3. 要处理数据，请运行以下命令： 末端
      cd 文档/数据处理/Timepix3/Timepix3/
      根
      .dataprocess.cpp++
      ​.x DRGUI.C
   4. 等待一个 RRGui 窗口将打开。选择左侧的所有变量 所有数据, 单文件，以及 质心 在右侧。
   5. 选择要处理的文件并运行数据缩减程序。
      ​注意：所有处理后的文件将与原始文件位于同一文件夹中。

4. 数据分析

1. 使用用C语言编写的专用程序分析后处理数据，该程序可将数据写入.ics图像文件（https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam）。
2. 使用免费提供的Time Resolved Imaging软件打开.ics图像文件（见材料表）。采用双指数函数拟合磷光衰减曲线。
3. 使用可用的图像分析软件打开拟合后的.ics图像文件（见材料表）。
4. 通过使用查找表，生成磷光寿命图像，并以伪彩色尺度进行编码（例如，短寿命用蓝色表示，长寿命用红色表示）。利用测量功能计算整个图像或特定感兴趣区域（ROIs）的平均寿命值。
5. 根据探针对O₂校准拟合所得方程，将寿命值转换为氧气浓度³⁶。
   注意：本研究使用了方程（2）：
   O₂ [µM] = −86.16 + 770.35 × e^{−0.049 × LT}     （2）

结果

对于 离体 成像应用中，将NanO2-IR探针局部施用于肠组织浆膜侧以染色组织片段。为实现更深的染色，向肠腔内注射1 µL探针。在此情况下，0.2–0.25 mm厚的肠壁会遮挡探针，使其无法被相机检测。上述两种染色过程如图所示。 图2A.

所得的强度和PLIM图像如图所示 图2B-G颜色明显反映了寿命值的差异，从而反映出组织浆膜侧与黏膜侧氧合状态的差异。 图 2C 和 图 2D 参考经局部染色的相似组织样本图2C）以及管腔内（图 2D）。与预期一致，组织显示出相似的PLIM模式。然而，组织黏膜侧的管腔内染色（<...

讨论

上述方案详细描述了新型成像仪的组装及其在微秒级荧光寿命成像（FLIM）/磷光寿命成像（PLIM）模式下的操作。基于时间相关单光子计数（TCSPC）技术的新一代Tpx3Cam相机，通过光学机械适配器Cricket与图像增强器、发射滤光片和远距镜头相连接，构成一个稳定、紧凑且灵活的光学模块，操作简便。该成像仪已在多种不同样品和分析任务中表现出良好的性能，包括磷光材料的表征和活体组织氧（O₂）成像。成像实验中使用了基于近红外Pt(II)-苯并卟啉的可透过细胞膜的可溶性探针NanO2-IR，以及基于红色发射Pt(II)-卟啉的固态传感器。这些传感器因其大的斯托克斯位移、长发射寿命、高灵敏度、快速响应和良好的光化学稳定性，已成功用于基于荧光猝灭原理的氧气（O₂）检测。

在宏观成像仪上测试这些不同的对 O₂ 敏感的探针和固态涂层时，所得结果与先前发表的数据一致⁴⁰。这些材料在温度和氧合状态等环境条件变化时，表现出良好的均匀性、对比度以及寿命响应。将这些结果与共聚焦 TCSPC-PL...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
627 nm LED	Parts Express		可根据传感器的激发波长更换为其他LED。Pt-卟啉染料使用390 nm LED。
760 ± 50 nm 发射滤光片	Edmund Optics	84-788	可根据传感器的发射波长更换为其他滤光片。Pt-卟啉染料使用650 ± 50 nm 带通滤光片。
Balb/c小鼠	Envigo, 英国	Balb/c
黑色屏蔽箱	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket适配器	Photonis	Cricket-2
CT26细胞	ATCC	CT26.WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	也可使用其他培养基
ImageJ软件	ImageJ		免费图像分析软件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125带P47磷屏的图像增强器	Photonis	PP0360EF
小型培养皿	Sarstedt	83.3900.300	直径35 mm
75微米厚Mylar塑料薄膜	RS Ireland	785-0795	也可使用其他塑料基底
NanO2-IR	自制	n/a	探针可根据已发表的方法合成：“Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.”，或由本实验室提供。
NMV-50M11” 50 mm镜头	Navitar		可使用其他兼容C接口适配器的镜头
光学面包板	Thorlabs	MB1836
培养皿	Sarstedt	82.1472.001	直径92 mm
电源	Tenma	72-10495
脉冲发生器	Tenma	TGP110
Sophy	Amsterdam Scientific Instruments	n/z	由ASI随Tpx3Cam一并提供
Tpx3Cam	Amsterdam Scientific Instruments	TPXCAM
Tri2软件	牛津大学	n/a	免费时间分辨成像软件，可从以下网址下载：https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ平移台	Thorlabs	LT3