基于适体的靶标检测结合三阶段G-四链体等温指数扩增反应

摘要

本方案展示了使用一种快速、三步式、基于适配体的指数扩增检测方法来检测目标物。涵盖了样本制备、信号扩增和显色发育步骤，以实现对该体系的应用，特异性识别茶碱而非咖啡因的存在。

摘要

适配体是一类具有高亲和力和特异性的靶标识别分子。这些特性可用于调控其他具有信号生成功能的分子。在本研究描述的系统中，通过修饰型锤头核酶的茎环II结构域（适配体结构域）实现靶标识别，该识别过程通过稳定初始无规卷曲的结构，激活自切割核酶。这种顺式切割RNA作用于茎环III与茎环I的连接处，产生两个切割产物。其中较长的切割产物启动等温指数扩增反应（EXPAR），扩增两种结构相似且具有催化活性的G-四链体。这些扩增产物可催化过氧化物酶的还原反应，进而驱动显色底物的还原，产生肉眼可见的信号输出。本研究所描述的三组分系统通过在低至15分钟内检测低至0.5 µM茶碱的能力，显著改进了酶联免疫吸附测定（ELISAs）等检测方法，实现可视化的信号指示。

引言

适配体通常是通过进化过程筛选出的单链DNA或RNA，对特定靶标具有高亲和力和特异性结合能力¹。除了结合能力外，适配体还可连接并调控具有信号输出功能的基序^2,3，从而放大信号并提高系统的灵敏度。G-四链体等温指数扩增反应（GQ-EXPAR）系统是一个由三个部分组成的体系（图1），随着各组分依次加入单一反应容器中，逐步产生可视化的信号输出⁴。该系统可在15分钟内实现对样本中特定靶标（本实验中为茶碱）的检测，操作流程简便，适用于快速、特异性地检测目标物质。该方法适用于对目标物浓度的精确定量要求不高，而更关注短时间内响应特异性的样本检测场景。

一种变构核糖开关，即一种能够发生自切割的结构转换RNA分子（核酶），可产生初始信号。该结构基于锤头状核酶，并在茎环II中引入一个适配体结构域，以调控其切割活性。当该适配体结构域与靶标结合并稳定后，其自切割功能即被激活⁵。否则，该开关在其天然状态下保持非活性。

随后的指数扩增反应（EXPAR）利用第一阶段自切割释放的RNA链作为引物，启动等温扩增反应⁶。EXPAR的扩增产物具有过氧化物酶活性⁷，构成系统最后阶段的基础。当某些底物在过氧化氢分解的同时被氧化时，会产生可被多种仪器检测的荧光信号。也可替换为其他常见底物，生成有色产物以实现肉眼观察。EXPAR及其扩增产物的过氧化物酶活性共同构成两步信号增强系统，与传统方法相比，显著提高了检测灵敏度^7,8。

以茶碱与咖啡因的检测为例，说明该检测平台的特异性，因为两者仅相差一个甲基（图2）。该系统可产生比色输出，实现对至少500 nM茶碱的可视化检测。

方案

有关试管准备，包括反应组分的具体体积和浓度，请参见补充表1（反应体系配置表）。本方案中使用的检测平台试剂盒为预组装形式，具体如材料表所述。除非另有说明，所有组分均需置于冰上保存。

1. 核酶的制备

注意：主要检测组分是一种变构（适配体调控的）核酶，可识别茶碱（参见补充表2）。

1. 在PCR管中收集5 U的T4多核苷酸激酶（0.5 µL，参见材料表），用于激活核酶切割产物。
   注意：先加入该组分，以便用户观察酶的正确添加。
2. 向每个样品管（PCR管）中加入1 µL预配制的5倍浓度核酶缓冲液（参见材料表）。
3. 为直观展示特异性，向每个样品管中分别加入1.5 µL的2 mM茶碱（目标物）或2 mM咖啡因（对照）（参见材料表）作为测试样品。
   注意：为建立标准曲线，建议从3.125 mM分析物开始，进行五倍梯度稀释，直至0.001 mM。
4. 通过移液器吹打5–10次，充分混匀每个样品管。
5. 向每个样品管中加入2 µL浓度为600 nM、含有针对目标物特异性适配体结构域的RNA（参见材料表），使测试溶液总体积为5 µL时终浓度达到240 nM；加样后迅速吹打混匀，并立即置于冰上以减少背景信号。
   ​注意：初始反应体系应全部在不含核酶的情况下配制，因为一旦核酶与核酶缓冲液混合，自切割反应将立即启动，可能导致显著的背景信号。
6. 所有反应管配制完成后，使用计时器将每个样品（5 µL）在室温（23 °C）下准确孵育3分钟。孵育结束后立即将样品管放回冰上（4 °C）。

2. GQ-EXPAR

1. 向每个样品管中加入 3.5 µL 切刻酶-聚合酶混合液（见材料表），并充分混匀。
   注意：所需酶浓度取决于识别序列、酶的类型和反应温度，其组合条件已通过实验确定。
2. 向每个样品管中加入 31.5 µL 含模板、核苷酸和反应缓冲液的 EXPAR 反应混合液（见材料表），用移液器吹打混匀。
   注意：各组分浓度已根据聚合酶的种类及其产物序列进行优化。
3. 所有样品制备完成后，将每个制备好的样品（40 µL）使用计时器精确在 55 °C 下孵育 5 分钟。如有可能，使用热循环仪进行孵育，但无需加热盖。
4. 孵育步骤结束后，立即将样品管放回冰上（4 °C）。

3. 显色反应

1. 向每个样品管中加入 2 µL 血红素溶液（25 µM，参见材料表），并充分混匀。
2. 向每个样品管中加入 58 µL 商业化的 TMB 溶液（参见材料表），并充分混匀。
3. 将显色反应液（100 µL）在室温下孵育至少 3 分钟，最长不超过 30 分钟。
   注意：（可选）可通过加入 20 µL 的 2 M 硫酸终止显色反应。
4. 可通过肉眼对样品进行定性观察，或在使用硫酸终止显色反应后，使用 450 nm 波长的吸光度酶标仪对结果进行定量分析。

结果

如图1所示的检测平台可在短时间内将适体对目标物的识别转化为样本制备过程中明显可辨的视觉差异（目标物与非目标物，图2）。研究以Soukup等人⁵鉴定出的一种变构核酶为起点，构建出一种响应目标物、且相对于对照组和阴性样本背景信号更低的优化序列。该优化后的构建体可在30分钟内检测低至500 nM的茶碱（图3）——在第3步中，暴露于目标物的样本呈现蓝色，而无目标物的样本则保持无色。如有需要，可通过第3.4步所述方法终止显色反应，随后在450 nm处测定产物的吸光度，以评估初始样本中目标物的浓度。该过程的典型结果如表1所示，可通过非线性回归拟合，定量估算初始样本中目标物的浓度（图4）。

讨论

本文所述方法利用了变构核酶初始无序的二级结构在靶标与适体结构域结合后获得额外稳定性，从而激活顺式切割的锤头状核酶这一转变过程。通过调节核酶的稳定性，使其在无靶标存在时催化活性降至最低，而靶标结合后则可恢复其活性结构。此外，必须谨慎平衡为促进EXPAR反应和显色过程所需的多种酶的缓冲体系。最后，由于该系统包含三个阶段，孵育时间与温度的组合以及反应组分的浓度设置，使得在最大化信号的同时最小化背景噪声成为一项不小的挑战。

在核酶的制备过程中（步骤1），靶标与适体结构域的结合可稳定自切割核酶的结构。尽管如此，一旦将核酶加入核酶缓冲液中，即使没有靶标存在，其仍具有切割能力。因此，为了尽量减少背景信号，必须将反应体系保持在冰上，直至进入预设的孵育阶段。靶标成功结合至适体结构域并引发切割反应后，会产生两个切割产物，如图1阶段1所示：一段较短的茎环I片段，以及一段新暴露的带有末端环状磷酸基团的茎环III片段⁸。样本混合液中存在的T4多核苷酸激酶会去除茎环III切割产物上的环状磷酸基团，该产物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,3',5,5'-四甲基联苯胺二盐酸盐（TMB）溶液含 H2O2，"MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	显色试剂。应尽量减少暴露于光和空气。此前为BIOO Scientific目录号1806。 作为Apta-beacon演示试剂盒中的3-2管提供。
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-生物素-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	定制	用于EXPAR的优化QtQ47 DNA模板，以G-四链体为引物。该模板用于EXPAR的"指数扩增"部分，以快速增加用于第三步显色反应的DNA酶量。模板包含3'-生物素，以防止在EXPAR过程中被Bst 2.0 DNA聚合酶非特异性延伸。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-2管。
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	定制	识别茶碱的变构核酶序列（由茶碱RNA适配体结构域调控的自切割核酶），改编自Soukup等人。 Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) 通过变构选择改变RNA适配体的分子识别，Journal of molecular biology 298, 623-632。 作为Apta-beacon演示试剂盒1-3管提供。
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-生物素-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	定制	用于EXPAR的优化P3tQ49 DNA模板，以P3切割产物为引物，生成G-四链体。该模板在第二步中用于将切割产物转化为用于第三步显色反应的DNA酶。模板包含3'-生物素，以防止在EXPAR过程中被Bst 2.0 DNA聚合酶非特异性延伸。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-2管。
5x 核酶缓冲液	Aptagen, LLC	N/A	5x组分：600 mM Tris-HCl (pH 7.5)，150 mM MgCl2，25 mM DTT。用于第一步。 作为Apta-beacon演示试剂盒1-4管提供。
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) 演示试剂盒	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	该演示试剂盒通过检测结构仅差一个甲基的小分子目标物茶碱与咖啡因，展示比色法的特异性。
Bst 2.0 DNA聚合酶	New England Biolabs	M0537S	具有链置换活性的等温扩增聚合酶。属于Nickase-Polymerase Mix，配制浓度为9.375 U/μL。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-1管。
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	与2 μL 10X等温扩增缓冲液和27.5 μL无核酸酶水混合，制备成EXPAR反应混合液中的1.11X EXPAR缓冲液。该产品替代了早期系统开发中使用的B7203SVIAL（成分相同，但BSA为非重组型）。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-2管。
咖啡因	Sigma-Aldrich	C0750-100G	适配体的对照目标物（对照），用无核酸酶水配制。 作为Apta-beacon演示试剂盒1-1管提供。
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	EXPAR反应混合液的组成部分。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-2管。
EXPAR反应混合液	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs，0.38 μM P3tQ49，0.38 μM QtQ47，44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4)，63.5 mM NaCl，31.5 mM KCl，6.35 mM MgCl2，1.27 mM MgSO4，6.35 mM (NH4)2SO4，63.5 μg/ml BSA，0.0635 % Tween 20。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-2管。
血红素	Sigma-Aldrich	H9039	用DMF重悬至终浓度25 μM。 作为Apta-beacon演示试剂盒3-1管提供。
等温扩增缓冲液	New England Biolabs	B0537SVIAL	与2 μL 10x Buffer 3.1和27.5 µL无核酸酶水混合，制备成EXPAR反应混合液中的1.11x EXPAR缓冲液。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-2管。
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	锤头状核酶的辅因子，对自切割反应至关重要。 属于Apta-beacon演示试剂盒1-3管。
MJ PTC-100 热循环仪	MJ Research, Inc.	PTC-100	用于控制孵育温度的热循环仪。任何热循环仪或加热块均可使用。
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma-Aldrich	227056-100ML	用于重悬血红素并延长其在冷冻条件下的保存期限。 作为Apta-beacon演示试剂盒3-1管提供。
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 单位/μL) 和 Bst 2.0 DNA聚合酶 (0.5 单位/μL)。 作为Apta-beacon演示试剂盒2-1管提供。
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	切口酶，用于实现持续的等温扩增。属于Nickase-Polymerase Mix，配制浓度为0.5 U/μL。 属于Apta-beacon演示试剂盒2-1管。
T4激酶缓冲液	New England Biolabs	B0201SVIAL	去除环状磷酸基团所需酶的缓冲液。 属于Apta-beacon演示试剂盒1-4管。
T4多核苷酸激酶	New England Biolabs	M0201S	去除切割后产生的环状磷酸基团，使切割产物能够引发等温扩增反应。 作为Apta-beacon演示试剂盒PCR管提供。
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	用于测量第三步结果的吸光度信号的酶标仪。
茶碱	Sigma-Aldrich	T1633-50G	适配体的目标物，用无核酸酶水配制。 作为Apta-beacon演示试剂盒1-2管提供。
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	适配体结合缓冲液。 属于Apta-beacon演示试剂盒1-4管。