接触性超敏反应（CHS）是一种小鼠过敏性接触性皮炎（ACD）的实验模型。该模型通过在小鼠剃毛的胸腹部皮肤上涂抹反应性半抗原进行致敏，随后以稀释的半抗原对耳部皮肤进行激发，从而引发肿胀反应，并通过多种方法对反应程度进行评估。
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摘要
摘要
接触性超敏反应（CHS）是一种可在小鼠中研究的变应性接触性皮炎（ACD）的实验模型。本研究旨在介绍一种客观的实验室方法，有助于对小鼠的CHS反应进行研究，并可通过多种检测手段进行测量和量化。为诱导CHS，于第“0”天，在小鼠腹部预先剃毛的区域，使用丙酮-乙醇混合溶剂中的半抗原2,4,6-三硝基氯苯（TNCB）进行皮肤涂抹致敏；而阴性对照组小鼠则仅用溶剂（丙酮-乙醇混合液）进行假致敏处理。第“4”天，在测试组和对照组小鼠双耳涂抹稀释的TNCB以激发CHS（攻击）之前，先用千分尺测量基础耳厚度。24小时后，再次用千分尺测量耳部肿胀程度。CHS是一种由T细胞介导的免疫反应，其特征是在用相同半抗原进行皮肤攻击后约24小时，炎症组织出现肿胀并达到高峰。耳部水肿的增加与耳组织重量增加、髓过氧化物酶（MPO）活性升高、耳组织提取物中促炎性细胞因子浓度上升、组织学检查中水肿性真皮层增厚以及耳部血管通透性增强相关。此外，与对照组小鼠相比，实验组小鼠血清中TNP特异性IgG1抗体浓度也有所升高。另外，CHS还可通过将先前经TNCB致敏供体小鼠获得的CHS效应细胞成功转移至受体小鼠而实现。这些CHS效应细胞经静脉注射至未经致敏的受体小鼠体内，随后用相同的稀释半抗原进行攻击，并于24小时后用千分尺测量耳部肿胀程度。
引言
变应性接触性皮炎（ACD）是一种在工业化国家常见的皮肤炎症性疾病，由暴露于称为半抗原的低分子量化学物质引发的IV型超敏反应所致。导致人类接触致敏的物质包括重金属离子（铬、镍、铁、钴）、松节油、香料、染料以及化妆品中的防腐剂（例如对苯二胺），某些药物（例如新霉素、苯佐卡因）、β-内酰胺类抗生素（即青霉素）、植物产生的化学物质（如漆树中存在的十五烷儿茶酚），以及摄影工业中使用的氢醌1,2。ACD的病因物质种类极为广泛，仅工业领域就使用了超过10万种化学物质，每年还有约2000种新化合物被合成。迄今为止，已鉴定出3700多种可能具有接触性半抗原/致敏原作用的分子3。接触性超敏反应（CHS）是ACD的一种实验模型，可在小鼠、豚鼠和大鼠中进行研究，通常通过将反应性化学半抗原溶解于有机溶剂后局部涂抹于皮肤来诱导4,5,6。本研究旨在描述一种客观的实验室方法，可用于研究小鼠中的CHS反应，并可通过多种检测手段进行测量和定量分析。
接触性超敏反应（CHS）包括致敏（诱导）和效应（激发）两个阶段。在动物模型中，半抗原首先与体内蛋白质共价结合，形成....
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方案
本文所述所有实验均按照克拉科夫第一动物实验伦理委员会的指南进行。所描述的所有操作均遵循当地建议，特别是使用氯胺酮/赛拉嗪作为麻醉剂、使用双耳涂抹物质/半抗原、剪除耳朵以及通过眼球摘除采集血液。本研究使用了6至12周龄的BALB/c（单倍型H-2d）、CBA/J（H-2k）和C57BL/6（H-2b）品系的雄性和雌性小鼠（参见材料表）。为确保统计学显著性，每组小鼠数量最好为10至12只。
1. 动物准备
- 所有操作前后均需使用70%乙醇溶液清洁操作台。若使用需要无菌条件的小鼠，所有操作均应在生物安全柜中进行。
2. 小鼠标记以用于识别
- 使用剃刀刮除皮肤上的毛发来标记小鼠：#0 - 无标记，#2 - 右前爪，#3 - 右侧，#4 - 右后爪，#5 - 尾根部，#6 - 左后爪，#7 - 左侧，#8 - 左前爪。
注意：由于存在诱导反应，无法通过剪耳或耳标等传统方法对小鼠进行标记。标记过程中未对小鼠进行麻醉。
3. CHS 的诱导
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结果
为诱导CHS，对动物进行致敏处理 通过 皮肤涂抹（腹部） 150 µL 5% TNCB 或仅用溶剂假致敏。在第4天，通过接触涂抹（激发）诱导双耳耳肿胀反应 10 µL 0.4% TNCB 对先前经 TNCB 接触致敏的小鼠（试验组）和假致敏小鼠（对照组）均进行了激发。结果显示，经 TNCB 致敏并在 4 天后接受激发的小鼠，其耳部肿胀程度显著高于同样接受激发但假致敏的小鼠（图3, 表2，测试组与对照组）。耳部肿胀结果在后续研究中得到完全验证，表明使用千分尺测定的耳水肿增加与耳重量增加相一致图4），MPO 活性（图5），耳组织提取物中IFN-γ浓度（图6），组织学检查中水肿性真皮增厚程度增加（图7）以及耳部血管通透性（图8)。与对照组.......
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讨论
CHS 被诱导 通过 半抗原与皮肤中的自身蛋白抗原结合，形成新抗原。接触性超敏反应（CHS）由循环中抗原特异性的CHS效应T细胞在局部血管外募集所介导，导致再次接触相同半抗原的皮肤组织发生肿胀，肿胀程度在24小时达到高峰6组织肿胀主要由白细胞浸润及白细胞依赖性的纤维蛋白沉积引起。24这些变化可通过千分尺测量半抗原致敏并激发的小鼠与假致敏并激发的小鼠耳部肿胀程度来检测。
CHS 也可通过耳重量的比较来确定。随后，用于测定耳重量的耳片可用于进一步检测。发炎耳组织中的细胞浸润物主要包括产生细胞因子的 T 淋巴细胞和 MPO 阳性的中性粒细胞。在耳组织匀浆中，可检测多种参数，例如通过 ELISA 检测 MPO 活性或促炎细胞因子（如 TNF-α、IFN-γ、IL-17A 或其他因子）的浓度，或通过 qPCR 检测皮肤中细胞因子 mRNA 的表达25。此外，还可使用伊文思蓝试验评估血管通透性的变化.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由波兰弗罗茨瓦夫医科大学资助项目 SUBZ.A020.22.060 以及波兰科学与高等教育部授予 MS 的 N N401 545940 号基金和授予 MMS 的 IP2012 0443 72 号基金提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70% 乙醇 | 德国达姆施塔特默克公司 | 65350-M | 用于表面消毒 |
| 96孔平底板，聚丙烯 | Greiner Bio-One GmbH，克雷姆斯明斯特，奥地利 | 655101 | 用于MPO和伊文思蓝测定——应使用聚丙烯板，因其结合能力较低，可防止蛋白质或DNA发生结合 |
| 丙酮（ACS级试剂， ≥99.5%) | 德国达姆施塔特默克集团 | 179124 | |
| 铝箔 | 德国达姆施塔特默克公司 | Z185140 | |
| 分析天平 | Sartorius Weighing Technology GmbH，德国哥廷根 | PRACTUM224-1s，29105177 | |
| 全自动组织处理仪 | MediMeas Instruments，萨尔谢赫里，哈里亚纳邦，印度 | MTP-E-212 | 通过固定、脱水、透明和浸蜡等步骤自动制备组织样本 |
| BD Vacutainer SST II Advance（含凝胶用于获取血清的采血管） | 美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿·迪金森公司（BD） | BD 366882 | |
| 用于蛋白质测定的双辛可宁酸试剂盒 | 德国达姆施塔特默克公司 | BCA1-1KT | |
| 生物素标记大鼠抗小鼠IgG1 | 美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿·迪金森公司（BD 生物科学） | 553441 | |
| BSA（牛血清白蛋白） | 德国达姆施塔特默克集团 | A9418 | 蛋白质检测 &和分析，2 mg/mL |
| 细胞滤筛，孔径70 μm | BIOLOGIX，中国 | 15-1070 | 适用于50 mL离心管 |
| 盖玻片 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 631-1583 | 24 mm，但也可使用其他尺寸 |
| 一次性移液管容量：5 mL，10 mL，25 mL | 德国达姆施塔特默克集团 | Z740301, Z740302, Z740303 | |
| DPBS（Dulbecco）′磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline） | 赛默飞世尔科技 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 14190144 | 无钙，无镁，哺乳动物细胞培养 |
| 组织学用DPX封片剂 | 德国达姆施塔特默克公司 | 6522 | 用于苏木精-伊红染色的封片介质，也可使用其他类型，例如加拿大树胶 |
| Dumont 5号镊子——直头 | Animalab，波兹南，波兰 | 11251-10FST | 用于小鼠手术的器械（应进行灭菌） |
| Dumont 7号镊子 - 弯型 | Animalab，波兹南，波兰 | 11272-50FST | 用于小鼠手术的手术器械（应进行灭菌） |
| 伊红Y醇溶液 | 德国达姆施塔特默克集团 | HT110116 | |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管 1.5 mL | 德国艾本多夫 | 3,01,20,086 | 聚丙烯 |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管，2.0 mL | 德国艾本多夫 | 3,01,20,094 | 聚丙烯，圆底（便于均质化珠移动） |
| 乙醇 100%（绝对乙醇） | 德国达姆施塔特默克集团 | 1.07017 | |
| 乙醇 96% | 德国达姆施塔特默克公司 | 1.59010 | |
| 伊文思蓝 | 德国达姆施塔特默克股份有限公司 | E2129 | |
| FBS（胎牛血清） | 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司 | A3160802 | |
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | 德国达姆施塔特默克集团 | HT501128 | |
| 甲酰胺 99.5%（气相色谱级） | 德国达姆施塔特默克公司 | F7503 | |
| -20 冰箱 °C | 博世，德国 | GSN54AW30 | |
| 冰箱 +4℃ °C / 冰箱 -20 °C | 博世，德国 | KGV36V10 | 哺乳动物细胞培养，合格，巴西，10 × 50 mL |
| 载玻片，SuperFrost Plus | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | 可避免使用粘合剂或蛋白质涂层，防止染色过程中组织切片丢失的载玻片。 |
| Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
| 灰色肥皂 | 波勒纳·奥斯垂泽ów，家用化学品生产商 Sp. Z.o.o.，Sp. K.，波兰 | 比亚利杰伦香皂 | 灰色香皂条，天然低敏。常规可购产品 |
| H2SO4 （硫酸）1 mol/L（1 M） | 德国达姆施塔特默克公司 | 1.60313 | |
| Harris苏木精溶液 | 默克股份公司，德国达姆施塔特 | HHS16 | |
| 血细胞计数板 | VWR，Avantor，美国 | 612-5719 | 建议使用人工计数板，其准确性更高 |
| 十六烷基三甲基溴化铵 | 德国达姆施塔特默克公司 | H5882 | |
| 匀浆器 | QIAGEN 德国希尔登 | Tissue Lyser LT，序列号 23.1001/05234 | 用于2 mL离心管的带不锈钢珠（直径5 mm）的均质器 |
| 辣根过氧化物酶链霉亲和素（HRP streptavidin） | Vector Laboratories, Inc.，美国加利福尼亚州伯林盖姆 | SA-5004-1 | |
| 过氧化氢溶液（H202) | 德国达姆施塔特默克集团 | H1009 | |
| Heracell 150i 培养箱 | 德国 Thermo Electron LED Gmbh | 41071068 | 37 oC，置于5% CO₂的气体环境中2，以及65 0组织学切片脱蜡步骤中的 C |
| 氯胺酮 100 mg/mL，注射用溶液 | Biowet Pulawy Sp. z o.o.，波兰普瓦维 | 货号不可用 | |
| KH2PO4 （磷酸二氢钾）99.995% 无水基 | 德国达姆施塔特默克集团 | 1.05108 | |
| 实验室离心机 | Heraeus Megafuge 1.0R，Thermo Scientific，德国 | B00013899 | 300 × g 转速离心，4℃冷却 0C |
| 实验室离心机 | Heraeus Fresco 21，Thermo Scientific，德国 | 75002425 | 3,000 × g 离心，4℃ 冷却 0C |
| 口罩（FFP2） | 美国宾夕法尼亚州拉德诺 VWR | 111-0917 | 用于正二茴香胺二盐酸盐的操作 |
| 小鼠 | 波兰克拉科夫，雅盖隆大学医学院健康科学学院，生物医学科学系繁殖单元 | CBA/J，C57BL/6 | |
| 微米计 | Mitutoyo，东京，日本 | 193-111 | 数显外径千分尺，带棘轮止动装置，量程 0-25 mm，分度值 0.001 mm，精度 ±0.002 mm，https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
| 微孔板，96孔，Microlon，高结合力（用于ELISA检测） | Greiner Bio-One GmbH，克雷姆斯明斯特，奥地利 | 655061 | 采用Maxi-Sorp结合表面，可在比色法检测中获得可靠且可重复的结果 |
| 配备物镜的显微镜 | 德国 Leica Microsystems CMS GmbH | DM1000, 294011-082007 | 本文中展示的组织学成像在ThermoFisher Scientific EVOS M5000成像系统上完成，所用物镜为：FL 20X LWDPH，0.40NA/3.1WD 和 FL 40X LWDPH，0.65NA/1.79WD |
| 人白细胞髓过氧化物酶（MPO 标准品） | 德国达姆施塔特默克集团 | M6908 | |
| Na2HPO4 x 7 H2O（磷酸氢二钠七水合物） | 德国达姆施塔特默克集团 | S9390 | |
| 橄榄油 | 德国达姆施塔特默克公司 | 75343 | 纯净，天然 |
| OptEIA 小鼠 IFN-γ ELISA 试剂盒 | 美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿·迪金森公司（BD 生物科学） | 555138 | |
| 邻二安息香醚二盐酸盐 | 德国达姆施塔特默克集团 | D3252 | |
| 石蜡 | 德国达姆施塔特默克集团 | 76242 | 珠状，蜡样固体 |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | 赛默飞世尔科技 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 20012027 | pH 7.2，哺乳动物细胞培养 |
| pH计 | 波兰埃尔梅特龙 | CP-401 | |
| 移液器，可调体积，带吸头 | 德国达姆施塔特默克公司 | EP3123000900-1EA | 3件装，选项1，0.5-10 μL/10-100 μL/100-1000 μL，包含epT.I.P.S. |
| 剃刀刀片 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | PERS94-0462 | 刮刀和切割刀片，单刃，铝制背脊，每盒100片，独立包装 |
| 旋转式切片机 | MRC 实验室仪器公司，埃塞克斯，CM20 2HU，英国 | HIS-202A | |
| 剪刀——直刃，刃口锋利/锋利 | Animalab，波兰波兹南 | 14060-10FST | 小鼠手术器械（应进行灭菌） |
| 螺口盖（敞口） | 德国达姆施塔特默克公司 | 27056 | 黑色聚丙烯孔盖，适用于22 20-400 螺纹的 mL 小瓶 |
| 分光光度计 | BioTek Instruments，美国 | 201446 | 通用微孔板分光光度计 λ 范围：200 - 999 nm，吸光度测量范围：0.000 - 4.000 Abs |
| 染色皿，带支架，可容纳20张载玻片 | 德国达姆施塔特默克公司 | S6141 | 例如，20个带盖染色缸、载玻片架及把手 |
| 无菌一次性活检穿孔器 6mm | Integra LifeSciences，美国新泽西州普林斯顿 | 33-36 | |
| 手术剪 | Animalab，波兰波兹南 | 52138-46 | 用于小鼠手术的器械（应进行灭菌） |
| 组织处理盒 | 默克股份公司，德国达姆施塔特 | Z672122 | 带盖组织处理/包埋盒 |
| TMB 底物试剂盒 | 美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿-迪金森公司（BD 生物科学） | 555214 | |
| TNCB（2,4,6-三硝基氯苯） | 东京化工工业株式会社，日本 | C0307 | |
| TNP-BSA（与2,4,6-三硝基苯基偶联的牛血清白蛋白） | Biosearch Technologies LGC，美国加利福尼亚州佩塔卢马 | T-5050 | |
| T-PER（组织蛋白提取试剂） | 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 ThermoFisher Scientific 公司 | 78510 | |
| 15 mL 无菌离心管 | 德国达姆施塔特默克公司 | CLS430055（Corning） | 聚丙烯，锥形底 |
| 50 mL无菌管 | 德国达姆施塔特默克集团 | CLS430290（Corning） | 聚丙烯，锥形底 |
| Tween 20 | 德国达姆施塔特默克公司 | P1379 | |
| 22 mL 清亮玻璃螺口小瓶（仅小瓶） | 德国达姆施塔特默克股份公司 | 27173 | 用于半抗原制备，拧紧以防止蒸发 |
| 水浴锅 | AJL Electronic，波兰 | LW102 | |
| 石蜡（石蜡）分配器 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 114-8737 | |
| 注射用赛拉嗪（赛拉嗪 20 mg/mL）溶液 | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o.，波兰大波兰地区戈茹夫 | 货号不可用 | |
| 二甲苯（组织学级） | 德国达姆施塔特默克集团 | 534056 |
参考文献
- Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
- Hertl, M., et al. Predominance of epiderma....
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勘误
Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.
Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
to:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
Figure 1 of the Representative Results has been updated from:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 2 of the Representative Results has been updated from:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
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