大鼠烧伤模型用于研究全层皮肤热损伤及感染

摘要

建立一种模拟烧伤后感染临床情况的模型，对于推进烧伤研究至关重要。本方案展示了一种简单且可重复的大鼠烧伤感染模型，其病理特征与人类烧伤相似，有助于开展烧伤及其继发感染的研究，从而推动新型局部抗生素治疗策略的开发。

摘要

在大鼠模型中，烧伤诱导方法的描述往往不一致。为了开展可重复的烧伤研究，有必要建立一种能够代表临床实际情况的标准化烧伤创面模型。本方案描述了一种简单且可重复的方法，用于在大鼠身上制造约20%体表面积（TBSA）的全层皮肤烧伤。具体操作中，将一根直径为5.4 cm、面积为22.89 cm²的铜棒在水浴中加热至97 °C后，施加于大鼠皮肤表面以诱导烧伤损伤。由于铜棒具有高热导率，能够将热量更深入地传递至皮肤组织，从而形成全层烧伤。组织学分析显示，表皮显著变薄，并伴有真皮层及皮下组织全层的凝固性损伤。此外，该模型能够模拟住院烧伤患者在烧伤后所出现的临床状况，如免疫功能紊乱和细菌感染。该模型还可重现由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的全身性细菌感染。综上所述，本文介绍了一种易于掌握且稳定的烧伤大鼠模型，能够模拟包括免疫功能紊乱和细菌感染在内的多种临床情况，对于开发新型局部抗生素药物以治疗烧伤创面及其相关感染具有重要应用价值。

引言

烧伤是最严重的创伤形式之一 ，即使在专业的烧伤中心，其死亡率仍高达12%^1,2,3。根据最近发布的报告，美国每年约有48.6万名烧伤患者需要接受医疗救治，其中近3,500人因此死亡^1,2,3,4,5,6。烧伤对患者的免疫系统构成重大挑战，并造成明显的开放性伤口，愈合缓慢，使患者容易受到医院内机会性细菌的皮肤、肺部及全身性定植感染。免疫功能紊乱与细菌感染共同作用，导致烧伤患者的发病率和死亡率显著升高⁷。

动物烧伤和感染模型对于研究皮肤损伤及烧伤创伤相关免疫抑制后细菌感染的发病机制至关重要。此类模型有助于设计和评估治疗烧伤患者细菌感染的新方法。已有文献报道，大鼠与人类具有相似的皮肤生理和病理特征⁸。此....

方案

所有实验程序均经北卡罗来纳大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并依照其既定指南进行。实验使用7至9周龄、体重250-300 g的雄性和雌性斯普拉格-道利大鼠。所有动物均饲养在12小时光照/12小时黑暗循环环境中，可自由获取食物和水ad libitum。在研究开始前，务必与机构兽医共同制定镇痛方案。 

1. 烧伤损伤大鼠的制备

1. 在烧伤前24小时准备动物以进行烧伤损伤。
2. 在诱导室中使用100%氧气携带5%异氟烷对大鼠麻醉5分钟（流速：2 L/min），直至呼吸变慢。
3. 当大鼠深度麻醉（四肢脚趾捏压无反应）后，将其移至加热垫上，呈俯卧位，并通过鼻罩将异氟烷浓度降低至1.5%以维持麻醉。
4. 为防止麻醉后及操作过程中角膜干燥，使用棉签蘸取眼用润滑剂涂抹于双眼角膜表面。
5. 使用电动剪刀（见材料表）剃除大鼠背部肩胛骨至尾根部大面积区域的毛发，尽可能去除所有毛发（图2A）。
6. 用生理盐水浸湿的组织擦拭剃毛区域，清除松散毛发。使用棉签将脱毛膏均匀涂抹于剃毛区域，静置约3分钟。
   注意：使用推荐脱毛膏时间超过3分钟将导致皮肤出现红斑。
7. 用湿润纱布海绵擦拭该区域两次，以彻底清除残留脱毛膏....

结果

本方案具有高度可重复性，可在大鼠身上成功诱导出三度全层皮肤烧伤损伤。烧伤后创面呈蜡白色（图2B）。在烧伤后72小时内，烧伤创面的颜色逐渐由白色转变为棕色（图2B-E）。

组织学分析证实为全层烧伤（烧伤后24小时深度＞2.61 mm；图3B）。 与未烧伤的完整皮肤相比，烧伤动物在烧伤后24、48和72小时的皮肤样本均显示各层组织受损（图3）。此外，组织学分析显示表皮层完全破坏，真皮层全层受损，并累及皮下脂肪和骨骼肌（图3B）。

为评估细菌清除情况，在感染后24、48和72小时采集多种组织 P. aeruginosa 和 S. aur.......

讨论

已有多种烧伤模型被用于研究烧伤损伤的病理生理学过程^8,12,16,17。在本研究中，我们采用大鼠模型建立了一种简单且可重复的实验方案，以诱导全层皮肤烧伤，随后进行细菌感染，从而模拟患者中感染性烧伤创伤的情况。选择大鼠作为模拟人类状况的动物模型，是基于成本、操作便利性、数据可重复性与可靠性之间的平衡。本研究所采用的大鼠模型相较于其他模型具有诸多优势：易于操作，且是目前最常用的烧伤模型，便于在不同文献之间进行比较。尽管大鼠在实验环境中被广泛使用，但大鼠与人类的皮肤结构在组织学上并不完全相同^18,19。大鼠的皮肤系统由表皮、一层称为脂肪筋膜（panniculus adiposus）的脂肪层组成，其下方为一层疏松结缔组织鞘，该层与白色脂肪组织和平滑肌相连，构成被称为肌性筋膜（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD, USA	309597	用于注射镇痛药
1.7 mL 微量离心管	Olympus, USA	24-282	用于盛装吗啡
10% NBF	VWR, USA	16004-115	用于固定皮肤组织以进行染色
30 mL 注射器	BD, USA	302832	用于注射乳酸林格液
70% 乙醇	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 数字病理 切片扫描仪（配备 ImageScope 软件）	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	用于 H & E 切片的扫描与分析
西曲溴铵琼脂平板	BD, USA	285420	用于选择性培养Pseudomonas aeruginosa
铜棒	n/a	n/a	用于诱导烧伤损伤
棉签	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	用于涂抹眼药膏
电动剃须刀	Oster, USA	Golden A5	用于去除背部毛发
眼用润滑剂	Dechra, UK	n/a	眼部润湿剂，提供持久舒适感，防止眼睛干涩
填充绒毛的垫巾	Medline, USA	MSC281225	用于烧伤操作过程
镊子	F.S.T.	11027-12	用于夹持皮肤组织
纱布海绵	Oasis, USA	PK412	用于清除背部涂抹的脱毛膏
耐热手套	n/a	n/a	用于持握加热后的铜棒
血液学分析仪	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
麻醉诱导室	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	用于对动物进行麻醉
胰岛素注射器	BD, USA	329461
异氟烷	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	用于麻醉大鼠，诱导意识丧失
异氟烷蒸发器	n/a	n/a
乳酸林格液	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	用于复苏大鼠
L 形涂布棒	Fischer Scientific, USA	14-665-230
甘露醇琼脂	BD, USA	211407	用于选择性培养Staphylococcus aureus
微量采血管（K2EDTA）	greiner bio-one, USA	450480	用于采集血液
吗啡	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	该镇痛药用于阻断烧伤疼痛感知
穆勒-欣顿肉汤	BD, USA	275730
穆勒-欣顿 II 琼脂	BD, USA	211438
Nair 脱毛乳液	Nair, USA	n/a	用于去除背部残留毛发
23 G 针头	BD, USA	305193	用于注射乳酸林格液
生理盐水	n/a	n/a
分光光度计	ThermoScientific, USA	Genesys 30
雄性和雌性 Sprague-Dawley 大鼠	Charles River Labs	n/a	用于烧伤建模，年龄为 7–9 周
手术剪	F.S.T.	14501-14	用于剪取所需皮肤组织
组织采集管	Globe Scientific	220101236
组织匀浆机	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	用于匀浆组织样本
水浴锅	Fischer Scientific, USA	n/a	用于诱导烧伤损伤
加权加热垫	Comfytemp, USA	n/a	操作过程中用于维持大鼠体温