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研究局部胶原结构与动脉粥样硬化斑块纤维组织力学特性相关性的方法

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DOI：

10.3791/64334

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2022年11月11日

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1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

本文内容

摘要

我们开发了一种力学成像分析流程，用于研究动脉粥样硬化斑块在结构和力学特性上的异质性。该分析流程能够关联纤维斑块组织中胶原纤维取向的局部主导角度与分散程度、破裂行为以及应变特征图谱。

摘要

冠状动脉和颈动脉中动脉粥样硬化斑块的破裂是致命性心血管事件的主要原因。然而，这种结构异质、富含胶原的斑块组织的破裂力学特性，以及该特性如何与其纤维结构相关，目前尚不清楚。现有的研究斑块力学特性的方法仅限于获取斑块组织的整体力学特征，其前提是假设组织结构具有均一性。然而，纤维性斑块组织在结构上本质上是异质的，这可能主要归因于胶原纤维架构在局部区域的差异。

本文所述的力学成像流程旨在研究斑块异质性的结构与力学特性。该流程采用多光子显微镜（MPM）结合二次谐波生成（SHG）技术，对组织局部的胶原结构进行表征；同时利用数字图像相关（DIC）分析方法，在单轴拉伸测试条件下表征组织的断裂行为。该实验流程可实现纤维斑块组织中局部胶原纤维优势取向角与取向分散度、破裂行为以及应变特征图谱之间的关联分析。所获得的知识对于更深入理解、预测和预防动脉粥样硬化斑块破裂事件具有重要意义。

引言

缺血性卒中常由颈动脉粥样硬化斑块破裂引发，是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一1。然而，目前用于预防颈动脉粥样硬化相关卒中的外科治疗规划策略并未包含对斑块破裂风险的评估2。这主要是因为先前提出的生物标志物（如斑块纤维帽厚度3和脂质核心大小4）已被证明对未来临床事件的预测价值有限5,6。深入理解斑块的力学特性及破裂机制，对于优化斑块破裂风险评估并识别新的动脉粥样硬化斑块风险标志物至关重要。

斑块破裂是一种局部力学事件，即高度纤维化的斑块组织无法承受血压施加的机械负荷，从而失去结构完整性7。尽管如此，斑块破裂事件的力学机制及其与基础微观结构之间的关联仍不明确8。少数对斑块组织失效特征进行表征的实验研究9,10,11,12,13仅报告了整体性的机械破裂特性（即极限拉伸断裂应变和强度），这些参数的获取基于组织结构均质性的假设。然而，纤维性斑块组织在结构上具有异质性，这可能主要归因于胶原纤维架构的局部差异14。此外，斑块组织的力学失效特性与胶原结构之间的关联仅在Johnston等人最近的一项研究中得到探讨。该研究显示不同斑块间主要纤维取向存在差异，并报告了纤维帽样本中以周向为主导纤维取向的斑块具有更高的极限应力和更低的极限应变15。然而，该研究同样局限于整体性的力学和结构性质。

为了揭示纤维斑块组织中胶原蛋白局部结构及局部力学特性的关键信息，本研究建立了一种力学-成像联合分析流程。该ex vivo流程可定量分析胶原纤维的局部取向方向与分散程度，以及局部断裂应变。该流程包括利用基于二次谐波产生（SHG）的多光子显微成像（MPM）对斑块组织中的胶原纤维进行成像，以及结合数字图像相关法（DIC）与单轴拉伸试验来定量评估组织的破裂特性。

多光子显微镜-二次谐波生成（MPM-SHG）已成为研究生物组织中胶原蛋白的一种常用技术16与组织学等其他胶原成像技术相比，该技术具有多种优势17，弥散张量成像（DTI）14，以及小角光散射（SALS）15首先，MPM-SHG成像具有非破坏性，因此非常适合与力学测试相结合18其次，SHG信号对胶原具有特异性，因此无需对组织进行染色。由于激发波长较长（近红外），其穿透深度大于其他显微技术。16高分辨率（µSHG成像所达到的m级分辨率还可实现对单根纤维的可视化，从而为胶原纤维数量、胶原纤维取向及分布的局部定量分析提供了多种可能19.

数字图像相关法（DIC）结合力学测试是一种广泛使用的方法，用于获取生物组织的局部力学特性20。在DIC中，通过比较力学测试过程中高速相机采集的图像，追踪施加在组织表面的散斑位移20。该图像后处理方法可用于估算试样表面的全场应变分布20，也可用于研究组织的断裂行为21。

方案

本文所述所有方法均经鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心伦理研究委员会批准；在采集斑块标本前，已从患者处获得知情同意。本方案的工作流程图见图1。

1. 组织采集、显微计算机断层扫描（µCT）成像及测试样本制备

  1. 组织采集与保存
    1. 从签署知情同意书并接受颈动脉内膜切除术的患者中采集新鲜的人类颈动脉粥样硬化斑块标本。
      注意：此次手术获取的斑块样本包含颈动脉的病变内膜层，包括脂肪积聚（脂质池）和钙化物22.
    2. 使用磷酸盐缓冲液（1x PBS）去除血液残留，并用纱布垫将样本擦干。
    3. 使用镊子将样本放入15 mL离心管中。将离心管置于液氮中10分钟，对组织进行速冻。
    4. 速冻后，将样品保存在 -80 °C 超低温冰箱中，直至进行 µCT 成像当天。
      ​注意：速冻可最大限度减少晶体形成，从而降低组织中的微结构损伤。先前一项关于猪主动脉组织的研究表明，速冻并在 -80 °C 下保存对组织的力学性能无显著影响23.
  2. μCT成像
    1. 在进行显微CT成像当天，将斑块样本从15 mL离心管中取出。若组织粘附于管壁，可向管内加入室温磷酸盐缓冲液（PBS），使组织浸泡在PBS中，直至样本能够顺利取出。
    2. 用纸巾将斑块样本彻底擦干。
    3. 按下按钮以开启 µCT 系统 绿色 按钮。按下 预热 在CT软件屏幕底部等待15分钟。
    4. 手动将一块由0.06 mm铜和0.5 mm铝组成的X射线滤光片放入µCT系统中。
    5. 选择用于存储图像的文件夹。
    6. 选择参数 左侧面板. 使用下拉列表选择一个 扫描时间 的 4 分钟，一个 分辨率 的 172 µm，a 电压 的 90 kV，一个 电流强度 的 88 mA，一个 视野 的 86 mm，以及一个 旋转 的 360°.
    7. 打开设备的门，手动拉出平台。
    8. 将Parafilm置于平台上，并将样品放置在平台的一端（平台较远的一端）。
    9. 手动将平台放入设备中，并关闭门。
    10. 激活 实时模式 (眼 使用设备上的箭头移动平台，将样本置于视场中心。
    11. 开始 成像（底部中央的图标）。成像完成后，按下 门 底部的图标（位于 中止 按钮）
    12. 在完成µCT扫描后，按照步骤1.1.3所述再次快速冷冻斑块样本。将其储存于-80 °C，直至进行多光子显微成像和力学测试当天。
    13. 在开源的 3D Slicer 软件中打开 µCT 成像获取的 DICOM 文件24.
    14. 前往 片段 编辑器。选择 创建新的分割 | 将待分析的体积作为主体积.
    15. 点击 添加 添加一个片段。按下其 名称 和 颜色 更改这些 参数.
    16. 要定义片段，请单击 效应 | 阈值 在窗口的底部。使用此功能 阈值 区分的工具 钙化的（>450 HU）和 非钙化（<450 HU) 组织区域。选定阈值后，按压 应用 在底部。
    17. 按压 显示3D （位于右侧） 添加) 在三维视图中可视化分割结果。如果分割结果中存在不需要的区域，使用 剪刀 效应。
    18. 更改片段的不透明度 分割 通过点击模块来 所需分割的名称.
      ​注意：如果可能，µCT成像及µCT图像的审阅可与本方案其余步骤在同一天完成。在此情况下，跳过步骤1.2.12。但需注意，本方案后续步骤同样耗时，也应在同一天内完成。经过一定练习后，使用所述设置和组织样本，µCT成像约需45分钟，µCT图像审阅约需15分钟，单个测试样品制备约需1小时，显微镜观察约需4小时，单轴拉伸测试约需2小时。
  3. 测试样品制备
    1. 在进行胶原成像和力学测试当天，将斑块置于室温的磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡约10分钟以解冻。
    2. 在3D Slicer软件中打开步骤1.2.13–1.2.18中创建的斑块三维结构。
    3. 利用斑块组织的天然解剖标志来确定三维重建中哪些部分对应于真实的斑块样本。在三维重建中识别出不含钙化区域的部分，并在真实斑块中目视定位该区域。
    4. 使用手术剪和镊子沿动脉的纵轴将斑块切开。如果手术切口已存在，应从此切口开始切割，以最大限度地利用组织。若样本不呈管状结构，难以确定纵向方向，则应排除该样本，不予检测。
    5. 从斑块标本中裁剪出矩形测试样品。确保测试样品尽可能大，同时避开含有撕裂或钙化区域的组织。裁剪时需格外小心，因为测试样品边缘的微小撕裂或裂纹可能在拉伸试验过程中导致裂纹从已有裂口处扩展。
    6. 确保测试样品的宽长比（WL）为 <1 在安装到拉伸试验机中后，标距内应保持一致。如果样品满足此要求，则在边界条件方面适用于适当的拉伸试验25.
      ​注意：样品尺寸的范围可能较大。作者测试的样品中，标距长度范围为3.4至12.9 mm，宽度范围为1.6至6.4 mm。

2. 多光子显微成像

  1. 样品制备
    1. 在进行胶原成像和力学测试的前一天，将40 g硅胶弹性体基质均分至两个50 mL离心管中，再使用巴斯德吸管向每管中加入2 g固化剂（比例为1:10）。用吸管混合两组分。
    2. 将离心管在700 × g条件下离心1分钟 g 尽可能去除空气泡。
    3. 将培养皿（直径10 cm）中铺上一层薄硅胶（厚度约0.5–1 cm），然后在65 °C烘箱中孵育3小时，或在室温下放置48小时。
    4. 取一个斑块测试样本，用针将样本两端固定在硅胶上图2A）。确保样本的腔面朝上。将针插入样本的区域，该区域将在机械测试期间被固定在拉伸测试设备的夹具中。
    5. 戴上安全眼镜。使用侧切钳将针头剪短，使其在样品表面以上仅露出几毫米，以防止损坏显微镜物镜。向培养皿中加入PBS，直至样品完全浸没。
  2. 显微镜设置
    1. 确保多光子显微镜上安装了合适的物镜。使用专为透射红外光优化、放大倍数为20倍的物镜。
    2. 启动显微镜系统。打开显微镜的操作软件。
    3. 初始化成像载物台时，确保显微镜聚光镜臂已向后推回，且物镜处于最低位置。
    4. 激活多光子激光器。
    5. 将装有测试样品的培养皿置于物镜下方，如同 图3切勿将物镜置于样品上方，因为激光参数仍需优化。否则，激光可能的高功率会导致组织损伤。
    6. 确保物镜略微浸入 PBS 中。如有需要，可用移液器添加额外的 PBS。
    7. 将光波长设置为 880 nm。
      注意：选择此波长是因为所用双光子系统中的二次谐波生成（SHG）发射滤光片的中心波长约为440 nm。对于其他显微镜系统，可能适用不同的波长。
  3. 平铺扫描与成像位置选择
    1. 关闭多光子激光器并激活 明场 显微镜的模式。然后，打开 活体扫描 模式。
    2. 将载物台移至物镜位于样品上方的位置，并调节至样品表面清晰对焦。转动 关闭 的 活体扫描 模式。
    3. 在……之下 采集 标签，在 第二面板，更换 缩放倍数 到 1 通过滑动目标滑块。
      注意：此缩放因子与物镜的放大倍数（20倍）共同决定了所捕获图像的尺寸（739 µm × 739 µm）。
    4. 在……之下 采集 标签，位于 第二面板，更换 扫描速度 到 400 Hz， 这些 线平均 到 1，以及 分辨率 至 每幅图像 128 x 128 像素 (像素大小 的 ~5.8 µm × 5.8 µm）通过使用下拉列表。
    5. 在……之下 采集 标签，在 第一面板，点击 光栅模式 符号并等待 平铺扫描面板 即将发表
    6. 打开 活体扫描 模式。使用智能面板上的旋钮将物镜移至样品的一个角落，然后点击图块扫描面板中的标记位置符号。对样品的每个角落重复此操作。如果操作正确，用于成像的所有选定图块将形成一个橙色网格。
    7. 关闭 自动拼接 功能
    8. 点击 开始 在屏幕右下角创建整个样本表面的拼接扫描，以获得样本几何结构的概览。
      注意：根据所述设置、组织类型和显微镜系统，获取整个样本表面的拼接扫描图像约需10分钟。
    9. 完成拼接扫描后，在显微系统软件自动显示的拼接扫描面板中，观察每块图像左上角的 x 和 y 坐标，并将这些坐标记录在电子表格中。
    10. 在显微镜软件中，在 平铺扫描面板，观察名为的框中x方向和y方向的瓦片数量 扫描视野注意电子表格中图块扫描的尺寸。通过加上/减去图块尺寸（739 µm）来计算其他图块的坐标。
      注意：这些坐标对于确定使用SHG成像扫描的图块的精确位置至关重要。如果总成像时间不是限制因素，可对所有图块进行成像，无需跳过任何图块。
    11. 从平铺扫描图像中选择将用于二次谐波成像（SHG成像）的区域。在选择时，应避开将被夹具覆盖的区域，并在所选区域之间沿纵向和周向均间隔一个区域，如图所示。 图2B.
  4. 可视化胶原蛋白：二次谐波成像
    1. 关闭房间内的灯光，并用遮光布覆盖显微镜载物台，确保房间内的光线无法到达探测器。
      注意：尽量减少到达检测器的光线可降低图像采集过程中的噪声。
    2. 转动 多光子（MP）激光器 开启。
    3. 选择 非扫描检测（NDD）探测器 配备有 430-450 nm 带通滤光片.
    4. 根据步骤 2.3.10 中获取的信息，确定需要成像的图块位置。填写 坐标 在指定的框中并点击 进入，因此物镜移至右侧的区域。打开 实时扫描模式.
      注意：使用其他显微镜或更新版本的操作软件时，可在拼接扫描区域内自动移动至各个位置。在此情况下，无需记录每块图像的x和y坐标（步骤2.3.10），也无需在操作软件中输入坐标（步骤2.4.4）。
    5. 使用滑块增加多光子激光器的功率 上图 在……下方 光路设置 在不引起明显漂白的前提下，获得尽可能高的激光功率。然后，调节 探测器增益 获得明亮的图像，同时避免像素饱和，通过使用 knob 在 智能面板 或点击名称 检测器 在……下方 光路设置 | 附加通道典型值为 探测器增益 介于 500 和 800 V.
    6. 使用 z轴位置调节旋钮 在 智能面板 调节焦平面。
    7. 移动到样品顶部，通过点击来设定 z 轴堆叠顶部的位置 箭头 在 z轴层扫面板 （在下方的 采集选项卡 | 3rd 面板).
    8. 然后，聚焦样品直至无法检测到SHG信号——此即为图像栈的终点。再次点击 箭头 在 z轴堆叠面板 以设定此位置。完成后，关闭 关闭 的 活体扫描 模式。
      注意：组织可能并非完全平整，因此组织内不同区域的样本表面在 z 方向上的位置可能略有差异。
    9. 在……之下 采集 标签，位于 第二面板，保持 扫描速度 在 400 Hz，设置 线平均 到 2，以及 分辨率 至 每幅图像 512 x 512 像素 (像素大小约为 1.4 µm × 1.4 µm）通过下拉列表进行选择。开启 双向X轴扫描按钮.
    10. 点击 z轴步长 在 z轴层扫面板 并填充一个 z轴步长 的 3 µm 在盒子中。点击 开始 在 右下角 创建z轴堆栈。完成后，务必将该图像块的坐标保存在文件名中，或为每个图像块分配唯一的编号（如 图2B).
      ​注意：根据所述设置、组织样本及显微镜系统，单个图块的z轴层扫采集耗时约10–15分钟。此时间估算已包含准备步骤（步骤2.4.4–2.4.10）。

3. 机械测试

  1. 单轴拉伸试验装置的制备
    1. 制作横向拉伸测试装置（图4) 按照拉伸试验机的使用说明进行准备（例如，启动软件、安装夹具、连接负荷传感器），以备使用。
    2. 为尽量减少测试样品的滑动，粘贴双面泡沫胶带（图 4AB-2将拉力试验机夹具的内表面粘上砂纸，泡沫胶带的内侧也粘上砂纸。最终，砂纸将与测试样品接触。
    3. 将加热浴放置（图4AB-3) 固定到位。向加热浴槽中加入 PBS，液面高度至夹具底面为止，此时不应接触到砂纸。
    4. 打开加热浴的电源，将温度设置为约 37 °C。
    5. 将高速摄像机安装在拉伸测试系统上方（图 4A-4），例如使用实验室支架固定，并通过延长环将焦距为50 mm的镜头安装在相机上。
    6. 确保夹具处于焦点位置，且视场范围足够大，能够在整个拉伸过程中完整记录样品（视场宽度：± 样品宽度；视场长度：± 2倍样品长度）。
    7. 安装照明系统（图 4A-5将照明系统置于拉伸测试系统上方，例如使用实验室支架固定。打开照明系统，并调节光照强度和位置，确保PBS表面在相机图像中无任何反光。
    8. 调节 曝光时间 和 增益 调整相机以获得清晰的图像。
    9. 将图像采集软件设置为捕获模式 30 帧/秒 在 分辨率 的 5.2 MP.
      注意：需要此高帧率以进行后续的微分干涉差（DIC）分析并研究破裂行为。
    10. 设置其中一个夹具的位移速度，使力学测试过程中的整体工程应变率与 体内 组织的生理应变率
      (斑块组织的5%/秒)26).
  2. 散斑图样的生成
    注意：本斑点图谱实验方案基于 Walsh 等人先前的研究工作。27.
    1. 用纸巾轻轻拍打样品以使其干燥。
    2. 将黑色组织染料放入喷笔的指定容器中。
    3. 将喷笔连接至压缩机。打开压缩机电源。 喷笔压缩机 开启并设置 压力 至 25 PSI.
    4. 在将颗粒喷洒到组织上之前，先尝试在纸上创建最佳的散斑图案。反复喷洒数次，直至获得理想的散斑效果。 黑白 比率 50:5028 达到要求。前后移动喷笔的针头，调节散斑图案的粗糙度，直至 斑点的大小 与……的大小相似 3-5 像素 高速相机的29.
      注意：该散斑图案将用于两个不同目的。首先，通过比较力学测试期间高速相机采集的图像，测量这些散斑的位移（数字图像相关法，步骤4.2）。其次，利用该散斑图案在试样未变形状态的图像上识别断裂位置（步骤4.3.1）。
    5. 将喷枪保持在测试样本约30 cm处，向管腔表面喷涂。
    6. 室温下让染料与样本结合1分钟，然后将样本浸入PBS中。
  3. 单轴拉伸试验
    1. 将样品置于拉伸试验机的夹具中，使样品的周向与拉伸方向对齐，样品的腔面朝上。确保初始标距设置使得 WL比值 的 条带 是 <1.
    2. 拧紧夹具的螺丝，同时施加一个 扭矩 的 20 cNm 使用扭矩螺丝刀。先对每个螺丝施加较小的扭矩，再逐步施加最终扭矩，以此方式逐步完成。
    3. 目视检查样本是否存在可能影响检测结果的撕裂。
    4. 向加热浴中加入更多PBS，直至样品完全浸没，并等待PBS温度再次升至37 °C。
    5. 使用高速相机获取校准图像，图像中应包含测试样本和作为参考的标尺。确保标尺与相机物镜的距离和样本内腔表面与物镜的距离相同。
    6. 将载荷传感器归零，并开始记录拉伸试验机的载荷传感器和执行器测得的整体力和位移数据。
    7. 通过施加作用力使样品伸直 预拉伸 的 0.05 N 消除样品中的松弛部分。执行 10 个循环 预处理的持续时间长达 10% 应变 基于施加预拉伸后由执行器测量的标距长度。
    8. 开始单轴拉伸试验直至样品完全断裂，同时使用高速摄像机记录样品变形过程的视频。组织断裂后，停止记录整体的力和位移测量数据。
      注意：某些商用拉伸测试仪可自动执行步骤 3.3.6–3.3.9。本方案描述的是当所用拉伸测试仪不包含该自动功能时所需进行的手动操作步骤。
    9. 从拉伸测试仪中取出测试样品，并妥善处理丢弃。
    10. 测试下一个样品时，更换夹具上的砂纸和泡沫胶带。

4. 数据分析

  1. 胶原组织分析
    1. 使用 ImageJ 打开通过多光子显微镜结合二次谐波成像（SHG）获得的 z 层扫描图像，并对每个 z 层扫描图像生成最大强度投影（MIP）。
    2. 使用基于开源 MATLAB 的 FOA（纤维取向分析）工具分析每张最大强度投影（MIP）图像30 测量瓷砖中单个胶原纤维的取向角度。使用以下参数： 量程：[3 4 5] 或 [2 4 6]，根据血管直径的不同，以及 血管性阈值：0.999，0.9995，或 0.9999，取决于SHG信号的强度。
      注意：有关如何使用此工具的更多详细信息，请参见软件手册31.
    3. 使用另一个基于 MATLAB 的开源工具 FibLab32，以将高斯分布拟合到角度分布直方图。
      注意：有关如何使用此工具的更多详细信息，请参见软件手册32.
    4. 从使用 FibLab 获得的高斯分布图中，从 MATLAB 工作区提取以下结构参数： 主要纤维角度（µp)，即该分布的众数， 标准差（σ）p纤维取向分布的），以及 各向异性分数（Pani = 1 − Piso).
      注意：各向同性组分是高斯分布中基线以下的面积，而各向异性组分则包含叠加在该基线之上的峰面积。33σp 和 Pani 提供有关瓦片区域内纤维取向分散性的信息。
    5. 用于视觉检查，绘制图表 µp 通过使用定向线条和 σp 和 Pani 通过使用颜色图。
  2. 数字图像分析与破裂分析
    1. 对相机图像进行目视检查，以确定裂纹起始发生的帧。在该帧中，通过目视确定裂纹起始位置。
    2. 对相机图像进行目视检查，以确定在机械测试开始时断裂位置是否存在任何裂纹或撕裂。如果存在此类撕裂，则将该样本排除在分析之外。
    3. 使用开源的基于 MATLAB 的软件 Ncorr（v1.2）进行数字图像相关（DIC）分析34. 按照 Ncorr 手册中的步骤操作35.
      1. 使用拉伸试验期间高速相机记录的图像进行数字图像相关（DIC）分析。选择最终拉伸至断裂前（预 conditioning 后）的最后一个帧作为参考图像 参考图像. 对于 当前图像选择从最终拉伸开始到裂纹萌生前一帧之间的所有图像。
      2. 选择样品表面作为感兴趣区域（ROI），排除靠近夹具（约1 mm范围内）的区域，因为这些区域的应变会受到夹持作用的显著影响。
      3. 使用以下参数进行微分干涉相差（DIC）分析： 子集半径：30 像素；子集间距：3 像素；迭代截止值：50；差分向量范数截止值：10-5；应变半径：5；自动传播，步数：5.
      4. 通过Ncorr的DIC分析，获得感兴趣区域（ROI）的格林-拉格朗日应变（或欧拉应变）分布。利用这些应变分布，计算破裂前最后一帧整个斑块样本表面的平均格林-拉格朗日应变。计算破裂位置处的格林-拉格朗日应变。
  3. 在破裂位置关联结构与力学数据
    1. 利用测试样本中的自然标志点以及施加在测试样本上的散斑，确定断裂位置（在步骤4.2.1中已识别）在参考图像中的对应位置（步骤4.2.3.1）。
    2. 利用测试样本中的天然标记物，将参考图像与平铺扫描图像（步骤 2.3）进行叠加，以确定平铺扫描图像中断裂的位置。确定发生断裂的 MPM-SHG 平铺区域。如果断裂未发生在 MPM-SHG 扫描的平铺区域内，则确定距离断裂位置最近的平铺区域。获取断裂发生位置处平铺区域的结构参数。

结果

组织采集与测试样本制备
组织采集可获得斑块纤维组织样本，可进一步分离为独立的测试样本，用于结构成像和单轴拉伸试验。理想情况下，采集的纤维组织样本应包含极少或没有撕裂区域（图5A）和大范围钙化（图5B）。若存在过多的撕裂和钙化（图5C），可能导致斑块样本无法满足前述 WL 1 的样本尺寸要求。

多光子显微成像
二次谐波成像及图像后期处理可从每张成像图块中生成最大强度投影图（MIP）（图6A、B）。进一步通过纤维检测进行后期处理（图6C），可得到纤维取向直方图（图6D），并从中提取胶原结构参数（图6E）。此外，还可获得显示整个斑块样本中局部胶原结构参数的空间分布彩色图谱，用于可视化分析（图6F、G）。对于图6中的代表性测试样本，发现其胶原结构参数在样本内部存在较大变异（若以周向定义为0°，则µp = -34° ± 32°；σp = 21° ± 4°；Pani = 0.49 ± 0.14）。这种样本内部的异质性凸显了获取局部结构参数的重要性，而非假设其结构均一。

力学测试
破裂行为
高速相机可提供斑块样本在力学测试过程中变形和破裂行为的图像（图7）。通过这些图像可识别破裂起始位置及破裂扩展路径。若相机图像中存在气泡或反射现象，或破裂扩展过快而无法被所选帧率捕捉，则破裂识别结果将不理想。

局部应变模式
对单轴拉伸测试过程中采集的相机记录进行数字图像相关分析，可得到局部组织变形图，例如图8所示的格林-拉格朗日应变图。这些图展示了在裂纹萌生前某一帧的三个应变分量（εxx、εxy 和 εyy）。通过这些应变图，可提取感兴趣区域的平均应变以及特定位置（如裂纹发生位置）的局部应变。

对于图8中的代表性样本，局部应变数据显示出较大的样本内变异。在图8所示的代表性测试样本中，局部应变存在显著的样本内变异（观测到的应变范围如下：εxx = -0.30–0.17；εxy = -0.13–0.20；εyy = 0–0.40）。这凸显了获取局部数据的重要性，而非基于组织均质性假设所得的整体平均值。

关联组织的力学与结构信息
上述结果可将组织的局部变形与断裂行为与其胶原结构相关联。一旦在相机记录中确定了断裂位置（图9A），便可将其回溯映射至参考相机图像（图9B）以及显微镜平铺扫描图像（图9C）。由此可确定发生断裂的多光子显微成像-二次谐波成像（MPM-SHG）平铺区域，并获取该区域内的结构参数（图9D）。在代表性样本中，断裂发生区域的结构参数如图9所示，分别为 µp = 28°, σp = 19°, 和 Pani = 0.6。相同方法也可应用于未发生断裂的组织区域。需要注意的是，若散斑图案质量较差或天然解剖标志不清晰，则从断裂帧将断裂位置映射至参考图像可能具有挑战性。此外，若组织的天然解剖标志不够清晰，平铺扫描图像叠加图与高速相机图像之间的共定位可能较为困难。

组织处理工作流程图：μCT、SHG成像、单轴拉伸测试、数据分析。
图1：本实验方案的工作流程图。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于结构分析的SHG成像示意图，显示针区、平铺扫描及显微镜。
图2：从平铺扫描中选择用于SHG成像的图像区域。 （A）固定在硅胶中的测试样品。（B）通过明场显微镜获得的测试样品平铺扫描图像。用于SHG成像的选定区域以蓝色方框标出。（C）多光子显微镜（MPM）中SHG信号的最大强度投影。比例尺 = 140 µm（C）。缩写：SHG = 二次谐波产生；MPM = 多光子显微术。请点击此处查看该图的放大版本。

用于光学激发研究的显微成像装置，包含培养皿和激光器；实验室研究。
图 3：动脉粥样硬化斑块样本置于多光子显微镜物镜下。 斑块样本的位置由盛有磷酸盐缓冲液的培养皿固定。请点击此处查看该图的放大版本。

使用测力传感器、PVC夹具和LED照明进行样品测试的静力学平衡实验装置。
图4：定制的单轴拉伸测试仪，标示出其各个组成部分。（A）系统的整体示意图。请注意，夹具中的砂纸垫片仅在底部夹具安装时可见。（B）拉伸测试仪夹具的放大图像，测试试样已准备就绪待测。缩写：PVC = 聚氯乙烯；LED = 发光二极管。请点击此处查看该图的高清版本。

最佳组织分割对比；包含三维可视化和实际标本的示意图。
图5：代表性样本的组织采集与样本制备结果。（A）从接受颈动脉内膜剥脱术的知情同意患者中获取的新鲜且完整的斑块样本。（B）来自µCT扫描的三维重建图像。钙化组织显示为浅蓝色，非钙化组织显示为红色。在两条蓝线之间的区域可获得不含钙化组织的最佳样本。（C）µCT扫描的三维重建图像，显示一个钙化组织过多的次优斑块。比例尺 = 3 mm。缩写：µCT = 微计算机断层扫描。请点击此处查看该图的高清版本。

胶原纤维取向分析：拼图扫描、最大强度投影图像、纤维检测、直方图、高斯拟合。
图 6：代表性样本的多光子显微镜-二次谐波生成（MPM-SHG）结果。（A）拼图扫描概览；成像所选区域以蓝色标示。（B）来自不同拼图区域的最大强度投影（MIP）图像。（C）使用纤维取向分析（FOA）工具对选定区域（#1）进行的纤维检测。（D）来自选定区域的纤维取向直方图。（E）纤维取向直方图及其高斯拟合，由此可从选定区域提取胶原结构参数。（F）在整个斑块样本上显示的µp（取向黑线）和σp（背景颜色）分布。（G）在整个斑块样本上显示的µp（取向黑线）和Pani（背景颜色）分布。比例尺 = 140 µm（B,C）。缩略语：MPM-SHG = 多光子显微镜-二次谐波生成；MIPs = 最大强度投影；FOA = 纤维取向分析；µp = 主导纤维角度；Pani = 各向异性组分；σp = 纤维角度分布的标准差；Piso = 各向同性组分。请点击此处查看该图的高清版本。

组织破裂过程、显微镜图像；阶段：完整、起始、扩展、完全破裂。
图 7：拉伸试验过程中斑块组织样本的破裂起始与扩展。1）预拉伸状态，组织完整。2）破裂起始——首次观察到破裂的帧图像，破裂起始位置用红色方框标记。3）和4）破裂扩展过程。5）斑块样本的完全破裂。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

材料中的纵向、剪切、拉伸应变图；颜色编码的变形分析结果。
图 8：通过数字图像相关（DIC）分析获得的代表性样本在破裂前帧的格林-拉格朗日应变分布（εxx、εxy 和 εyy）。整个斑块的平均值和标准差，以及破裂位置处的应变值均予以提供。缩写：DIC = 数字图像相关；εxx = 纵向应变；εxy = 剪切应变；εyy = 拉伸应变。 请点击此处查看该图的放大版本。

胶原蛋白断裂分析，显微图像；结构参数示意图；拼图扫描方法。
图9在图像上叠加破裂位置（红色方框）的示意图。 (A高速摄像图像，其中已识别出破裂位置（破裂帧）。B高速摄像图像，仅施加预拉伸（参考帧）。C) 获得的拼图扫描图像 通过 显微镜技术。D) 一幅彩色编码图，显示不同区域的局部胶原结构参数。 µp （方向黑线）和 Pani （背景颜色）在整个斑块样本中的分布情况如图所示。缩写： µp = 主导纤维角度；Pani 各向异性分数 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本研究致力于开发一种力学成像分析流程，用于研究纤维状动脉粥样硬化斑块组织中局部胶原取向与分散性、局部力学特性以及破裂行为之间的相关性。本文所述方案在多个方面具有创新性。首先，这是首次将数字图像相关技术应用于测量机械载荷下纤维斑块组织的局部形变。其次，该方案提供了必要的信息，可用于分析纤维斑块组织的局部形变模式与其局部胶原结构之间的关联。结果部分展示的应变数据和胶原数据均突显了组织的异质性，从而强调了进行局部评估的重要性。因此，建议在今后对纤维斑块特性的研究中采用此类能够实现局部评估的技术，例如本方案中所使用的技术。

测试样品的制备是本实验方案中的关键步骤之一。颈动脉斑块主要由胶原组织构成，但可能含有钙化成分，而钙化被认为会影响斑块整体的力学行为36,37。由于本研究聚焦于斑块的纤维组织成分，因此通过使用µCT成像技术避开钙化区域，以避免其对测试样品的影响38。如果无法获得µCT设备，也可考虑采用其他成像技术（如MRI或OCT39）来识别斑块中的钙化区域。对于严重钙化或钙化呈弥散分布的斑块，获取不含钙化且尺寸足够大、可用于力学测试的纤维组织样品可能具有挑战性。本方案中的另一项难点是为数字图像相关法（DIC）生成理想的散斑图案。理想的DIC分析要求黑白比例为50:5028，且散斑尺寸为三到五个像素29，以确保足够的分析质量。若未能满足这些条件，可能导致局部应变测量结果不准确。最后，若组织的天然解剖标志不清晰，则将破裂位置准确映射到二次谐波成像（SHG）图像上也可能存在困难。对于此类样品，在成像前于组织上施加多个基准标记将有助于定位。

本方案中采用的多光子显微-二次谐波成像（MPM-SHG）技术优于许多其他胶原成像技术，因其具有高分辨率、非破坏性，并且穿透深度相对较大。然而，MPM-SHG的穿透深度（<400 µm）仍存在局限性，无法对厚度在0.5至2 mm之间的测试样本进行全层成像。在最近一项基于扩散张量磁共振成像（DT-MRI）的研究中，我们已证实斑块组织深层区域的主要纤维取向可能与较表层、管腔侧区域的纤维取向不同14。因此，有必要进一步研究厚纤维斑块组织深层区域的局部胶原结构及其与局部组织力学特性的关系。为此，可采用偏振空间频率域成像（pSFDI）技术。这一新近发展的光学成像技术已被报道可在二尖瓣瓣叶中测量深达0.8 mm的纤维取向12。此外，pSFDI具有快速成像的优势，有望实现对整个样本区域的可视化，而不仅限于当前方案中所选取的部分图像区域。当前方案的另一局限性在于仅能识别表面变形。在今后的研究中，可将镜面辅助多视角数字图像相关法（mirror-assisted multi-view DIC）40或数字体相关法（DVC）41纳入本方案，以获取有关三维体积内亚表面应变的额外信息。

当前实验方案可通过多种方式进一步拓展或修改，以获取有关斑块破裂力学特性及其与底层微结构关系的更多信息。首先，本方案包含周向的单轴拉伸试验。选择此类力学测试的原因在于，斑块在周向主要承受拉伸应变 体内对于更全面的力学表征，本方案可进一步扩展，以纳入膨胀测试、双轴拉伸测试或纵向单轴拉伸测试。其次，当前方案仅聚焦于通过数字图像相关法（DIC）获取局部应变。然而，若在方案中同时引入局部应力分析，可更完整地揭示斑块的力学行为，但这需要对局部刚度进行表征。尽管目前仍具挑战性，该目标可通过计算技术实现，例如逆向有限元法。42,43 以及虚拟场方法44除了实验调整外，当前方案还可增加一些额外的后处理步骤。首先，不仅可以确定破裂位置，还可以识别裂纹扩展路径。 通过 所获得的高速相机图像。该传播路径可与局部的结构和力学参数相关联。其次，在所述方案中通过视觉识别裂纹起始位置。先前一项关于非生物组织的研究利用数字图像相关（DIC）应变测量中的不连续性来检测断裂45对斑块组织应用此类自动破裂检测技术有望提高破裂检测的准确性。最后，与其他胶原成像技术相比，MPM-SHG 的一个显著优势在于其能够对单个胶原纤维进行可视化。因此，所获得的数据 通过 该方案还可用于研究其他局部胶原蛋白特征，例如胶原蛋白含量。

该方案可用于更深入地理解纤维斑块组织的局部特性，纤维斑块是斑块破裂中发生机械性失效的组分 体内这些信息对于建立能够预测患者斑块破裂的新型结构与功能成像标志物至关重要。由于既往提出的危险生物标志物已被证明对预测未来临床事件的效能欠佳，因此亟需这类新的标志物。5,6未来，OCT 和偏振敏感 OCT 有可能识别并量化动脉系统中的纤维组织46,47,48此外，应变被视作局部斑块成分的替代标志物49因此， 体内 应变测量49 可能有助于识别患者的斑块稳定性。然而，在将获得的结果直接转化应用于临床时应谨慎对待 体内 斑块破裂。首先，纤维斑块组织承受更复杂的载荷 体内 比本方案中使用的单向拉伸载荷更为复杂。其次，动脉粥样硬化斑块是多组分结构； 体内 纤维斑块组织中的应力和应变分布可能受到其他斑块成分（如钙化灶）的存在及其位置的影响37.

该力学成像流程也可用于研究其他胶原组织。目前，整体力学测试与胶原结构成像已广泛应用于生物组织研究。然而，对纤维异质组织在断裂前及断裂时的局部力学性能以及胶原结构的评估，对于准确表征其力学特性至关重要。我们预期，本新方案的结构设计将有助于进一步揭示多种生物组织中微结构与力学性能之间的相互关系。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由荷兰科学研究组织（NWO）Vidi 项目基金（18360）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mm 延长环Thorlabs Inc.CML10
15 mL 离心管VWR525-0150
20倍 APO 水浸物镜Leica507701
3D Slicer 软件N/A版本 4.11
50 mL 离心管VWR525-0156
喷笔枪 AB 430 - 喷嘴直径 0.3 mmConrad4.01614E+12
遮光尼龙织物，带聚氨酯涂层Thorlabs
黑色组织染料Polysciences inc24113-2
相机镜头，焦距 50 mmThorlabs Inc.MVL50M1
相机支架VWR241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra 多光子激光器Coherent
空气压缩机 + 气管JUN-AIR, ConradB07GB9HC62, 4016138577198
ExcelMicrosoft版本 2208
双面泡沫胶带，1.9 x 150 cmPattex
加热浴N/A定制
高速相机 + 成像软件Pixelink-Navitar Inc.PL-D725
人颈动脉粥样硬化斑块（来自颈动脉内膜切除术）N/A
Image J美国国立卫生研究院N/A
LAS-AFLeica版本 2.3多光子显微镜成像软件
LEICA TCS SP5 IILeica用于 SHG 成像的显微镜
照明系统AMZ instrumentsLED-60TB用于高速相机获取清晰图像
MATLABMathWorks版本 R2021A
基于 MATLAB 的 FibLab 软件埃因霍温理工大学N/A
基于 MATLAB 的 FOA（纤维取向分析）工具埃因霍温理工大学N/A
基于 MATLAB 的 Ncorr 软件佐治亚理工学院版本 1.2
针头EmeraldBDAM302986
培养皿（直径 10 cm）VWRBRND452000
Parafilm 封口膜VWR291-1214
巴斯德移液管VWRELKA127-P511-000
Quantum GX2 微型计算机断层扫描（μCT）扫描仪 + 0.06 mm Cu 和 0.5 mm Al X 射线滤光片PerkinElmerCLS149276
直尺精细科学工具公司1800030
砂纸（P180）Conrad4.00932E+12
斜口钳Conrad4.25084E+12
硅弹性体基料和固化剂（Sylgard 184）VWR634165S
拉伸试验机 + 软件 + 夹具N/A自制，使用圆柱形直线执行器（EACM2E10AZAK，Oriental Motor Ltd.）和 10 N 负载传感器（LCMFD-10N，Omega Engineering Inc.）
扭矩螺丝刀Garant, Hoffman group659906

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研究局部胶原结构与动脉粥样硬化斑块纤维组织力学特性相关性的方法
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