基于适配体的靶标检测通过 3 级 G-四链体等温指数扩增反应进行

摘要

本协议演示了使用快速，3阶段，基于适体的指数扩增测定来检测目标。涵盖样品制备、信号放大和显色，以实现该系统，以识别茶碱的存在而不是咖啡因的存在。

摘要

核酸适配体是以高亲和力和特异性结合的靶标识别分子。可以利用这些特性来控制具有信号产生能力的其他分子。对于本文描述的系统，通过适体结构域（改良的锤头核酶的Stem II）进行目标识别，通过稳定初始非结构化结构体来激活自裂解核酶。顺式切割RNA作用于茎III和茎I的连接处，产生两种切割产物。较长的裂解产物引发两种相似催化活性G-四链体的等温指数扩增反应（EXPAR）。这些产生的扩增产物催化过氧化物酶还原，这与具有肉眼可以检测到的输出的比色底物的还原相结合。本研究中描述的三部分系统通过产生视觉可检测的信号来改进检测方式，例如酶联免疫吸附测定（ELISA），以在短短15分钟内指示低至0.5μM茶碱的存在。

引言

核酸适配体通常是通过进化过程选择的单链DNA或RNA，与^所需靶标具有高结合亲和力和特异性1。除了结合能力外，核酸适配体还可以与具有信号输出功能²，³的基序连接和控制基序^，从而放大所述信号并提高系统的灵敏度。G-四链体等温指数扩增反应（GQ-EXPAR）系统是一个由三部分组成的系统（图1），当连续组分被添加到单个反应容器中以产生^{视觉输出时}，该系统会产生视觉信号4。该系统允许使用简化的工作流程在15分钟内检测给定样品中的特定靶标，本文中的茶碱，以允许快速，特异性地检测感兴趣的靶标。对于目标浓度的特异性定量比短时间内响应的高特异性更不关心的样品，必须考虑使用此方法。

变构核糖开关是一种经历自我切割的结构转换RNA分子（核酶），产生初始信号。该结构基于锤头核酶，在Stem II中引入了适体结构域作为裂解活性的调节剂。当其适体结构域稳定与其靶标⁵结合时，其自切割功能被激活。否则，交换机在其本机状态下处于非活动状态。

随后的指数扩增反应（EXPAR）使用自裂解RNA链从第一阶段释放到启动等温扩增反应⁶。EXPAR的扩增产物具有过氧化物酶活性⁷，作为系统最后阶段的基础。当某些基材与过氧化物击穿一起被氧化时，它们会产生荧光输出，可以在各种仪器上测量。可以替代其他常见的基材来生产用于视觉检测的有色产品。EXPAR及其扩增产物的过氧化物酶活性充当2级信号增强剂，^{与传统策略相比}，将灵敏度提高到更高的水平7^，8。

茶碱与咖啡因的检测被用作该检测平台特异性的一个例子，因为它们仅相差一个甲基（图2）。该系统的演示产生比色输出，用于至少500 nM茶碱的视觉检测。

方案

管制备见 补充表1 （反应设置表），包括反应组分的特定体积和浓度。此处演示的协议使用材料 表中描述的预组装检测平台套件。除非另有说明，否则所有组件必须保存在冰上。

1.核酶的制备

注意:主要检测成分是识别茶碱的变构（适体调节）核酶（见 补充表2）。

1. 在PCR管中收集5U的T4多核苷酸激酶（0.5μL，参见 材料表），该管将用于激活核酶切割产物。
   注意:首先添加此组分，以便用户可以看到酶的正确分配。
2. 向每个样品管（PCR管）中加入1 μL预先制备的5x核酶缓冲液（参见 材料表）。
3. 为了直观地展示特异性，向每个样品管中加入 1.5 μL 2 mM 茶碱（目标）或 2 mM 咖啡因（对照）（参见 材料表）作为测试样品。
   注意:为了建立标准曲线，建议从3.125 mM分析物开始，并测试五倍稀释度，直到0.001 mM。
4. 通过移液5-10次彻底混合每个样品管。
5. 向每个样品管中加入 2 μL 含有靶标特异性适体结构域的 600 nM RNA（参见 材料表），使 5 μL 测试溶液中的最终浓度为 240 nM，然后通过移液快速混合并置于冷块上以最小化背景信号。
   注意:重要的是最初准备不含核酶的所有反应，因为当核酶与核酶缓冲液结合时，自裂解反应将立即开始，并可能产生显着的背景。
6. 制备完所有反应管后，使用计时器在室温（23°C）下将每个样品（5μL）孵育3分钟。孵育后立即将样品管放回冰（4°C）中。

2. GQ-EXPAR

1. 向每个样品管中加入 3.5 μL 切口酶-聚合酶混合物（参见 材料表）并充分混合。
   注意:所需的酶浓度取决于识别序列、酶类型和反应温度，其组合是根据经验确定的。
2. 向每个样品管和移液管中加入 31.5 μL 含有模板、核苷酸和反应缓冲液（参见 材料表）的 EXPAR 反应混合物进行混合。
   注意:组分浓度根据聚合酶产物的酶和序列进行优化。
3. 制备完所有样品后，使用计时器将每个制备的样品（40μL）在55°C下孵育5分钟。如果可能，在热循环仪上孵育，尽管不需要加热盖子。
4. 孵育步骤后立即将样品管放回冰（4°C）中。

3. 显色

1. 向每个样品管中加入 2 μL 血红素溶液（25 uM，参见 材料表）并充分混合。
2. 向每个样品管中加入 58 μL 市售 TMB 溶液（参见 材料表）并充分混合。
3. 在室温下孵育显色反应（100μL）至少3分钟至30分钟。
   注意:（可选）可以通过添加 20 μL 2 M 硫酸来停止显色。
4. 用肉眼定性读取样品，如果使用硫酸停止显色反应，则使用450nm处的吸光度板读数器定量结果。

结果

图1所示的检测平台可在短时间内将适体靶标识别转换为样品制备（靶标与非靶标，图2）之间的视觉差异。Soukup等人5鉴定的变构核酶作为创建噪声较小的序列的起点，该序列在对照和阴性样品上响应目标。优化后的构建体能够在30分钟内识别低至500 nM茶碱（图3）-暴露于靶标的样品制备物在步骤3中产生蓝色，而不含靶标的样品保持无色。如有必要，可以通过首先停止步骤3.4中所述的显色反应，然后在450nm处读取所得产物的吸光度以测量存在的靶标的初始浓度来量化这些结果。该过程的典型结果如表1所示，可以拟合到非线性回归中，以定量估计初始样品中存在的靶标浓度（图4）。

讨论

这里介绍的方法利用了变构核酶中最初无序的二级结构与通过靶标与适体结构域结合以激活顺式裂解锤头核酶而赋予的额外稳定性之间的过渡。调整核酶的稳定性，以在无靶标的情况下最小化催化活性，同时允许靶标结合恢复活性结构。此外，必须注意平衡促进EXPAR和显色所需的多种酶的缓冲液。最后，考虑到这是一个三级系统，孵育时间和温度以及反应组分浓度的组合意味着在最大化信号的同时最小化噪声是一项不小的挑战。

在核酶的制备过程中（步骤1），与适体结构域的靶标结合稳定了自裂解核酶的结构。尽管如此，即使没有靶标，核酶一旦引入核酶缓冲液，也能够裂解。因此，为了尽量减少背景信号，至关重要的是将反应保持在冰上，直到它们准备好进行规定的孵育。靶标与适体结构域的成功结合以及由此产生的裂解事件产生两种裂解产物，如图1，阶段 1所示:一小段茎I和新暴露的茎III段，末端环磷酸盐⁸。样品混合物中存在的 T4 多核苷酸激酶从 Stem III 裂解产物中去除环磷酸盐，该产物可作为第 2 阶段扩增反应的引物。该系统中使用的试...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,3'，5,5'-四甲基联苯胺二盐酸盐 （TMB） 溶液，含 H2O2，"MaxSignal TMB 微孔底物溶液"	珀金埃尔默	FOOD-1806-1000	显色试剂。尽量减少暴露在光线和大气中。以前，BIOO Scientific，目录号：1806. 以 Apta-beacon 演示套件形式提供，作为管 3-2。
5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-生物素-3'	Integrated DNA Technologies （IDT）	的定制	优化 QtQ47 DNA 模板，用于生成由 G-四链体引发的 G 四链体。这用于 EXPAR 的"指数"部分，以快速增加用于第 3 步显色的 DNA 酶的量。模板包括一个 3'-生物素，以防止在 EXPAR. 部分 Apta-beacon 演示试剂盒管 2-2 期间被 Bst 2.0 DNA 聚合酶意外延伸。
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'	整合 DNA 技术 （IDT）	定制	茶碱识别变构核酶序列（由茶碱的 RNA 适体结构域调节的自裂解核酶）修改自 Soukup 等人 Soukup， GA、Emilsson， GA 和 Breaker， RR （2000） 通过变构选择改变 RNA 适体的分子识别，分子生物学杂志 298， 623-632. 以 Apta-beacon 演示试剂盒形式作为试管 1-3 提供。
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-生物素-3'	Integrated DNA Technologies （IDT）	的定制	优化 P3tQ49 DNA 模板，用于产生由 P3 切割产物引发的 G-四链体。在步骤 2 中用于将切割产物翻译成用于步骤 3 显色的 DNAzyme。模板包括一个 3'-生物素，以防止在 EXPAR. 部分 Apta-beacon 演示试剂盒管 2-2 期间被 Bst 2.0 DNA 聚合酶意外延伸。
5x 核酶缓冲液	Aptagen， LLC	N/A	5x 组成：600 mM Tris-HCl （pH 7.5），150 mM MgCl2，25 mM DTT。在步骤 1. 中使用，在 Apta-beacon 演示试剂盒中作为试管 1-4 提供。
Apta-beaconTM （GQ-EXPAR， TMB） 演示试剂盒	Aptagen， LLC	GQ-EXPAR-TMB	该演示试剂盒通过检测困难的小分子靶标茶碱与咖啡因来展示比色测定的特异性，它们仅差一个甲基。
Bst 2.0 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0537S	具有链置换活性的等温扩增聚合酶。切口酶-聚合酶混合物的一部分，在 9.375 U/uL. 制备 Apta-beacon 演示试剂盒管 2-1 的一部分。
缓冲液 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	与 2 μL 10X 等温扩增缓冲液和 27.5 μL 无核酸酶水混合，在 EXPAR 混合物中产生 1.11X EXPAR 缓冲液。该产品取代了以前使用的B7203SVIAL，该 是初始系统开发的一部分（除非重组 BSA 外，成分相同）. Apta-beacon 演示套件 Tube 2-2 的一部分。
咖啡因	Sigma-Aldrich	C0750-100G	适配子反靶标（对照），用无核酸酶水制备. 以 Apta-beacon 演示试剂盒形式提供，作为试管 1-1。
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	EXPAR 反应混合物的一部分. Apta-beacon 演示套件管 2-2 的一部分。
EXPAR 反应混合物	Aptagen， LLC	N/A	0.44 mM dNTPs， 0.38 μM P3tQ49， 0.38 μM QtQ47、44.44 mM Tris-HCl （pH 8.4）、63.5 mM NaCl、31.5 mM KCl、6.35 mM MgCl2、1.27 mM MgSO4、6.35 mM （NH4）2SO4、63.5 &μ;g/ml BSA，0.0635 % 吐温 20. Apta-beacon 演示试剂盒试管 2-2 的一部分。
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	在 DMF 中重悬至终浓度为 25 uM. 以 Apta-beacon 演示试剂盒形式提供，作为管 3-1。
等温扩增缓冲液	New England Biolabs	B0537SVIAL	与 2 μL 10x 缓冲液 3.1 和 27.5 µ 结合使用;L 不含核酸酶的水，在 EXPAR 混合物中产生 1.11x EXPAR 缓冲液。 Apta-beacon 演示试剂盒试管 2-2 的一部分。
MgCl2	Amresco （VWR）	E525-500ML	锤头核酶辅因子，自切割所必需的. Apta-beacon 演示套件管 1-3 的一部分。
MJ PTC-100 热循环仪	MJ Research， Inc.	PTC-100	热循环仪，用于控制孵育温度。可以使用任何热循环仪或热块。
N， N-二甲基甲酰胺 （DMF）	Sigma-Aldrich	227056-100ML	用于重悬血红素并最大限度地延长冰箱中的保质期。 Apta-beacon 演示套件试管 3-1 的一部分。
切口酶-聚合酶混合物	Aptagen， LLC	N/A	Nt.BstNBI（9.375 单位/μL） 和 Bst 2.0 DNA 聚合酶 （0.5 unit/μL）. 以 2-1 管的形式在 Apta-beacon 演示套件中提供。
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	切口酶允许连续等温扩增。切口酶-聚合酶混合物的一部分，以 0.5 U/uL. 制备 Apta-beacon 演示试剂盒管 2-1 的一部分。
T4 激酶缓冲液	New England Biolabs	B0201SVIAL	去除环磷酸盐所需的酶缓冲液. Apta-beacon 演示试剂盒试管 1-4 的一部分。
T4 多核苷酸激酶	New England Biolabs	M0201S	去除切割后的环磷酸盐，使切割产物引发等温扩增反应。 以 Apta-beacon 演示试剂盒的形式作为 PCR 管提供。
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	读板机，用于测量第 3 步结果中的吸光度信号。
茶碱	Sigma-Aldrich	T1633-50G	适配子靶标，用无核酸酶水制备. 以 Apta-beacon 演示试剂盒形式作为试管 1-2 提供。
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	适配子结合缓冲液. Apta-beacon 演示试剂盒试管 1-4 的一部分。