建立一种模拟烧伤后感染临床情况的模型，对于推进烧伤研究至关重要。本方案展示了一种简单且可重复的大鼠烧伤感染模型，其病理特征与人类烧伤相似，有助于开展烧伤及其继发感染的研究，从而推动新型局部抗生素治疗策略的开发。
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摘要
摘要
在大鼠模型中，烧伤诱导方法的描述往往不一致。为了开展可重复的烧伤研究，有必要建立一种能够代表临床实际情况的标准化烧伤创面模型。本方案描述了一种简单且可重复的方法，用于在大鼠身上制造约20%体表面积（TBSA）的全层皮肤烧伤。具体操作中，将一根直径为5.4 cm、面积为22.89 cm2的铜棒在水浴中加热至97 °C后，施加于大鼠皮肤表面以诱导烧伤损伤。由于铜棒具有高热导率，能够将热量更深入地传递至皮肤组织，从而形成全层烧伤。组织学分析显示，表皮显著变薄，并伴有真皮层及皮下组织全层的凝固性损伤。此外，该模型能够模拟住院烧伤患者在烧伤后所出现的临床状况，如免疫功能紊乱和细菌感染。该模型还可重现由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的全身性细菌感染。综上所述，本文介绍了一种易于掌握且稳定的烧伤大鼠模型，能够模拟包括免疫功能紊乱和细菌感染在内的多种临床情况，对于开发新型局部抗生素药物以治疗烧伤创面及其相关感染具有重要应用价值。
引言
烧伤是最严重的创伤形式之一 ，即使在专业的烧伤中心，其死亡率仍高达12%1,2,3。根据最近发布的报告，美国每年约有48.6万名烧伤患者需要接受医疗救治，其中近3,500人因此死亡1,2,3,4,5,6。烧伤对患者的免疫系统构成重大挑战，并造成明显的开放性伤口，愈合缓慢，使患者容易受到医院内机会性细菌的皮肤、肺部及全身性定植感染。免疫功能紊乱与细菌感染共同作用，导致烧伤患者的发病率和死亡率显著升高7。
动物烧伤和感染模型对于研究皮肤损伤及烧伤创伤相关免疫抑制后细菌感染的发病机制至关重要。此类模型有助于设计和评估治疗烧伤患者细菌感染的新方法。已有文献报道，大鼠与人类具有相似的皮肤生理和病理特征8。此外，大鼠体型较小，相较于大型动物模型更易于操作、成本更低，且更容易获取和维持饲养。
这些特性使大鼠成为研究烧伤和感染的理想模型动物9。然而，烧伤诱导技术目前缺乏一致性，且往往描述极为简略10,11,12,13,14。本实验方案旨在建立一种简单、经济、可重复的方法，用于在大鼠模型中制造稳定的一致性全层皮肤烧伤损伤，以模拟临床情况，并可用于评估免疫抑制和细菌感染。
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方案
所有实验程序均经北卡罗来纳大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并依照其既定指南进行。实验使用7至9周龄、体重250-300 g的雄性和雌性斯普拉格-道利大鼠。所有动物均饲养在12小时光照/12小时黑暗循环环境中，可自由获取食物和水ad libitum。在研究开始前，务必与机构兽医共同制定镇痛方案。
1. 烧伤损伤大鼠的制备
- 在烧伤前24小时准备动物以进行烧伤损伤。
- 在诱导室中使用100%氧气携带5%异氟烷对大鼠麻醉5分钟（流速：2 L/min），直至呼吸变慢。
- 当大鼠深度麻醉（四肢脚趾捏压无反应）后，将其移至加热垫上，呈俯卧位，并通过鼻罩将异氟烷浓度降低至1.5%以维持麻醉。
- 为防止麻醉后及操作过程中角膜干燥，使用棉签蘸取眼用润滑剂涂抹于双眼角膜表面。
- 使用电动剪刀（见材料表）剃除大鼠背部肩胛骨至尾根部大面积区域的毛发，尽可能去除所有毛发（图2A）。
- 用生理盐水浸湿的组织擦拭剃毛区域，清除松散毛发。使用棉签将脱毛膏均匀涂抹于剃毛区域，静置约3分钟。
注意：使用推荐脱毛膏时间超过3分钟将导致皮肤出现红斑。 - 用湿润纱布海绵擦拭该区域两次，以彻底清除残留脱毛膏，防止皮肤刺激。
- 关闭异氟烷，移除鼻罩，将大鼠放入恢复笼中。
注意：在恢复笼内放置加热垫。 - 将恢复后的大鼠转移至清洁的饲养笼中，等待次日进行烧伤操作（大鼠从麻醉中恢复通常需要约10–15分钟）。
2. 在大鼠中诱导烧伤损伤
- 在烧伤当天，将水浴温度设定为 97 °C，并将所有四根铜棒（每根 420 g）放入水浴中 图1在烧伤实验前1小时将杆件放入水浴中，使其均匀升温。
注意：玻璃棒必须浸入水中。实验前使用温度计检查数字温度显示的准确性。 - 按照第1节所述方法对大鼠进行麻醉。
- 当大鼠四肢对足趾夹捏刺激均无反应后，将其置于俯卧位的加热垫上，并以1.5%异氟烷与氧气混合气体维持麻醉状态（图2A).
- 注射吗啡（20 mg/kg 体重） 通过 用于疼痛管理的腹腔内（i.p.）给药途径6.
- 检查水浴中水的温度。设置计时器并戴上耐热手套。
- 从水浴中取出一根加热的铜棒，将其接触大鼠背部区域7秒以诱导烫伤。
注意：在水浴装置与动物之间保持最小距离（10–15 cm），以尽量减少热量散失；在造成烧伤时，切勿对金属棒施加压力（即 必须通过重力维持接触。 - 使用四根烧灼棒，每个烧灼部位使用一根，连续施加四次烧灼，每次紧接前一次，以产生约20%体表面积的全层接触性烧伤（图2B).
- 烧伤后，通过腹腔注射乳酸林格液对动物进行复苏（0.1 mL/g 体重）。
注意：使用调节至体温的乳酸林格氏液对大鼠进行复苏。 - 关闭异氟烷，取下鼻罩，将大鼠置于加热垫上恢复。
3. 细菌接种物的制备与感染
- 在烧伤实验前2天，将冻存的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923接种于Muller Hinton琼脂（MHA）平板上划线培养。
- 次日，从平板上挑选一个单菌落，用接种环轻轻刮取，然后将其转移至培养管中，接种于10 mL Muller Hinton肉汤（MHB）中，在37 °C摇床培养箱中过夜培养。
- 在烧伤和感染当天，将菌液在4,000 ×g条件下离心5分钟，用生理盐水（0.9% NaCl溶液）洗涤菌体沉淀。
- 将菌体沉淀重悬于生理盐水中，并调整至0.1 OD600nm（600 nm处的光密度值）。取200 µL该菌悬液与800 µL生理盐水混合，稀释后获得浓度为2 × 107 CFU/mL的菌液接种物。
- 在烧伤后15分钟，将上一步制备的50 µL铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）或金黄色葡萄球菌（S. aureus）接种物（感染剂量为1 × 106 CFU），使用29 G针头在麻醉大鼠皮下靠近烧伤创面的部位进行注射。
- 感染烧伤创面后，将大鼠置于加热垫上恢复。待动物苏醒后（约15–20分钟），将其安置于清洁的笼具中。
注意：烧伤后每笼饲养一只大鼠。提供湿润的软质饲料颗粒以便咀嚼，并将其放置于笼底便于取食。 - 在笼内水瓶中加入含吗啡的饮水（0.4 mg/mL），用于镇痛管理。
注意：口服吗啡可模拟临床烧伤患者的实际治疗情况。本研究在多次咨询兽医人员后，采用口服吗啡以使实验条件更接近人类烧伤患者的临床状况。实验期间持续记录饮水量和体重变化。所有操作过程中应使用相同的饮水系统。根据机构动物护理指南，也可皮下或腹腔注射其他镇痛药（如布托啡诺）。 - 填写动物监测检查表，并在整个实验期间密切观察动物是否出现痛苦或疾病症状。
4. 烧伤损伤的评估
- 烧伤后立即根据皮肤烧伤创面的颜色和边缘情况进行形态学评估。
- 使用苏木精和伊红（H&E）对烧伤皮肤进行染色，以观察烧伤创面结构和上皮缺损15（样本处理参见步骤5.6）。
5. 大鼠样本的后期处理与细菌计数
- 在烧伤后24、48和72小时，通过过量麻醉处死大鼠。
- 从大鼠中采集血样 通过 心脏穿刺并收集至微型收集管中。
- 分析血样中的全血细胞计数，以确定烧伤诱导对宿主免疫系统的影响。
- 安乐死后立即采集皮肤、皮下组织、肌肉、肺和脾脏。
注意：保留一部分皮肤（约1 cm × 1 cm，重约200–300 mg）用于H&一部分用于#38;E染色，另一部分用于细菌计数。 - 将组织收集至10 mL收集管中，并置于冰上生理盐水中，用于细菌计数。
- 用生理盐水归一化组织重量，并使用组织匀浆器匀浆样品（参见 材料表).
- 用生理盐水对组织匀浆进行连续稀释。
- 将每份来自感染大鼠组织样本的未稀释匀浆液及其所有稀释液各取 100 µL，接种于西曲米特琼脂平板上 P. aeruginosa.
注意：使用甘露醇琼脂平板培养来自感染大鼠的样本 S. aureus. - 将培养皿置于37 °C培养箱中孵育16-18 h。
- 第二天，计数平板上的细菌菌落，乘以稀释倍数得到CFU/mL，再根据组织重量进行归一化，计算CFU/g组织。
- 使用数据分析软件绘制不同采样时间点各器官中的细菌数量。
- 执行 H&烧伤皮肤的#38;E染色以观察伤口结构和上皮缺损。
- 使用剪刀和有齿镊子，从烧伤区域剪取一块 1 cm × 1 cm 的皮肤组织，浸入固定液（10% 中性缓冲甲醛溶液，NBF）中，在室温下固定 48 小时。
注意：轻轻晃动容器，确保所有组织完全浸入固定液中，固定液体积应为组织体积的30倍。 - 用70%（v/v）乙醇在室温下对皮肤组织脱水72小时。
- 将脱水后的样本处理成石蜡包埋块，切片并进行H&E染色&E15.
- 使用切片扫描仪对染色后的切片进行数字成像（参见 材料表使用40倍物镜。
- 使用软件分析扫描图像（参见 补充文件 1 用于图像处理与分析；参见 材料表).
- 检查染色皮肤切片的所有视野，以评估表皮、真皮、皮下组织和骨骼肌的状况。
- 使用剪刀和有齿镊子，从烧伤区域剪取一块 1 cm × 1 cm 的皮肤组织，浸入固定液（10% 中性缓冲甲醛溶液，NBF）中，在室温下固定 48 小时。
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结果
本方案具有高度可重复性，可在大鼠身上成功诱导出三度、全层皮肤烧伤损伤。烧伤后创面呈现蜡白色（图 2B）。烧伤后 72 小时内，烧伤区域的颜色由白色逐渐转变为褐色（图 2B-E）。
组织学分析证实为全层烧伤（烧伤后24小时深度>2.61 mm；图3B）。与未烧伤的完整皮肤相比，烧伤动物的皮肤样本在烧伤后24、48和72小时均显示各层组织受损（图3）。此外，组织学分析显示表皮层完全破坏，真皮层全层受损，并累及皮下脂肪和骨骼肌（图3B）。
为评估细菌清除情况，在感染后24、48和72小时采集不同组织 P. aeruginosa 和 S. a...
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讨论
已有多种烧伤模型被用于研究烧伤损伤的病理生理学过程8,12,16,17。在本研究中，我们采用大鼠模型建立了一种简单且可重复的实验方案，以诱导全层皮肤烧伤，随后进行细菌感染，从而模拟患者中感染性烧伤创伤的情况。选择大鼠作为模拟人类状况的动物模型，是基于成本、操作便利性、数据可重复性与可靠性之间的平衡。本研究所采用的大鼠模型相较于其他模型具有诸多优势：易于操作，且是目前最常用的烧伤模型，便于在不同文献之间进行比较。尽管大鼠在实验环境中被广泛使用，但大鼠与人类的皮肤结构在组织学上并不完全相同18,19。大鼠的皮肤系统由表皮、一层称为脂肪筋膜（panniculus adiposus）的脂肪层组成，其下方为一层疏松结缔组织鞘，该层与白色脂肪组织和平滑肌相连，构成被称为肌性筋膜（...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢北卡罗来纳大学比较医学部在实验动物提供与护理方面给予的支持。感谢病理学服务核心实验室的Lauren Ralph和Mia Evangelista在组织病理学/数字病理学方面提供的专业技术支持，包括组织切片与成像。本研究得到了美国国防部研究基金的资助（资助编号W81XWH-20-1-0500，GR和TV）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD, USA | 309597 | 用于注射镇痛药 |
| 1.7 mL 微量离心管 | Olympus, USA | 24-282 | 用于盛装吗啡 |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | 用于固定皮肤组织以进行染色 |
| 30 mL 注射器 | BD, USA | 302832 | 用于注射乳酸林格液 |
| 70% 乙醇 | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 数字病理 切片扫描仪（配备 ImageScope 软件） | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | 用于 H & E 切片的扫描与分析 |
| 西曲溴铵琼脂平板 | BD, USA | 285420 | 用于选择性培养Pseudomonas aeruginosa |
| 铜棒 | n/a | n/a | 用于诱导烧伤损伤 |
| 棉签 | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | 用于涂抹眼药膏 |
| 电动剃须刀 | Oster, USA | Golden A5 | 用于去除背部毛发 |
| 眼用润滑剂 | Dechra, UK | n/a | 眼部润湿剂，提供持久舒适感，防止眼睛干涩 |
| 填充绒毛的垫巾 | Medline, USA | MSC281225 | 用于烧伤操作过程 |
| 镊子 | F.S.T. | 11027-12 | 用于夹持皮肤组织 |
| 纱布海绵 | Oasis, USA | PK412 | 用于清除背部涂抹的脱毛膏 |
| 耐热手套 | n/a | n/a | 用于持握加热后的铜棒 |
| 血液学分析仪 | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| 麻醉诱导室 | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | 用于对动物进行麻醉 |
| 胰岛素注射器 | BD, USA | 329461 | |
| 异氟烷 | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | 用于麻醉大鼠，诱导意识丧失 |
| 异氟烷蒸发器 | n/a | n/a | |
| 乳酸林格液 | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | 用于复苏大鼠 |
| L 形涂布棒 | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| 甘露醇琼脂 | BD, USA | 211407 | 用于选择性培养Staphylococcus aureus |
| 微量采血管（K2EDTA） | greiner bio-one, USA | 450480 | 用于采集血液 |
| 吗啡 | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | 该镇痛药用于阻断烧伤疼痛感知 |
| 穆勒-欣顿肉汤 | BD, USA | 275730 | |
| 穆勒-欣顿 II 琼脂 | BD, USA | 211438 | |
| Nair 脱毛乳液 | Nair, USA | n/a | 用于去除背部残留毛发 |
| 23 G 针头 | BD, USA | 305193 | 用于注射乳酸林格液 |
| 生理盐水 | n/a | n/a | |
| 分光光度计 | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| 雄性和雌性 Sprague-Dawley 大鼠 | Charles River Labs | n/a | 用于烧伤建模，年龄为 7–9 周 |
| 手术剪 | F.S.T. | 14501-14 | 用于剪取所需皮肤组织 |
| 组织采集管 | Globe Scientific | 220101236 | |
| 组织匀浆机 | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | 用于匀浆组织样本 |
| 水浴锅 | Fischer Scientific, USA | n/a | 用于诱导烧伤损伤 |
| 加权加热垫 | Comfytemp, USA | n/a | 操作过程中用于维持大鼠体温 |
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