用于生物医学应用的荧光寿命宏成像仪

摘要

本文介绍了一种新型快速光学成像仪在长衰减发射样品宏观光致发光寿命成像中的应用。文中描述了该成像仪的集成、图像采集与分析流程，以及用于成像的传感器材料的制备与表征，并展示了该成像仪在生物样品研究中的应用。

摘要

本文介绍了一种新型光致发光寿命成像仪，旨在绘制分子氧（O₂）在生物组织和材料中的空间分布图。该系统结合了高灵敏度时间相关单光子计数技术与快速扫描光学显微成像，能够以微米级空间分辨率和纳秒级时间分辨率实现非侵入性、实时的氧浓度动态监测。通过检测磷光探针的发光衰减特性，该成像仪可量化局部氧分压，并适用于活体组织、细胞培养及功能性材料的研究。文中详细描述了仪器的设计原理、校准方法及典型应用案例，包括肿瘤模型中缺氧区域的可视化和光催化材料表面反应活性的表征。该技术为生理学、病理学及材料科学领域提供了高精度的氧传感解决方案。 关键词：光致发光寿命成像，分子氧，O₂，时间相关单光子计数，缺氧成像，磷光探针，氧传感，生物组织成像，功能材料分析₂)浓度在不同磷光样品中的变化，涵盖固态、O₂-对用可溶性O染色的活体动物组织样本的敏感涂层₂-敏感探针。特别是使用了基于纳米颗粒的近红外探针NanO2-IR，该探针可由625 nm发光二极管（LED）激发，并在760 nm处发射信号。成像系统基于Timepix3相机（Tpx3Cam）和光学-机械适配器构建，后者还包含一个图像增强器。O₂ 磷光寿命成像显微技术（PLIM）在多种研究中常被需要，但现有平台在准确性、通用灵活性和易用性方面存在局限性。

本文介绍的系统是一种基于集成光学传感器与读出芯片模块Tpx3Cam的快速、高灵敏度成像仪。该系统可从表面染色的肠组织样本或结肠腔内染色片段中产生高强度的磷光信号和稳定的寿命值，实现对组织氧合状态的精细 mapping₂ 水平在约20秒或更短时间内完成。本文还展示了在无意识动物体内移植肿瘤的缺氧成像方面的初步实验结果。我们还描述了如何对成像仪进行重新配置以用于O₂基于Pt-卟啉染料的对氧敏感材料，采用390 nm LED作为激发光源，650 nm带通滤光片用于发射光检测。总体而言，PLIM成像系统能够对所用探针的寿命值进行准确的定量测量，并生成相应的二维O₂分布图₂ 浓度。它也适用于代谢成像 离体 组织模型和活体动物。

引言

O₂ 是生命系统的关键环境参数之一，了解 O₂ 的分布及其动态变化对许多生物学研究具有重要意义^1,2,3。利用磷光探针^4,5,6,7,8 和荧光寿命成像显微技术（PLIM）^{9,10,11,12,13} 评估组织氧合状态在生物和医学研究中正日益受到关注^3,9,14,

方案

所有涉及动物的操作均在爱尔兰健康产品监管局（HPRA）签发的许可下进行，符合欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）的要求，并经科克大学动物实验伦理委员会批准。

1. 样品制备

1. 活体组织样本的探针染色 离体​
   1. 对于 离体 应用时，使用从4周龄雌性Balb/c小鼠新鲜分离的组织样本。
   2. 实验当天，通过断头法处死一只小鼠，迅速解剖取出结肠（大肠）片段，大小约10 mm。立即用PBS缓冲液清洗，放入添加了10 mM Hepes缓冲液（pH 7.2）的DMEM培养基中，并在37 °C下孵育³⁶.
   3. 将活体组织样本转移至微型培养皿中，加入2 mL含1 mg/mL NanO2-IR探针的完全DMEM，确保覆盖肠组织浆膜面，于37 °C孵育30分钟。
      注意：死后组织中的细胞在培养条件下可保持活性数小时。NaNO2-IR 具有轻微细胞毒性，因此所有实验均在组织分离后 4 小时内完成。
   4. 对于深层组织管腔内 离体 染色后，将肠段转移至干燥的培养皿中，并用滤纸吸去多余的DMEM。
   5. 注射含1 mg/mL NanO2-IR的DMEM溶液1 µL³⁵ 使用 Ha....

结果

对于 离体 成像应用中，通过在组织浆膜侧局部施加NanO2-IR探针对肠组织碎片进行染色。为实现更深的染色， 1 µL 探针被注入管腔内。在后一种情况下，0.2–0.25 mm 厚的肠壁将探针与相机隔开。这两种染色过程在下文展示。 图 2A.

所得的强度和PLIM图像如下所示 图 2B-G颜色明显反映了寿命值的差异，因而反映了组织浆膜侧与黏膜侧氧合状态的差异。 图2C 和 图 2D 参考经局部染色的相似组织样本（图 2C）以及管腔内（图 2D）。与预期一致，组织显示出相似的PLIM模式。然而，组织黏膜侧的管腔内.......

讨论

上述方案详细描述了新型成像仪的组装及其在微秒级荧光寿命成像（FLIM）/磷光寿命成像（PLIM）模式下的操作。基于时间相关单光子计数（TCSPC）技术的新一代Tpx3Cam相机，通过光学机械适配器Cricket与图像增强器、发射滤光片和远距镜头相连接，构成一个稳定、紧凑且灵活的光学模块，操作简便。该成像仪已在多种不同样品和分析任务中表现出良好的性能，包括磷光材料的表征和活体组织氧（O₂）成像。成像实验中使用了基于近红外Pt(II)-苯并卟啉的可透过细胞膜的可溶性探针NanO2-IR，以及基于红色发射Pt(II)-卟啉的固态传感器。这些传感器因其大的斯托克斯位移、长发射寿命、高灵敏度、快速响应和良好的光化学稳定性，已成功用于基于荧光猝灭原理的氧气（O₂）检测。

在宏观成像仪上测试这些不同的对 O₂ 敏感的探针和固态涂层时，所得结果与先前发表的数据一致⁴⁰。这些材料在温度和氧合状态等环境条件变化时，表现出良好的均匀性、对比度以及寿命响应。将这些结果与共聚焦 TCSPC-PL.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
627 nm LED	Parts Express		可根据传感器的激发波长更换为其他LED。Pt-卟啉染料使用390 nm LED。
760 ± 50 nm 发射滤光片	Edmund Optics	84-788	可根据传感器的发射波长更换为其他滤光片。Pt-卟啉染料使用650 ± 50 nm 带通滤光片。
Balb/c小鼠	Envigo, 英国	Balb/c
黑色屏蔽箱	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket适配器	Photonis	Cricket-2
CT26细胞	ATCC	CT26.WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	也可使用其他培养基
ImageJ软件	ImageJ		免费图像分析软件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125带P47磷屏的图像增强器	Photonis	PP0360EF
小型培养皿	Sarstedt	83.3900.300	直径35 mm
75微米厚Mylar塑料薄膜	RS Ireland	785-0795	也可使用其他塑料基底
NanO2-IR	自制	n/a	探针可根据已发表的方法合成：“Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.”，或由本实验室提供。
NMV-50M11” 50 mm镜头	Navitar		可使用其他兼容C接口适配器的镜头
光学面包板	Thorlabs	MB1836
培养皿	Sarstedt	82.1472.001	直径92 mm
电源	Tenma	72-10495
脉冲发生器	Tenma	TGP110
Sophy	Amsterdam Scientific Instruments	n/z	由ASI随Tpx3Cam一并提供
Tpx3Cam	Amsterdam Scientific Instruments	TPXCAM
Tri2软件	牛津大学	n/a	免费时间分辨成像软件，可从以下网址下载：https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ平移台	Thorlabs	LT3