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方法文章

接触性超敏反应作为过敏性接触性皮炎的小鼠模型

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DOI：

10.3791/64329

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2022年9月26日

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

本文内容

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摘要

接触性超敏反应（CHS）是一种小鼠过敏性接触性皮炎（ACD）的实验模型。该模型通过在小鼠剃毛的胸腹部皮肤上涂抹反应性半抗原进行致敏，随后以稀释的半抗原对耳部皮肤进行激发，从而引发肿胀反应，并通过多种方法对反应程度进行评估。

摘要

接触性超敏反应（CHS）是一种可在小鼠中研究的变应性接触性皮炎（ACD）的实验模型。本研究旨在介绍一种客观的实验室方法，有助于对小鼠的CHS反应进行研究，并可通过多种检测手段进行测量和量化。为诱导CHS，于第“0”天，在小鼠腹部预先剃毛的区域，使用丙酮-乙醇混合溶剂中的半抗原2,4,6-三硝基氯苯（TNCB）进行皮肤涂抹致敏；而阴性对照组小鼠则仅用溶剂（丙酮-乙醇混合液）进行假致敏处理。第“4”天，在测试组和对照组小鼠双耳涂抹稀释的TNCB以激发CHS（攻击）之前，先用千分尺测量基础耳厚度。24小时后，再次用千分尺测量耳部肿胀程度。CHS是一种由T细胞介导的免疫反应，其特征是在用相同半抗原进行皮肤攻击后约24小时，炎症组织出现肿胀并达到高峰。耳部水肿的增加与耳组织重量增加、髓过氧化物酶（MPO）活性升高、耳组织提取物中促炎性细胞因子浓度上升、组织学检查中水肿性真皮层增厚以及耳部血管通透性增强相关。此外，与对照组小鼠相比，实验组小鼠血清中TNP特异性IgG1抗体浓度也有所升高。另外，CHS还可通过将先前经TNCB致敏供体小鼠获得的CHS效应细胞成功转移至受体小鼠而实现。这些CHS效应细胞经静脉注射至未经致敏的受体小鼠体内，随后用相同的稀释半抗原进行攻击，并于24小时后用千分尺测量耳部肿胀程度。

引言

变应性接触性皮炎（ACD）是一种在工业化国家常见的皮肤炎症性疾病，由暴露于称为半抗原的低分子量化学物质引发的IV型超敏反应所致。导致人类接触致敏的物质包括重金属离子（铬、镍、铁、钴）、松节油、香料、染料以及化妆品中的防腐剂（例如对苯二胺），某些药物（例如新霉素、苯佐卡因）、β-内酰胺类抗生素（即青霉素）、植物产生的化学物质（如漆树中存在的十五烷儿茶酚），以及摄影工业中使用的氢醌1,2。ACD的病因物质种类极为广泛，仅工业领域就使用了超过10万种化学物质，每年还有约2000种新化合物被合成。迄今为止，已鉴定出3700多种可能具有接触性半抗原/致敏原作用的分子3。接触性超敏反应（CHS）是ACD的一种实验模型，可在小鼠、豚鼠和大鼠中进行研究，通常通过将反应性化学半抗原溶解于有机溶剂后局部涂抹于皮肤来诱导4,5,6。本研究旨在描述一种客观的实验室方法，可用于研究小鼠中的CHS反应，并可通过多种检测手段进行测量和定量分析。

接触性超敏反应（CHS）包括致敏（诱导）和效应（激发）两个阶段。在动物模型中，半抗原首先与体内蛋白质共价结合，形成新抗原。在致敏阶段，活化的角质形成细胞通过产生促炎性细胞因子——肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β），促进皮肤树突状细胞（sDCs）的迁移和成熟7。表皮朗格汉斯细胞（LCs）在CHS的诱导期和效应期均参与抗原提呈8。在致敏阶段接触半抗原的LCs可促进调节性T细胞和效应T细胞的诱导9。越来越多的研究证据表明，CHS反应可由多种T细胞介导：包括CD4+ MHC II类分子限制性的Th1细胞，其局部释放干扰素-γ（IFN-γ），引发特征性的炎性浸润；CD8+ MHC I类分子限制性的Tc1淋巴细胞，也可释放IFN-γ，但主要介导对角质形成细胞的细胞毒性损伤；以及近年来发现的可产生白细胞介素17（IL-17）的Th17细胞10,11。

采用多种物种的几种不同CHS模型12,13,14 并已开发出多种半抗原（不同半抗原、溶剂及应用时间的详细比较总结于 表1）。小鼠作为一种常用的实验动物，在研究接触性超敏反应（CHS）方面具有若干优势。与其他物种相比，小鼠拥有更多的品系、基因敲除（KO）模型和转基因动物，使其成为极具吸引力的实验动物15此外，CHS 模型需要使用大量动物，而小鼠在此方面更具经济性。动物模型并不能在所有方面完全模拟 ACD；特别是，动物常出现结痂和脱屑，这在人类中并不常见。16,17慢性疾病特征的再现具有挑战性，主要原因是所述模型并未假设长期使用半抗原。然而，本文已证实，许多变应性接触性皮炎（ACD）的关键特征得到了再现。研究还表明，与人类相似，这些特征与局部过敏反应相关。本方案中半抗原的选择、溶剂及其应用方式的确定，是基于这些结果已被大量研究证实的事实 体外 测试，并在实验室中经过多年的测试和修改，直至确定当前版本。小鼠模型可用于分析参与获得性免疫缺陷综合征（ACD）发展的细胞亚群或细胞因子，对于新疗法的临床前评估至关重要。

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方案

本文所述所有实验均按照克拉科夫第一动物实验伦理委员会的指南进行。所描述的所有操作均遵循当地建议，特别是使用氯胺酮/赛拉嗪作为麻醉剂、使用双耳涂抹物质/半抗原、剪除耳朵以及通过眼球摘除采集血液。本研究使用了6至12周龄的BALB/c（单倍型H-2d）、CBA/J（H-2k）和C57BL/6（H-2b）品系的雄性和雌性小鼠（参见材料表）。为确保统计学显著性，每组小鼠数量最好为10至12只。

1. 动物准备

  1. 所有操作前后均需使用70%乙醇溶液清洁操作台。若使用需要无菌条件的小鼠，所有操作均应在生物安全柜中进行。

2. 小鼠标记以用于识别

  1. 使用剃刀刮除皮肤上的毛发来标记小鼠：#0 - 无标记，#2 - 右前爪，#3 - 右侧，#4 - 右后爪，#5 - 尾根部，#6 - 左后爪，#7 - 左侧，#8 - 左前爪。
    ​注意：由于存在诱导反应，无法通过剪耳或耳标等传统方法对小鼠进行标记。标记过程中未对小鼠进行麻醉。

3. CHS 的诱导

注意：该操作流程如图1所示。

  1. 按照以下步骤进行致敏（诱导）。
    1. 在第“0”天，使用肥皂和水清洁小鼠胸部和腹部（面积为2 cm × 2 cm），并用剃须刀片剃毛。
      注意：在施加半抗原前，需等待6小时，以确保皮肤无刺激。
    2. 配制5%半抗原溶液：将2,4,6-三硝基氯苯（TNCB，参见材料表）溶于丙酮-乙醇混合液（比例为1:3）中，或仅使用溶剂对照（丙酮-乙醇）。使用前在玻璃小瓶中现配，并用铝箔包裹小瓶以避光保存。
    3. 同一天，将150 µL的5%半抗原溶液涂抹于已剃毛的区域，对小鼠进行致敏。在对照组小鼠中，仅涂抹溶剂以评估非特异性炎症反应。在将动物放回笼子前，等待30秒，使半抗原充分干燥。
      警告：操作时需佩戴手套；TNCB可引起大多数人的严重过敏反应。
  2. 进行激发（攻击）及耳肿胀测量。
    1. 在第“4”天，配制0.4%半抗原溶液：将TNCB溶于丙酮:橄榄油 混合液（比例为1:1）中。使用前在玻璃小瓶中现配，并用铝箔包裹小瓶以避光保存。
    2. 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（90–120 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）混合液对小鼠进行深度麻醉（参见材料表）。通过夹捏脚趾确认小鼠已完全麻醉，且持续时间不少于5分钟。
    3. 由不了解实验分组的观察者使用千分尺（参见材料表）测量耳部厚度（0小时测量值，作为基线）。
    4. 在实验组和对照组小鼠的双侧耳部各涂抹10 µL的0.4%半抗原溶液。在将动物放回笼子前，等待30秒，使半抗原充分干燥。
    5. 在第“5”天，即半抗原处理后24小时，重复步骤3.2.2–3.2.3，进行24小时时间点的测量。
    6. 通过计算激发前后耳廓厚度的差值来评估接触性超敏反应（CHS）：24小时耳厚（µm）减去0小时耳厚（µm）。每只耳朵视为独立的测量单位。随后以微米（µm）±均值标准误（SEM）表示耳肿胀程度（表2，图3）。

4. 耳部活检

  1. 在测量耳厚度24小时后（此时小鼠仍处于深度麻醉状态），用剪刀尽可能贴近颅骨将耳朵剪下。使用6 mm直径的皮肤活检打孔器（见 材料表).
    1. 测量耳重（步骤 4.2），并针对同一耳组织活检样本额外进行以下其中一项检测：髓过氧化物酶（MPO）活性测定（步骤 4.3）或 体外 耳组织提取物中细胞因子浓度的测定（例如，IFN-γ，IL-17A，TNF-α [步骤 4.4]
      注意：在采血前剪下耳朵。此操作后，必须对小鼠实施安乐死（例如，通过颈椎脱位法）。
  2. 使用分析天平测量每份耳部活检组织的重量，并以毫克（mg）表示图4).
  3. 按照以下步骤进行MPO检测。
    1. 通过将0.5%十六烷基三甲基溴化铵溶解于50 mmol磷酸盐缓冲液KH中，制备匀浆缓冲液2PO4/Na2HPO4 并将pH值调节至6.0（室温使用，RT）。
    2. 在2 mL微量离心管中，将活检组织与500 µ使用5毫米直径的不锈钢珠（每管加入两颗珠子）在均质器中处理10分钟（每管加入适量制备好的缓冲液）（参见 材料表。接着，将样品在 4 ℃ 下冷却 15 分钟 °C并额外匀浆10分钟。
      注意：微量离心管具有圆形底部，以便磁珠易于移动。
    3. 将匀浆在 −20 ℃ 冷冻 °在 30 分钟内升温至 C。解冻并涡旋振荡（确保样品完全解冻）。重复此步骤 3 次。
    4. 将匀浆在 3,000 x g 4℃下孵育30分钟 °C. 用移液器收集上清液。以每1 mg蛋白质所含的单位（U）表示MPO活性。
      注意：此处可暂停实验流程。样品在 −20 °C 条件下稳定 °3个月，4℃
    5. 为了测定MPO活性，通过混合20 µ上清液L和200 µMPO底物溶液（50 mmol KH中含0.167 mg/mL邻甲氧基联苯胺二盐酸盐）的L2PO4/Na2HPO4 缓冲液与5 x 10−4% H202）加入至96孔平底板中，在室温下孵育20分钟。
    6. 使用20制备标准曲线 µ0.008 U 至 0.5 U 浓度范围内的 MPO 标准品，每份 200 L µMPO底物的L。仅使用MPO底物制备空白样品。
      警告：使用邻二茴香胺二盐酸盐时需佩戴口罩。
      注意：平板必须由聚丙烯制成，因为聚丙烯的结合能力较低，可防止蛋白质或DNA发生非特异性结合。
    7. 在波长为 λ = 460 nm。酶反应在10分钟内保持稳定。根据标准曲线读取待测样品中的MPO活性。
    8. 为测定蛋白质浓度，使用 20 µ上清液的L，使用双辛可宁酸试剂盒进行蛋白质测定（参见 材料表），并在指定波长下测定吸光度（OD） λ = 562 nm (图5).
  4. 执行 体外 耳组织提取物中细胞因子的测定
    1. 在室温下，将耳部活检组织置于含有500 μL裂解缓冲液的2 mL微量离心管中匀浆 µ使用含有直径为5 mm不锈钢珠（每管加两颗珠子）的匀浆器，加入组织蛋白提取试剂（T-PER）匀浆10分钟。随后，将样品在4℃冷却15分钟 °C，再匀浆10分钟。
      注意：微量离心管具有圆底，以便磁珠能够自由移动。
    2. 将匀浆在 3,000 x g 4℃下孵育30分钟 °C.
      ​注意：此处可暂停实验流程。样品在 −80 °C 条件下稳定保存 °C，持续6个月。
    3. 使用市售的ELISA试剂盒（例如IFN-γ）（参见 材料表）按照制造商的说明进行（图6).

5.  耳组织的组织学

  1. 在测量耳厚度24小时后，当小鼠仍处于深度麻醉状态时，用剪刀尽可能靠近头骨处剪下耳朵（步骤4.1）。
    注意：此操作后必须对小鼠实施安乐死（例如通过颈椎脱位）。
  2. 按照以下步骤对组织块进行石蜡包埋。
    1. 取出耳朵后立即放入约10 mL的10%福尔马林中固定24小时。
    2. 将耳朵放入组织处理盒中，将处理盒置于自动组织处理机（见材料表）中进行脱水（70%、90%、100%乙醇，各30分钟，室温）、透明（二甲苯，3次，每次30分钟，室温）和浸蜡（石蜡，3次，每次30分钟，56 °C）程序。
    3. 将处理盒从自动组织处理机中取出，放置于温热板上备用。用分配器中的温热石蜡填充石蜡模具。
    4. 用预热的镊子将组织从处理盒中取出并放入模具中；随后将处理盒底座盖在模具上方，再加入更多石蜡。将其置于冷板上的冰水中冷却30分钟，使石蜡凝固形成包含样本的蜡块。
    5. 使用旋转式切片机（见材料表）切取约5 µm厚的切片。将切片漂浮于温水浴中展平，然后用载玻片捞起切片。在室温下干燥，以确保切片牢固附着于载玻片上。
      注意：使用无需额外涂覆粘附剂或蛋白涂层即可防止染色过程中组织脱落的载玻片。
  3. 进行苏木精-伊红（H&E）染色。
    1. 准备17个染色缸，分别装入以下试剂：二甲苯（4个缸）、100%乙醇（无水乙醇）（4个缸）、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、磷酸盐缓冲液（PBS）（3个缸）、苏木精染液、伊红染液。按照以下步骤依次将玻片转移至各染色缸中，所有步骤均在室温下进行。
      注意：每个染色缸中的试剂可重复使用约10次（例如，若使用可容纳20张玻片的染色缸，则可在不更换液体的情况下完成200次染色）。
    2. 将玻片置于65 °C恒温箱中孵育30分钟以脱蜡。随后将玻片浸入二甲苯中30分钟，再换新二甲苯重复一次，每次30分钟。
    3. 将玻片浸入100%乙醇中5分钟，换新100%乙醇重复一次，每次5分钟。然后依次将玻片浸入90%、80%、70%和50%乙醇中，每个浓度浸泡2分钟。
    4. 将玻片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中5分钟。用吸水纸擦去组织周围及玻片背面多余的液体。
    5. 将切片浸入苏木精染液（见材料表）中染色7–8分钟。从玻片背面用流水冲洗30秒，避免损伤组织切片。重复步骤5.3.4。
    6. 将切片浸入伊红染液（见材料表）中染色30秒。按步骤5.3.5所述方式冲洗，然后重复步骤5.3.4。
    7. 将玻片浸入100%乙醇（无水乙醇）中2分钟，换新100%乙醇重复一次，每次2分钟。
    8. 将玻片浸入二甲苯中5分钟，换新二甲苯重复一次，每次5分钟。
    9. 在室温下自然干燥15分钟。在盖玻片上滴加一滴封片剂（见材料表），然后将其覆盖在组织切片上。
  4. 在光学显微镜下以20倍或40倍放大倍数观察切片，并采集图像（图7）。

6. 血管通透性检测

注意：除了耳部厚度测量外，还可进行血管通透性检测。

  1. 第0天致敏小鼠 "0" （步骤 3.1.1–3.1.3），然后在第几天 "4"，麻醉小鼠（步骤 3.2.2）后直接在耳朵上涂抹半抗原（步骤 3.2.4），省略 0 小时耳部测量。
  2. 在攻毒后23小时，对小鼠进行麻醉（步骤3.2.2）。
  3. 静脉注射（i.v.）8.3 µ每克体重给予1%伊文思蓝染料（见 材料表) 在 Dulbecco 中′磷酸盐缓冲液（DPBS）
  4. 在伊文思蓝注射1小时后，再次对小鼠进行深度麻醉（步骤3.2.2）。
  5. 采集耳部组织活检样本（步骤 4.1）。
    注意：此操作步骤完成后，必须对小鼠实施安乐死（例如，通过颈椎脱位法）。
  6. 从组织中提取染料，将耳缘组织碎片放入含有1 mL甲酰胺的离心管中，于37℃孵育 °C，置于5% CO₂的气体环境中2 18小时。
  7. 将活检样本在3,000 x g下离心 g 室温孵育3分钟。用移液器收集上清液。
  8. 在特定波长下测定 OD λ 在96孔平底板中，以含甲酰胺的空白孔为对照，在565 nm处测定吸光度。颜色在24小时内保持稳定。根据标准曲线读取待测样品的浓度（使用伊文思蓝浓度范围为0.2–30） µg 染料/mL 甲酰胺) (图8).
    ​注意：平板必须由聚丙烯制成，因为聚丙烯的结合能力较低，可防止蛋白质或DNA发生非特异性结合。

7. 血清采集及抗TNP免疫球蛋白（IgG1）抗体检测

  1. 在采集耳组织样本（步骤4.1）后，当小鼠仍处于深度麻醉状态时，用镊子摘除眼球，轻轻按压小鼠，将血液从眶后窦收集至管中（含凝胶的采血管，用于获取血清，参见 材料表）。另一种采血方法可能是用注射器穿刺心脏来采集血液。
    注意：必须在切除耳朵后采集血液。由于不同放血方法可能导致血液参数存在差异，因此在整个研究过程中必须采用相同的采血方法。18完成该操作后，必须对小鼠实施安乐死（例如，通过颈椎脱位法）。
  2. 倒置至少6次，静置30分钟使血液凝固，然后在1,300–2,000 × g条件下离心 g 室温下孵育10分钟。
    注意：此处可暂停实验流程。样品在 −20 °C 条件下稳定。 °6个月，温度为C。
  3. 用50 μL将96孔平底板包被 µ10 μg/mL 浓度的2,4,6-三硝基苯基-牛血清白蛋白（TNP-BSA）溶于DPBS中的溶液 µ微克/毫升。接下来，用溶解于DPBS中的牛血清白蛋白（BSA）单独包被第二块板（背景），浓度为10 µg/mL。4℃下孵育过夜 °C.
    注意：小鼠血清中含有针对BSA的抗体（Abs），因此样本需在两种平板上进行检测，随后进行计算（OD TNP-BSA - OD BSA）。
  4. 用 300 洗涤平板 µ含0.05% Tween 20的DPBS溶液洗涤3次。
  5. 配制检测稀释液（AD）：含1% BSA的DPBS。用AD在室温下封闭孔板1小时。再次洗涤（步骤7.4）。
  6. 制备内标品（iSTD）：用TNCB对小鼠进行致敏（步骤3.1.1–3.1.3），致敏后第10天，采集所有供体的血清并混合（步骤7.1和步骤7.2）。
  7. 向平板中加入 50 µ用于制作标准曲线的iSTD梯度浓度溶液，用AD稀释（如所述） 表3）。向孔板中加入 50 µL 血清样本。每个样本和标准曲线均需在两块板上进行检测（TNP-BSA 包被板和 BSA 包被板），室温孵育 2 小时。洗涤平板（步骤 7.4）。
  8. 加入50 µ生物素标记的抗小鼠IgG1单克隆抗体（mAb，参见 材料表) 用 AD 按 1:250 稀释，室温孵育 1 小时。再次洗涤（步骤 7.4）。
  9. 加入50 µ辣根过氧化物酶链霉亲和素（HRP 链霉亲和素，参见 材料表) 用 AD 以 1:2000 比例稀释，于室温避光孵育 30 分钟。洗板（步骤 7.4）。
  10. 加入50 µL 的 TMB 底物（参见 材料表）在室温避光孵育30分钟。
  11. 通过加入25终止酶促反应 µ1 M H的L2SO4；反应在30分钟内保持稳定。
  12. 在波长处测量 OD λ = 450 nm 处测定吸光度，并以 570 nm 处的读数作为空白背景（每个 450 nm 的测量值必须减去相应的 570 nm 背景值）。在展示结果时，需从样品和标准曲线的 TNP-BSA 测量值中减去 BSA 的测量值。随后，根据标准曲线计算抗体的单位（U）。图9).

8. CHS 效应细胞的过继转移

注意：此操作流程如图2所示。

  1. 供体（供体与受体比例为1:1）：于第0天用TNCB致敏小鼠 "0" （步骤 3.1.1–3.1.3）
  2. 第几天 "4"，对小鼠进行麻醉——深度麻醉（步骤 3.2.2）。
  3. 皮肤消毒后，进行分离 用镊子取下腋窝和腹股沟淋巴结（ALNs）以及脾脏（SPLs）。将ALNs放入一个离心管中，SPLs放入另一个离心管中，分别汇集。
    注意：每侧腋窝的胸肌后方各有一个腋淋巴结。髋部区域有一个腹股沟淋巴结，位于三条血管旁。 脾脏位于腹腔左侧，在肠道和胃的后方19确保操作区域已消毒，包括皮肤和毛发。使用无菌器械操作，包括无菌手套。 在生物安全柜中操作以维持无菌条件。此操作后，必须对小鼠实施安乐死（例如，通过颈椎脱位法）。
  4. 用载玻片的磨砂端轻轻研磨组织。将细胞悬液通过孔径为70 μm的细胞筛过滤 µ米（见 材料表).
  5. 用含1%胎牛血清（FBS）的DPBS洗涤细胞。在300 x g下离心 g 4℃下10分钟 °C. 吸去上清液，将剩余的细胞沉淀重悬于1-5.0 mL DPBS中。
  6. 使用血细胞计数板对活细胞进行计数20 用台盼蓝染色，并混合10 µ细胞悬液的 L 与 90-990 µL（根据细胞数量而定）的台盼蓝。计算细胞数量时需考虑稀释倍数（10–100 倍）。
  7. 制备ALNs与SPLs的混合物（比例1:1）：8.0 × 106 高达 7.0 x 107/小鼠 200只 µDPBS 溶液的体积
  8. 受体（ naive 同基因小鼠）：将 naive 受体小鼠麻醉（步骤 3.2.2），静脉注射预先制备的 CHS 效应细胞混合物（步骤 8.7）。在对照组小鼠中，不注射任何细胞。
  9. 在激发前（0 h）和激发后（24 h）测量耳部厚度（步骤 3.2.1–3.2.6）图10).
  10. 此外，对分离的CHS效应细胞进行检测（例如，通过流式细胞术分析细胞表型或测定CHS效应细胞产生的细胞因子）。也可建立细胞培养，评估CHS效应细胞在抗原存在下的增殖能力，或测定培养上清液中分泌的细胞因子含量。21,22 （数据未展示）。
    注意：进行额外检测需要相应增加细胞供体数量。

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结果

为诱导CHS，对动物进行致敏处理 通过 皮肤涂抹（腹部） 150 µL 5% TNCB 或仅用溶剂假致敏。在第4天，通过接触涂抹（激发）诱导双耳耳肿胀反应 10 µL 0.4% TNCB 对先前经 TNCB 接触致敏的小鼠（试验组）和假致敏小鼠（对照组）均进行了激发。结果显示，经 TNCB 致敏并在 4 天后接受激发的小鼠，其耳部肿胀程度显著高于同样接受激发但假致敏的小鼠（图3, 表2，测试组与对照组）。耳部肿胀结果在后续研究中得到完全验证，表明使用千分尺测定的耳水肿增加与耳重量增加相一致图4），MPO 活性（图5），耳组织提取物中IFN-γ浓度（图6），组织学检查中水肿性真皮增厚程度增加（图7）以及耳部血管通透性（图8)。与对照组...

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讨论

CHS 被诱导 通过 半抗原与皮肤中的自身蛋白抗原结合，形成新抗原。接触性超敏反应（CHS）由循环中抗原特异性的CHS效应T细胞在局部血管外募集所介导，导致再次接触相同半抗原的皮肤组织发生肿胀，肿胀程度在24小时达到高峰6组织肿胀主要由白细胞浸润及白细胞依赖性的纤维蛋白沉积引起。24这些变化可通过千分尺测量半抗原致敏并激发的小鼠与假致敏并激发的小鼠耳部肿胀程度来检测。

CHS 也可通过耳重量的比较来确定。随后，用于测定耳重量的耳片可用于进一步检测。发炎耳组织中的细胞浸润物主要包括产生细胞因子的 T 淋巴细胞和 MPO 阳性的中性粒细胞。在耳组织匀浆中，可检测多种参数，例如通过 ELISA 检测 MPO 活性或促炎细胞因子（如 TNF-α、IFN-γ、IL-17A 或其他因子）的浓度，或通过 qPCR 检测皮肤中细胞因子 mRNA 的表达25。此外，还可使用伊文思蓝试验评估血管通透性的变化...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由波兰弗罗茨瓦夫医科大学资助项目 SUBZ.A020.22.060 以及波兰科学与高等教育部授予 MS 的 N N401 545940 号基金和授予 MMS 的 IP2012 0443 72 号基金提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 乙醇德国达姆施塔特默克公司65350-M用于表面消毒
96孔平底板，聚丙烯Greiner Bio-One GmbH，克雷姆斯明斯特，奥地利655101用于MPO和伊文思蓝测定——应使用聚丙烯板，因其结合能力较低，可防止蛋白质或DNA发生结合
丙酮（ACS级试剂， ≥99.5%)德国达姆施塔特默克集团179124
铝箔德国达姆施塔特默克公司Z185140
分析天平Sartorius Weighing Technology GmbH，德国哥廷根PRACTUM224-1s，29105177
全自动组织处理仪MediMeas Instruments，萨尔谢赫里，哈里亚纳邦，印度MTP-E-212通过固定、脱水、透明和浸蜡等步骤自动制备组织样本
BD Vacutainer SST II Advance（含凝胶用于获取血清的采血管）美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿·迪金森公司（BD）BD 366882
用于蛋白质测定的双辛可宁酸试剂盒德国达姆施塔特默克公司BCA1-1KT
生物素标记大鼠抗小鼠IgG1美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿·迪金森公司（BD 生物科学）553441
BSA（牛血清白蛋白）德国达姆施塔特默克集团A9418蛋白质检测 &和分析，2 mg/mL
细胞滤筛，孔径70 μmBIOLOGIX，中国15-1070适用于50 mL离心管
盖玻片VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺631-158324 mm，但也可使用其他尺寸
一次性移液管容量：5 mL，10 mL，25 mL德国达姆施塔特默克集团Z740301, Z740302, Z740303
DPBS（Dulbecco）′磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline）赛默飞世尔科技  美国马萨诸塞州沃尔瑟姆14190144无钙，无镁，哺乳动物细胞培养
组织学用DPX封片剂德国达姆施塔特默克公司6522用于苏木精-伊红染色的封片介质，也可使用其他类型，例如加拿大树胶
Dumont 5号镊子——直头Animalab，波兹南，波兰11251-10FST用于小鼠手术的器械（应进行灭菌）
Dumont 7号镊子 - 弯型Animalab，波兹南，波兰11272-50FST用于小鼠手术的手术器械（应进行灭菌）
伊红Y醇溶液德国达姆施塔特默克集团HT110116
Eppendorf Safe-Lock 离心管 1.5 mL德国艾本多夫3,01,20,086聚丙烯
Eppendorf Safe-Lock 离心管，2.0 mL德国艾本多夫3,01,20,094聚丙烯，圆底（便于均质化珠移动）
乙醇 100%（绝对乙醇）德国达姆施塔特默克集团1.07017
乙醇 96%德国达姆施塔特默克公司1.59010
伊文思蓝德国达姆施塔特默克股份有限公司E2129
FBS（胎牛血清）美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司A3160802
中性缓冲福尔马林溶液，10%德国达姆施塔特默克集团HT501128
甲酰胺 99.5%（气相色谱级）德国达姆施塔特默克公司F7503
-20 冰箱 °C博世，德国GSN54AW30
冰箱 +4℃ °C / 冰箱 -20 °C博世，德国KGV36V10哺乳动物细胞培养，合格，巴西，10 × 50 mL
载玻片，SuperFrost PlusVWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449可避免使用粘合剂或蛋白质涂层，防止染色过程中组织切片丢失的载玻片。
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
灰色肥皂波勒纳·奥斯垂泽ów，家用化学品生产商 Sp. Z.o.o.，Sp. K.，波兰比亚利杰伦香皂灰色香皂条，天然低敏。常规可购产品
H2SO4 （硫酸）1 mol/L（1 M）德国达姆施塔特默克公司1.60313
Harris苏木精溶液默克股份公司，德国达姆施塔特HHS16
血细胞计数板VWR，Avantor，美国612-5719建议使用人工计数板，其准确性更高
十六烷基三甲基溴化铵德国达姆施塔特默克公司H5882
匀浆器QIAGEN 德国希尔登Tissue Lyser LT，序列号 23.1001/05234用于2 mL离心管的带不锈钢珠（直径5 mm）的均质器
辣根过氧化物酶链霉亲和素（HRP streptavidin）Vector Laboratories, Inc.，美国加利福尼亚州伯林盖姆SA-5004-1
过氧化氢溶液（H202)德国达姆施塔特默克集团H1009
Heracell 150i 培养箱德国 Thermo Electron LED Gmbh4107106837 oC，置于5% CO₂的气体环境中2，以及65 0组织学切片脱蜡步骤中的 C
氯胺酮 100 mg/mL，注射用溶液Biowet Pulawy Sp. z o.o.，波兰普瓦维货号不可用
KH2PO4 （磷酸二氢钾）99.995% 无水基德国达姆施塔特默克集团1.05108
实验室离心机Heraeus Megafuge 1.0R，Thermo Scientific，德国B00013899300 × g 转速离心，4℃冷却 0C
实验室离心机Heraeus Fresco 21，Thermo Scientific，德国750024253,000 × g 离心，4℃ 冷却 0C
口罩（FFP2）美国宾夕法尼亚州拉德诺 VWR111-0917用于正二茴香胺二盐酸盐的操作
小鼠波兰克拉科夫，雅盖隆大学医学院健康科学学院，生物医学科学系繁殖单元CBA/J，C57BL/6
微米计Mitutoyo，东京，日本193-111数显外径千分尺，带棘轮止动装置，量程 0-25 mm，分度值 0.001 mm，精度 ±0.002 mm，https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
微孔板，96孔，Microlon，高结合力（用于ELISA检测）Greiner Bio-One GmbH，克雷姆斯明斯特，奥地利655061采用Maxi-Sorp结合表面，可在比色法检测中获得可靠且可重复的结果
配备物镜的显微镜德国 Leica Microsystems CMS GmbHDM1000, 294011-082007本文中展示的组织学成像在ThermoFisher Scientific EVOS M5000成像系统上完成，所用物镜为：FL 20X LWDPH，0.40NA/3.1WD 和 FL 40X LWDPH，0.65NA/1.79WD
人白细胞髓过氧化物酶（MPO 标准品）德国达姆施塔特默克集团M6908
Na2HPO4 x 7 H2O（磷酸氢二钠七水合物）德国达姆施塔特默克集团S9390
橄榄油德国达姆施塔特默克公司75343纯净，天然
OptEIA 小鼠 IFN-γ ELISA 试剂盒美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿·迪金森公司（BD 生物科学）555138
邻二安息香醚二盐酸盐德国达姆施塔特默克集团D3252
石蜡德国达姆施塔特默克集团76242珠状，蜡样固体
PBS（磷酸盐缓冲液）赛默飞世尔科技  美国马萨诸塞州沃尔瑟姆20012027pH 7.2，哺乳动物细胞培养
pH计波兰埃尔梅特龙CP-401
移液器，可调体积，带吸头德国达姆施塔特默克公司EP3123000900-1EA3件装，选项1，0.5-10 μL/10-100 μL/100-1000 μL，包含epT.I.P.S.
剃刀刀片VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺PERS94-0462刮刀和切割刀片，单刃，铝制背脊，每盒100片，独立包装
旋转式切片机MRC 实验室仪器公司，埃塞克斯，CM20 2HU，英国HIS-202A
剪刀——直刃，刃口锋利/锋利Animalab，波兰波兹南14060-10FST小鼠手术器械（应进行灭菌）
螺口盖（敞口）德国达姆施塔特默克公司27056黑色聚丙烯孔盖，适用于22 20-400 螺纹的 mL 小瓶
分光光度计BioTek Instruments，美国201446通用微孔板分光光度计 λ 范围：200 - 999 nm，吸光度测量范围：0.000 - 4.000 Abs
染色皿，带支架，可容纳20张载玻片德国达姆施塔特默克公司S6141例如，20个带盖染色缸、载玻片架及把手
无菌一次性活检穿孔器 6mmIntegra LifeSciences，美国新泽西州普林斯顿33-36
手术剪Animalab，波兰波兹南52138-46用于小鼠手术的器械（应进行灭菌）
组织处理盒默克股份公司，德国达姆施塔特Z672122带盖组织处理/包埋盒
TMB 底物试剂盒美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿-迪金森公司（BD 生物科学）555214
TNCB（2,4,6-三硝基氯苯）东京化工工业株式会社，日本C0307
TNP-BSA（与2,4,6-三硝基苯基偶联的牛血清白蛋白）Biosearch Technologies LGC，美国加利福尼亚州佩塔卢马T-5050
T-PER（组织蛋白提取试剂）美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 ThermoFisher Scientific 公司78510
15 mL 无菌离心管德国达姆施塔特默克公司CLS430055（Corning）聚丙烯，锥形底
50 mL无菌管德国达姆施塔特默克集团CLS430290（Corning）聚丙烯，锥形底
Tween 20德国达姆施塔特默克公司P1379
22 mL 清亮玻璃螺口小瓶（仅小瓶）德国达姆施塔特默克股份公司27173用于半抗原制备，拧紧以防止蒸发
水浴锅AJL Electronic，波兰LW102
石蜡（石蜡）分配器VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺114-8737
注射用赛拉嗪（赛拉嗪 20 mg/mL）溶液Vetoquinol Biowet Sp. z o.o.，波兰大波兰地区戈茹夫货号不可用
二甲苯（组织学级）德国达姆施塔特默克集团534056

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

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接触性超敏反应作为过敏性接触性皮炎的小鼠模型
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