一种研究动脉粥样硬化斑块纤维组织局部胶原结构与力学性能相关性的方法

Summary

我们开发了一种机械成像管道来研究异质结构和机械动脉粥样硬化斑块特性。该管道能够关联胶原纤维取向的局部优势角度和分散、破裂行为和纤维斑块组织的应变指纹。

Abstract

冠状动脉和颈动脉动脉粥样硬化斑块破裂是致命心血管事件的主要原因。然而，异质性、高度胶原斑块组织的破裂机制，以及这与组织的纤维结构的关系，尚不清楚。现有的研究斑块力学的管道仅限于根据组织结构均匀性的假设获得斑块组织的粗体机械特性。然而，纤维斑块组织在结构上是异质的，可以说主要是由于胶原纤维结构的局部变化。

这里描述的机械成像管道已被开发用于研究异质结构和机械斑块特性。在该管道中，使用具有二次谐波（SHG）的多光子显微镜（MPM）表征组织的局部胶原蛋白结构，并使用数字图像相关（DIC）分析在单轴拉伸测试条件下表征组织的破坏行为。该实验管道能够关联胶原纤维取向的局部优势角度和分散、破裂行为和纤维斑块组织的应变指纹。所获得的知识是更好地理解、预测和预防动脉粥样硬化斑块破裂事件的关键。

Introduction

缺血性卒中通常由颈动脉动脉粥样硬化斑块破裂引发，是全球死亡和发病的主要原因之一¹。然而，目前预防颈动脉粥样硬化相关脑卒中的手术治疗计划策略不包括斑块破裂风险评估²。这主要是因为先前建议的风险生物标志物，例如斑块帽厚度³ 和脂质核心大小⁴，已被证明对未来临床事件的预测价值不理想^5，6。更好地了解斑块力学和破裂机制对于优化斑块破裂风险评估和识别动脉粥样硬化斑块的新风险标志物是必要的。

斑块破裂是一种局部机械事件，其中高度纤维斑块组织无法承受血压施加在其上的机械负荷并失去其^{结构完整性7}。尽管如此，斑块破裂事件的机制及其与底层微观结构的联系知之甚^少8。少数表征斑块组织^{破坏特征的}实验研究9，¹⁰，^11，12，13报告了毛额机械断裂特性（即极限拉伸破坏应变和强度），这是通过组织结构均匀性的假设得出的。 然而，纤维斑块组织在结构上是异质的，可以说主要是由于胶原纤维结构的局部变化¹⁴。此外，斑块组织机械失效特征与胶原蛋白结构之间的联系仅在Johnston等人最近的一项研究中进行了研究。作者在主要纤维取向方面显示出斑块间差异，并报告了主要具有圆周纤维取向的纤维斑帽样品的较高极限应力和较低的极限应变¹⁵。然而，该研究也仅限于粗大的机械和结构性能。

为了阐明有关局部胶原蛋白结构和纤维斑块组织的局部机械特性的基本信息，在当前的研究中，我们开发了一种机械成像管道。这种 离体 管道能够量化局部胶原纤维的方向和分散，以及局部破裂应变。该管道涉及使用SHG进行MPM成像，以对斑块组织中的胶原纤维进行成像，以及DIC和单轴拉伸测试，以量化组织的破裂特征。

多光子显微镜-二次谐波发生（MPM-SHG）已成为研究生物组织中胶原蛋白的流行技术¹⁶。与其他胶原成像技术相比，该技术具有许多优势，例如组织学¹⁷，扩散张量成像（DTI）¹⁴和小角光散射（SALS）¹⁵。首先，MPM-SHG成像是非破坏性的，这使得它非常适合与机械测试相结合¹⁸。其次，SHG信号对胶原蛋白具有特异性，因此无需对组织进行染色。由于激发波长长（近红外），穿透深度大于其他显微镜技术¹⁶。SHG成像实现的高分辨率（μm级）也允许单个光纤的可视化。这提供了许多可能性，例如胶原纤维数量的局部定量，胶原纤维取向和分布¹⁹。

数字图像相关（DIC）结合力学测试是一种广泛使用的获得生物组织局部力学性能的方法²⁰。使用DIC，通过比较在机械测试期间获得的高速相机图像来跟踪施加在组织表面上的斑点的位移²⁰。该图像后处理方法用于估计标本²⁰ 的全场表面应变，也可用于研究组织²¹的破裂行为。

Protocol

本文中描述的所有方法均已获得鹿特丹伊拉斯谟医学中心的伦理研究委员会的批准;在采集斑块标本之前获得患者的知情同意。该协议的工作流程图如图 1所示。

1. 组织采集、显微计算机断层扫描 （μCT） 成像和测试样品制备

1. 组织收集和储存
   1. 从接受颈动脉内膜切除术的同意患者中收集新鲜的人颈动脉粥样硬化斑块标本。
      注意:从该手术中取出的斑块样本由颈动脉的患病内膜层组成，包括脂肪堆积（脂质池）和钙化²²。
   2. 使用磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）去除残留的血液，并用纱布垫擦干标本。
   3. 使用镊子将标本放入 15 mL 管中。通过将试管置于液氮中10分钟来快速冷冻组织。
   4. 快速冷冻后，将样品储存在-80°C冰箱中，直到μCT成像的那一天。
      注意:快速冷冻可最大限度地减少晶体形成，导致组织中的微观结构损伤。先前对猪主动脉组织的研究表明，在-80°C下快速冷冻和储存对组织的机械性能没有显着影响²³。
2. 微电脑断层成像
   1. 在μCT成像当天，将斑块标本从15 mL管中取出。如果组织粘在管子上，请在室温下用PBS填充管子。将组织留在PBS中，直到样品可以从管中取出。
   2. 用薄纸彻底擦干斑块标本。
   3. 按 绿色 按钮打开μCT系统。在屏幕底部的CT软件中按 预热 并等待15分钟。
   4. 在μCT系统中手动放置Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm的X射线滤光片。
   5. 选择要在其中存储图像的文件夹。
   6. 在左侧面板中选择参数。使用下拉列表选择4分钟的扫描时间，172μm的分辨率，90 kV的电压，88 mA的安培数，86 mm的视场和360°的旋转。
   7. 打开设备门。手动拉出平台。
   8. 将封口膜放在平台上并将样品放在平台上（朝向平台的更极端）。
   9. 手动将平台放入设备并关闭门。
   10. 激活 实时模式 （眼睛 图标）。使用设备中的箭头移动平台，使样品在 FOV 中居中。
   11. 开始 成像（中间底部的图标）。成像完成后，按底部的 门 图标（ 在中止 按钮下方）。
   12. μCT扫描后，按照步骤1.1.3中所述再次快速冷冻斑块标本。将其储存在-80°C，直到多光子显微镜成像和机械测试的那一天。
   13. 在开源3D切片器^软件24中打开获取的μCT成像的DICOM文件。
   14. 转到 区段 编辑器。选择" 创建新分段"|"要作为主卷分析的卷"。
   15. 点击添加以添加细分。按其名称和颜色以更改这些参数。
   16. 要定义线段，请单击窗口底部的 "效果|阈值 "。使用此 阈值 工具区分 钙化 （>450 HU） 和非 钙化 （<450 HU） 组织区域。选择阈值后 ，按底部 的应用。
   17. 按 显示 3D （ 位于添加右侧）以在 3D 视图中可视化分割。如果分割中有一些区域不需要，请使用 剪刀 效果将其删除。
   18. 通过单击所需分割的名称来更改分割模块中段的不透明度。
       注意:如果可能，μCT成像和μCT图像的检查可以与协议的其余部分在同一天进行。在这种情况下，请跳过步骤 1.2.12。但是，考虑到该协议的后续步骤也很耗时，应在同一天执行。经过一些练习，并使用所描述的设置和组织，μCT成像应花费~45分钟，审查μCT图像~15分钟，单个测试样品的测试样品制备~1小时，显微镜~4小时，单轴拉伸测试~2小时。
3. 测试样品制备
   1. 在胶原蛋白成像和机械测试当天，通过在室温下浸入PBS中解冻斑块约10分钟。
   2. 在 3D 切片器软件中打开在步骤 1.2.13-1.2.18 中创建的斑块的 3D 构造。
   3. 使用斑块组织的自然标志来确定 3D 重建的哪些部分与真实斑块样本相对应。确定3D重建的哪个区域不包含钙化，并在真实斑块中直观地识别该区域。
   4. 使用手术剪刀和镊子沿动脉纵轴切开斑块。如果手术中已经存在切口，请从该切口开始，以最佳地利用组织。如果样品没有管状形状并且难以定义纵向，请将样品排除在测试之外。
   5. 从斑块标本中切出矩形测试样品。确保测试样品尽可能大，同时避免含有撕裂或钙化的组织区域。在切割过程中要小心，因为在拉伸测试期间，试样边缘的小撕裂或裂纹会导致裂纹从现有裂纹扩展。
   6. 确保测试样品安装在拉伸测试仪中后，标距长度的宽长比为 <1。如果样品满足此要求，则适合在边界条件²⁵方面进行适当的拉伸测试。
      注意:样品尺寸的范围可能很大。作者测试的样品的标距长度在3.4至12.9毫米之间，宽度在1.6至6.4毫米之间。

2. 多光子显微镜成像

1. 准备
   1. 在胶原蛋白成像和机械测试之前，将 40 g 有机硅弹性体基质分装在两个 50 mL 管中，并使用巴斯德移液管向每个试管中加入 2 g 固化剂（比例为 1:10）。将两种组分与移液管混合。
   2. 将试管以700× g 离心1分钟，以去除尽可能多的气泡。
   3. 用薄层（约0.5-1厘米）硅填充培养皿（直径10厘米），并将其在65°C的烤箱中孵育3小时或在室温下放置48小时。
   4. 取斑块测试样品，并通过在组织中钉针将其两端固定在硅上（图2A）。确保样品的管腔侧朝上。在机械测试期间，将针插入将位于拉伸测试装置夹具中的样品区域。
   5. 戴上安全眼镜。使用侧切器缩短针头，使其在样品表面上方伸出不到几毫米，以防止它们损坏显微镜物镜。用PBS填充培养皿，直到样品被淹没。
2. 显微镜设置
   1. 确保在多光子显微镜上安装了正确的物镜。使用经过优化的物镜透射红外光，放大倍率为20倍。
   2. 启动显微镜系统。打开显微镜的操作软件。
   3. 当要求初始化成像台时，请确保显微镜聚光镜臂被推回，物镜处于最低位置。
   4. 激活多光子激光器。
   5. 将装有测试样品的培养皿放在物镜下方，如图 3所示。确保不要将物镜放在样品上方，因为激光设置仍需要优化。否则，激光可能的高功率可能导致组织损伤。
   6. 确保物镜稍微浸入PBS中。如果需要，使用移液器添加额外的PBS。
   7. 将光波长设置为 880 nm。
      注意:选择此波长是因为使用的双光子系统中的SHG发射滤光片的中心波长约为440 nm。对于其他显微镜，不同的波长可能更适用。
3. 平铺扫描和成像位置选择
   1. 关闭多光子激光器并激活显微镜的 明场 模式。然后，打开 实时扫描 模式。
   2. 放置载物台，使物镜位于样品上方，并使样品表面聚焦。关闭实时扫描模式。
   3. 在 采集 选项卡下的 第二个面板中，通过滑动预期的条将 缩放系数 更改为 1 。
      注意:此变焦系数与物镜的放大倍率（20x）一起决定了捕获图像的大小（739 μm x 739 μm）。
   4. 在 采集 选项卡下的 第二个面板中，使用下拉列表将 扫描速度 更改为 400 Hz，将 线平均值 更改为 1，将 分辨率 更改为 每张图像 128 x 128 像素 （像素大小 为 ~5.8 μm x 5.8 μm）。
   5. 在采集选项卡下的第一个面板中，单击光栅图案符号并等待切片扫描面板出现。
   6. 打开 实时扫描 模式。使用智能面板上的旋钮将物镜移动到样品的一角，然后单击平铺扫描面板中的标记位置符号。对样品的每个角重复此操作。如果执行正确，包含所有选定用于成像的切片的网格将以橙色显示。
   7. 关闭 自动拼接 功能。
   8. 单击屏幕右下角的 "开始 "以创建整个样品表面的平铺扫描，以获得样品几何形状的概览。
      注意:根据所描述的设置、组织和显微镜系统，获取整个样品表面的瓷砖扫描需要~10分钟。
   9. 瓷砖扫描后，观察瓷砖扫描面板中每个瓷砖左上角的 x 和 y 坐标，由显微镜系统的软件自动显示。在电子表格中记下这些坐标。
   10. 在显微镜软件的 平铺扫描面板中，观察称为 扫描场的框中x和y方向的图块数量。记下电子表格中磁贴扫描的大小。通过添加/减去瓷砖的大小（739μm）来计算其他瓷砖的坐标。
       注意:这些坐标对于识别要通过SHG成像扫描的瓷砖的确切位置是必需的。如果总成像时间不是问题，则可以对所有磁贴进行成像，而无需跳过任何磁贴。
   11. 从切片扫描中，选择要使用 SHG 成像成像的切片。对于此选择，请避免使用夹具中的瓷砖，并在纵向和圆周方向的每个选定瓷砖之间留出一块瓷砖，如图 2B 所示。
4. 可视化胶原蛋白:SHG成像
   1. 关掉房间里的灯，用遮光布覆盖显微镜载物台，以免房间的光线到达探测器。
      注意:尽量减少到达探测器的光将降低图像采集过程中的噪声。
   2. 打开 多光子 （MP） 激光器 。
   3. 选择配备430-450 nm带通滤光片的非去扫描检测（NDD）检测器。
   4. 使用在步骤 2.3.10 中获取的信息确定要成像的切片的位置。在指定的框中填写 坐标 并单击 Enter 键，以便目标移动到右侧磁贴。打开 实时扫描模式。
      注意:使用其他显微镜或较新版本的操作软件，可以自动移动到平铺扫描中的位置。在这种情况下，不需要记下每个图块的 x 和 y 坐标（步骤 2.3.10）并在操作软件中填写坐标（步骤 2.4.4）。
   5. 在光束路径设置下使用上面板中的滑块来增加 MP 激光功率，以获得尽可能高的激光功率，而不会发生明显的漂白。然后，通过使用智能面板上的旋钮或单击光束路径设置|附加通道下的检测器名称，调整检测器增益以获得明亮的图像，但没有饱和像素。 检波器增益的典型值在500至800 V之间。
   6. 使用智能面板上的 z 位置旋钮调整对焦平面。
   7. 移动到样品顶部，并通过单击 z 堆栈面板中的 箭头 设置 z 堆栈 顶部的位置（ 在采集选项卡 | 3^rd 面板下）。
   8. 然后，专注于样品，直到不再检测到SHG信号 - 这是堆栈的结束。再次单击z堆栈面板中的箭头以设置此位置。完成后，关闭实时扫描模式。
      注意:组织可能不完全平坦。因此，组织内不同区域的样品表面在z方向上的位置可能略有不同。
   9. 在 采集 选项卡下的 第二个面板中，使用下拉列表将 扫描速度 保持在 400 Hz，将 线平均值 设置为 2，并将 分辨率 设置为 每张图像 512 x 512 像素（像素大小为 ~1.4 μm x 1.4 μm）。打开 双向 X 扫描按钮。
   10. 单击 z 堆栈面板中的 z 步长，然后在框中填充 3 μm 的 z 步长。单击屏幕右下角的开始以创建 z 堆栈。完成后，请确保将磁贴的坐标保存在文件名中，或为每个磁贴指定自己的编号（如图 2B 所示）。
       注意:根据所描述的设置、组织和显微镜系统，获取单个瓷砖的 z 堆栈需要 ~10-15 分钟。准备步骤（步骤2.4.4-2.4.10）包括在此时间估计数中。

3. 机械测试

1. 准备单轴拉伸试验装置
   1. 按照拉伸测试仪的说明（例如，打开软件、连接夹具、连接称重传感器），使水平拉伸测试装置（图4）准备就绪。
   2. 为了尽量减少测试样品的打滑，将双面泡沫胶带（图4A，B-2）连接到拉伸测试仪夹子的内表面，并将砂纸连接到泡沫胶带的内侧。最终，砂纸将与测试样品接触。
   3. 将加热浴（图4A，B-3）放置到位。用PBS填充加热浴，直到夹子底面的水平，使其尚未到达砂纸。
   4. 打开加热槽的电源，将温度设置为37°C左右。
   5. 例如，使用实验室支架将高速相机安装在拉伸测试系统上方（图 4A-4），并通过延长环将焦距为 50 mm 的镜头安装在相机上。
   6. 确保夹具对焦，并且视野足够大，可以在整个拉伸过程中记录样品（FOV宽度:±样品宽度;视场长度:±样本长度的 2 倍）。
   7. 例如，使用实验室支架将照明系统（图 4A-5）安装在拉伸测试系统上方。打开照明系统并调整光强度和位置，以便在相机图像上观察到PBS表面上没有反射。
   8. 调整相机的曝光时间和增益以获得清晰的图像。
   9. 将图像采集软件设置为以 30 帧/秒的速度以 5.2 MP的分辨率进行捕获。
      注意:需要这种高帧速率来执行后续的DIC分析和研究破裂行为。
   10. 设置其中一个夹具的位移速度，使机械测试期间的全局工程应变率与组织的 体内 生理应变率相似
       （斑块组织²⁶ 为 5%/秒）。
2. 斑点图案的生成
   注意:此斑点模式协议基于Walsh等人²⁷以前的工作。
   1. 用薄纸轻轻擦拭样品，使样品干燥。
   2. 将黑色组织染料放入喷枪的预期桶中。
   3. 将喷枪连接到压缩机。打开 喷枪压缩机 并将 压力 设置为 25 PSI。
   4. 在喷洒在纸巾上之前，尝试在纸上创建最佳的斑点图案。喷几次，直到达到 50:50²⁸ 的黑白比例。来回移动喷枪的针以调整斑点图案的粗糙度，直到斑点的大小与高速相机²⁹的3-5像素的大小相似。
      注意:斑点图案将用于两种不同的目的。首先，通过比较在机械测试期间获得的高速相机图像来测量这些斑点的位移（DIC，步骤4.2）。其次，该斑点图案用于识别图像上样品未变形状态的破裂位置（步骤4.3.1）。
   5. 将喷枪与测试样品保持约30厘米的距离，然后喷洒在管腔表面上。
   6. 让染料在室温下与样品结合1分钟，然后将样品浸没在PBS中。
3. 单轴拉伸试验
   1. 将样品放在拉伸测试仪的夹子中，样品的圆周方向与拉伸拉伸方向对齐，样品的腔侧朝上。确保初始标距长度设置为条带的 WL 比率为 <1。
   2. 使用扭矩螺丝刀施加 20 cNm 的扭矩，拧紧手柄的螺钉。在施加最终扭矩之前，通过对每个螺钉施加小扭矩来逐渐执行此操作。
   3. 目视检查样品是否含有任何可能影响测试的撕裂。
   4. 将更多的PBS引入加热浴中，直到样品浸没，然后等待PBS的温度再次达到37°C。
   5. 使用高速相机获取校准图像，其中包括测试样品和标尺作为参考。确保标尺与相机物镜的距离与样品的腔表面的距离相同。
   6. 去皮称重传感器并开始记录来自称重传感器和拉伸测试仪执行器的全局力和位移测量值。
   7. 通过施加 0.05 N 的预拉伸来拉直样品以消除样品中的松弛。根据应用预拉伸后执行器测量的标距长度，执行 10 个周期的预处理，最高可达 10% 应变。
   8. 开始单轴拉伸试验，直到样品完全失效，同时用高速相机记录样品变形的视频。组织衰竭后，停止记录全局力和位移测量值。
      注意:一些商用拉伸试验机可以自动执行步骤3.3.6-3.3.9。当前协议描述了如果正在使用的拉伸测试仪中不包含此自动选项时要采取的手动步骤。
   9. 从拉伸测试装置中取出测试样品并适当丢弃。
   10. 测试下一个样品时，更换夹子上的砂纸和泡沫胶带。

4. 数据分析

1. 胶原蛋白组织分析
   1. 在 ImageJ 中使用 SHG 打开在 MPM 期间获得的 z 堆栈，并为每个 z 堆栈创建最大强度投影 （MIP）。
   2. 使用基于开源MATLAB的FOA（纤维取向分析）工具³⁰分析每个MIP，以测量瓷砖中存在的单个胶原纤维的方向角。使用以下参数:刻度:[3 4 5] 或 [2 4 6]，取决于容器直径，以及容器阈值:0.999、0.9995 或 0.9999，具体取决于 SHG 信号的强度。
      注意:有关如何使用此工具的更多详细信息，请参阅软件手册³¹。
   3. 使用另一个基于 MATLAB 的开源工具 FibLab³²，将高斯分布拟合到角度分布直方图。
      注意:有关如何使用此工具的更多详细信息，请参阅软件手册³²。
   4. 从使用FibLab获得的高斯分布图中，从MATLAB的工作空间中提取以下结构参数:主要纤维角度（μ p），这是分布的模式，纤维角度分布的标准偏差（σ_p）和各向异性分数（P_ani = 1 − P_iso）。
      注意:各向同性分数是高斯分布中基线下的面积，而各向异性分数包含该基线³³ 顶部的峰面积。σ_p 和 P_ani 都提供了有关纤维取向在瓷砖区域中分散的信息。
   5. 对于目视检查，使用定向线绘制μ_p，并使用颜色图绘制_{σ p} 和 P_ani。
2. 数字图像分析和破裂分析
   1. 对相机图像进行目视检查，以确定发生破裂起始的帧。在此帧上，目视识别破裂位置。
   2. 在机械测试开始时，对相机图像进行目视检查，以识别破裂位置的任何最终裂缝或撕裂。如果存在这种撕裂，请从分析中排除样品。
   3. 使用基于 MATLAB 的开源软件 Ncorr （v1.2）³⁴ 执行 DIC 分析。按照 Ncorr 手册³⁵ 中的步骤操作。
      1. 将拉伸试验期间记录的相机图像与高速相机配合使用DIC进行。选择最终拉伸之前的最后一帧，直到失败（预处理后）作为 参考图像。对于当前图像，选择从最终拉伸开始到发生破裂起始的帧之前的最后一帧的所有 图像。
      2. 选择样品表面作为感兴趣区域 （ROI）。排除靠近夹具（约 1 毫米）的区域，因为这些区域的应变将受到夹具的高度影响。
      3. 使用以下参数执行 DIC 分析: 子集半径:30 像素;子集间距:三个像素;迭代截止:50;差分向量截止的范数:10-5;应变半径: 5;自动传播，步骤#:5。
      4. 从Ncorr的DIC分析中，获得ROI的格林-拉格朗日（或欧拉应变）分布。使用这些应变分布来计算破裂前最后一帧整个斑块样品表面的平均格林-拉格朗日应变。计算破裂位置处的格林-拉格朗日应变。
3. 关联破裂位置的结构和机械数据
   1. 使用测试样品中的自然地标和测试样品上施加的斑点，确定参考图像（步骤4.2.3.1）上的破裂位置（在步骤4.2.1中确定）。
   2. 使用测试样品中的自然地标，对参考图像和瓷砖扫描（步骤2.3）进行叠加，以识别瓷砖扫描上的破裂位置。确定发生破裂的 MPM-SHG 磁贴。如果破裂不在使用 MPM-SHG 扫描的瓷砖中，请确定最靠近破裂位置的瓷砖。获取在发生破裂的瓷砖上找到的结构参数。

Results

组织收集和测试样品制备
组织采集产生斑块纤维组织标本，可以解剖成单独的测试样本进行结构成像和单轴拉伸测试。理想情况下，收集的纤维组织样本包含几乎没有撕裂（图5A）和大钙化（图5B）的区域。这些撕裂和钙化过量（图5C）可能导致斑块样品不符合前面提到的WL 1样品尺寸要求。

多光子显微镜成像
SHG 成像和图像后处理提供来自每个成像切片的 MIP（图 6A，B）。通过纤维检测（图6C）进行进一步后处理，产生纤维取向直方图（图6D），从中提取胶原蛋白结构参数（图6E）。此外，可以获得显示整个斑块样本的局部结构胶原蛋白参数的彩色图，以进行视觉分析（图6F，G）。对于图6中的代表性测试样品，发现结构胶原蛋白参数的样品内变化很大（平均±SD为μ_p = -34°±32°;σ_{p =} 21°±4°;P_ani = 0.49 ± 0.14，如果圆周方向定义为 0°）。这种样本内变异强调了获得局部结构参数而不是假设均匀性的重要性。

机械测试
破裂行为
高速相机提供机械测试期间斑块样品变形和破裂行为的图像（图7）。从这些图像中，可以确定破裂起始的位置和破裂传播路径。如果相机图像中存在气泡或反射，或者破裂传播速度太快而无法被所选帧速率捕获，则破裂识别结果不是最佳的。

局部应变模式
对在单轴拉伸测试期间获得的相机记录进行数字图像相关分析，可提供局部组织变形图，例如图8所示的格林-拉格朗日应变 图。这些图显示了破裂起始前帧处的三个应变分量（ε_xx、_{ε xy} 和_{ε yy}）。从这些应变图中，可以提取感兴趣区域的平均应变和某个点（例如破裂位置）的局部应变。

对于 图8中的代表性样品，局部应变数据显示样品内变化很大。对于 图8中的代表性测试样品，发现局部菌株的样本内变化很大（观察到的菌株的范围如下:ε_xx = -0.30-0.17;ε_xy = -0.13-0，20;ε_yy = 0-0.40）。这强调了获得局部数据的重要性，而不是通过组织同质性假设获得的粗略平均值。

关联机械和结构组织信息
上述结果允许组织的局部变形和破裂行为与胶原蛋白结构相关联。一旦在相机记录中确定了破裂位置（图9A），就可以将其映射回参考相机图像（图9B）和显微镜切片扫描（图9C）。这提供了发生破裂的 MPM-SHG 瓷砖以及在此瓷砖上发现的结构参数（图 9D）。在代表性样品中发生破裂的瓷砖中发现的结构参数（如图9所示）为μ p = 28°，σ_p = 19°，P_ani = 0.6。相同的程序也可以应用于未破裂的组织位置。重要的是要注意，在斑点图案不佳且自然地标不明确的情况下，从破裂框架在参考图像上映射破裂位置可能具有挑战性。此外，如果组织的自然标志不够清晰，则瓷砖扫描叠加和高速相机图像的共同配准可能很困难。

图1:所呈现的实验方案的工作流程图。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:从磁贴扫描中选择用于 SHG 成像的图块。 （A） 固定在硅中的测试样品。（B）通过明场显微镜获得的测试样品的瓷砖扫描。为 SHG 成像选择的切片由蓝色方块标记。（C） MPM与SHG的最大强度投影。比例尺 = 140 μm （C）。缩写:SHG = 二次谐波产生;MPM = 多光子显微镜。请点击此处查看此图的大图。

图3:放置在多光子显微镜物镜下的斑块样品。 斑块样品的位置由磷酸盐缓冲盐水填充的培养皿固定。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:定制设计的单轴拉伸测试仪，标明了不同的组件 。 （A） 系统的总体概述。请注意，夹子中的砂纸插入物是可见的，因为只连接了底部夹子。（B） 拉伸试验机夹具的放大图像，试样准备进行测试。缩写:PVC = 聚氯乙烯;LED = 发光二极管。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:来自代表性样品的组织收集和样品制备结果 。 （A）新鲜和完整的斑块样本，取自接受颈动脉内膜切除术的同意患者。（B） 通过μCT扫描进行3D重建。钙化组织以浅蓝色显示，非钙化组织以红色显示。从蓝线之间的区域可以获得没有钙化组织的最佳样品。（C）μCT扫描的3D重建显示具有过量钙化组织的次优斑块。比例尺 = 3 毫米。缩写:μCT = 微计算机断层扫描。 请点击此处查看此图的大图。

图 6:来自代表性样本的 MPM-SHG 结果。 （A） 磁贴扫描概述;所选的成像切片以蓝色显示。（B） 来自各种瓷砖的 MIP。（C） FOA 工具从选定的瓷砖 进行纤维检测。（D） 所选瓷砖的纤维取向直方图。（E）纤维取向直方图+高斯拟合，从中提取所选瓷砖的胶原蛋白结构参数。（F） 表示整个斑块样本的 μ p（方向黑线）和 σ_p（背景颜色）。（G）整个斑块样品中μ_p（方向黑线）和P_ani（背景颜色）的表示。比例尺 = 140 μm （B，C）。缩写:MPM-SHG = 多光子显微镜-二次谐波产生;MIP = 最大强度预测;FOA = 纤维取向分析;μ_p = 主要纤维角度;P_ani = 各向异性分数;σ_p = 光纤角度分布的标准偏差;P_iso = 各向同性分数。请点击此处查看此图的大图。

图7:拉伸测试过程中斑块组织样本中的破裂起始和传播.1）预拉伸 状态，完整组织。 2） 破裂起始-观察破裂的第一帧。破裂起始位置用红色方块标记。 3 ）和 4） 破裂传播。 5） 斑块样本完全破裂。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看此图的大图。

图 8:通过 DIC 分析获得的代表性样品（ε_xx、ε_xy 和_{ε yy}）在破裂前框架处的绿色-拉格朗日应变图。 给出了整个斑块的平均值和标准偏差，以及破裂位置处的应变。缩写:DIC = 数字图像相关;ε_xx = 纵向应变;ε_xy = 剪切;ε_yy = 拉伸应变。请点击此处查看此图的大图。

图 9:在图像上叠加破裂位置（红色方块）的图像。 （A）高速相机图像，其中识别破裂（破裂帧）。（B） 高速相机图像，其中仅应用预拉伸（参考帧）。（C）通过显微镜获得的瓷砖扫描图像。（D）彩色编码图，显示各种瓷砖上的局部胶原蛋白结构参数。呈现整个斑块样品的μ_p（方向黑线）和P_ani（背景颜色）。缩写:μ_p = 主要光纤角度;P_ani = 各向异性分数。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

目前的研究重点是开发一种机械成像管道，以研究纤维动脉粥样硬化斑块组织的局部胶原取向和分散、局部机械性能和破裂行为之间的相关性。本文描述的协议具有创新性，原因有几个。首先，这是首次应用数字图像相关来测量机械载荷下纤维斑块组织的局部变形。其次，该协议提供了必要的信息来分析局部变形模式与纤维斑块组织的局部胶原结构之间的关联。结果部分中提供的菌株数据和胶原蛋白数据都强调了局部评估的重要性，这些数据显示了组织的异质性。因此，建议使用能够进行局部评估的技术，例如本协议中使用的技术，用于纤维斑块特性的未来研究。

测试样品制备是该协议的关键步骤之一。颈动脉斑块主要是胶原组织;然而，它们可能包含钙化，被认为会影响整体斑块机械行为^36，37。由于研究的重点是斑块的纤维组织成分，因此通过使用μCT成像³⁸避免了测试样品中的钙化。如果 μCT 不可用，可以考虑其他成像技术（如 MRI 或 OCT³⁹ ）来检测斑块中的钙化区域。对于严重钙化或含有分散钙化的斑块，获得没有钙化且尺寸足够大且可用于机械测试的纤维组织测试样品可能是一项具有挑战性的任务。该协议中另一项具有挑战性的任务是为数字图像相关生成最佳斑点模式。最佳DIC需要50:50²⁸ 的黑白比和三到五个像素²⁹ 的斑点大小以确保适当的质量。未能满足这些要求可能会导致局部应变测量不准确。最后，如果组织的自然标志不清晰，将破裂位置映射到SHG图像可能具有挑战性。对于此类样本，在成像前对组织应用几种基准标记物将有所帮助。

当前协议中使用的MPM-SHG技术优于许多其他胶原蛋白成像技术，因为它是一种具有相对较大穿透深度的高分辨率和非破坏性技术。然而，MPM-SHG的穿透深度（<400μm）存在局限性，因为它不允许对测试样品的整个厚度进行成像，其范围在0.5至2毫米之间。在最近的一项弥散张量磁共振成像（DT-MRI）研究中，我们已经证明斑块组织较深部分的主要纤维取向可能与组织更浅表的管腔部分的主要纤维取向不同¹⁴。因此，有必要进一步研究厚纤维斑块组织样本较深部分的局部胶原结构及其与局部组织力学的关系。为此，可以利用偏振空间频域成像（pSFDI）。据报道，这种最近开发的光学成像技术有可能测量二尖瓣小叶中深达0.8毫米的纤维取向¹²。pSFDI还提供快速采集，这也有助于整个样品区域的可视化，而不是像当前协议那样仅选择瓷砖。当前协议的另一个限制是只能识别表面变形。在未来的研究中，可以将镜子辅助多视图DIC⁴⁰ 或数字体积相关（DVC）⁴¹ 包含在该协议中，以获取有关体积，地下应变的其他信息。

当前的实验方案可以通过多种方式进一步扩展或修改，以获得有关斑块破裂力学及其与底层微观结构关系的其他信息。首先，目前的协议包括圆周方向的单轴拉伸测试。之所以选择这种类型的机械测试，是因为斑块在 体内主要经历圆周方向的拉伸拉伸。为了更全面的机械表征，该协议可以进一步扩展，以纳入纵向膨胀测试，双轴测试或单轴拉伸测试。其次，目前的协议只关注通过DIC获得局部菌株。然而，通过在协议中包括局部应力分析，可以获得斑块力学行为的更完整视图，但这需要表征局部刚度。尽管目前具有挑战性，但这可以通过计算技术来实现，例如逆有限元方法^42，43 和虚场方法⁴⁴。除了实验适应之外，还可以在当前协议中添加一些额外的后处理步骤。首先，不仅可以识别破裂位置，还可以通过获得的高速相机图像 识别 裂纹扩展路径。该传播路径可以与局部结构和机械参数相关联。其次，在所述方案中直观地识别破裂起始位置。之前对非生物组织的研究使用DIC应变测量中的不连续性来检测破裂⁴⁵。在斑块组织上应用这种自动破裂检测可能会提高破裂检测的准确性。最后，与其他胶原成像技术相比，MPM-SHG的一大优势是它可视化单个胶原纤维。因此，通过该协议 获得 的数据也可用于研究其他局部胶原蛋白特征，例如胶原蛋白含量。

该协议可用于更好地了解纤维斑块组织的局部特征，该成分在体内斑块破裂中机械失效。需要这些信息来建立新的结构和功能成像标志物，以预测患者的斑块破裂。这些新标志物是必要的，因为先前建议的风险生物标志物已被证明对未来的临床事件具有次优的预测价值^5，6。将来，OCT和ps-OCT可以识别和量化动脉系统中的纤维组织⁴⁶，^47，48。此外，菌株被认为是局部斑块组合物的替代标志物⁴⁹。因此，体内应变测量⁴⁹可能有助于识别患者的斑块稳定性。但是，应注意将获得的结果直接转化为体内斑块破裂。首先，纤维斑块组织在体内经历比本协议中使用的单向拉伸载荷更复杂的负荷。其次，动脉粥样硬化斑块是多组分结构;纤维斑块组织中的体内应力和应变分布可能受到其他斑块成分的存在和位置的影响，例如钙化³⁷。

这种机械成像管道也可用于研究其他胶原组织。胶原蛋白的全球力学测试和结构成像已经广泛用于生物组织。然而，对失效前和失效特性以及胶原蛋白结构的局部评估对于异质纤维组织的准确力学表征至关重要。我们预计，这一新协议的结构将为几种生物组织的微观结构和力学之间的相互作用提供进一步的见解。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mm 延长环	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL 管	VWR	525-0150
20x APO 水浸物镜	Leica	507701
3D 切片软件	N/A	版本 4.11
50 mL 管	VWR	525-0156
喷枪手枪 AB 430 - 喷嘴直径 0.3 mm	Conrad	4.01614E+12
遮光，尼龙织物聚氨酯涂层	Thorlabs
黑色组织染料	Polysciences inc	24113-2
相机镜头，焦距 50 毫米	Thorlabs Inc.
相机支架	VWR	241-0093， 241-7311
变色龙 Ultra 多光子激光器	相干
压缩机 + 空气软管	JUN-AIR、Conrad	B07GB9HC62、4016138577198
Excel	Microsoft	版本 2208
泡沫胶带双面，1.9 x 150 厘米	Pattex
加热浴	N/A		定制
高速相机 + 成像软件	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
人颈动脉粥样硬化斑块（来自颈动脉内膜切除术）	N/A
图像 J	美国国立卫生研究院	N/A
LAS-AF	徕卡	2.3	版成像软件 多光子显微镜
徕卡 TCS SP5 II	用于 SHG 成像	徕卡
照明系统	AMZ 仪器	LED-60TB	用于使用高速相机获取清晰的图像
MATLAB	MathWorks	版本 R2021A
基于 MATLAB 的 FibLab 软件	埃因霍温理工大学	N/A
基于 MATLAB 的 FOA（纤维取向分析）工具	埃因霍温理工大学	基于 N/A
MATLAB 的 Ncorr 软件	格鲁吉亚理工学院	1.2
版	针翡翠	BDAM302986
培养皿（直径 10 厘米）	VWR	BRND452000
封口膜	VWR	291-1214
巴斯德移液器	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 微量计算机断层扫描（μCT） 扫描仪 + 铜 0.06 毫米 + 铝 0.5 毫米的 X 射线滤光片	珀金埃尔默	CLS149276
尺	精细科学工具	1800030
砂纸 （P180）	康拉德	4.00932E+12
侧刀	康拉德	4.25084E+12
硅弹性体基材和固化剂 （Sylgard 184）	VWR	634165S
拉伸测试仪 + 软件 +夹具	N/A		使用圆柱形线性执行器（EACM2E10AZAK，Oriental Motor Ltd.）和 10 N 称重传感器（LCMFD-10N，Omega Engineering Inc.）在内部制造
扭矩螺丝刀	Garant，Hoffman 组	659906