方法文章

荧光RNA适配体 外和细胞 开启动力学的测定

DOI：

10.3791/64367

⸱

2022年8月9日

 ,  , 
1Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议提供了两种确定荧光RNA适配体菠菜2和西兰花动力学的方法。第一种方法描述了如何使用酶标仪 在体外 测量荧光适配体动力学，而第二种方法详细介绍了通过流式细胞术测量细胞中荧光适配体动力学。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

荧光RNA适配体已被应用于活细胞中，以标记和可视化RNA，报告基因表达，并激活荧光生物传感器，以检测代谢物和信号分子的水平。为了研究每个系统中的动态变化，需要获得实时测量，但测量的准确性取决于荧光反应的动力学比采样频率快。在这里，我们描述了分别使用配备样品进样器和流式细胞仪的酶标仪来确定荧光RNA适配体的体外和细胞开启动力学的方法。我们表明，Spinach2和西兰花适配体荧光活化的体外动力学可以建模为两相反合反应，并且具有不同的快速相速率常数0.56 s-1和0.35 s-1。此外，我们表明，大肠杆菌中Spinach2荧光激活的细胞动力学仍然足够快，可以在分钟时间尺度上实现准确的采样频率。这些分析荧光活化动力学的方法适用于已开发的其他荧光RNA适配体。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

荧光反应是产生荧光信号的化学反应。荧光RNA适配体通常通过结合小分子染料来提高其荧光量子产率来执行此功能（图1A）1。已经开发了不同的荧光RNA适配体系统，由特定的RNA适配体序列和相应的染料配体1组成。荧光RNA适配体已作为荧光标签附加到RNA转录本中，可实现mRNA和非编码RNA2，3，4的活细胞成像。它们也被放置在启动子序列之后作为基因表达的荧光报告基因，类似于使用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，只是报告功能在RNA水平5，6。最后，荧光RNA适配体已被掺入基于RNA的荧光生物传感器中，其设计用于响应特定的小分子触发荧光反应。基于RNA的荧光生物传感器已被开发用于各种非荧光代谢物和信号分子的活细胞成像7，8，9，10，11。

人们越来越关注荧光RNA适配体的开发，以可视化RNA定位，基因表达和小分子信号的动态变化。对于这些应用中的每一个，都需要获得实时测量，但测量的准确性取决于荧光反应的动力学是否快于采样频率。在这里，我们描述了使用配备样品进样器的酶标仪确定荧光RNA适配体Spinach2 12和Broccoli13的体外动力学的方法，并使用流式细胞仪确定在大肠杆菌中表达的Spinach2的细胞开启动力学的方法。之所以选择这两种RNA适配体，是因为它们已被应用于研究RNA定位2，3，4，它们已被用于报告5，6和生物传感器7，8，9，10，11，并且相应的染料配体（DFHBI或DFHBI-1T）已上市。表14，13，14给出了文献中确定的它们的体外特性的摘要，这为方案开发提供了信息（例如，使用的波长和染料浓度）。这些结果表明，受RNA适配体影响的荧光反应是快速的，不应妨碍所需细胞生物学应用的准确测量。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 体外 动力学实验

  1. 通过PCR制备DNA模板
    1. 设置PCR反应:要制备PCR反应，请将以下试剂合并到薄壁PCR管中:
      33 μL 双蒸水 （ddH2O）
      10 μL 5x 缓冲液，用于高保真 DNA 聚合酶
      5 μL 脱氧核糖核苷三磷酸 （dNTP） 各 2 mM
      0.5 μL 40 μM 正向引物
      0.5 μL 40 μM 反向引物
      0.5 μL （10-100 ng） DNA 模板（仅适用于菠菜2 PCR;西兰花底漆重叠）
      0.5 μL 高保真 DNA 聚合酶（最后添加）
      注意:合成寡核苷酸通常干运。要制备储备溶液，请加入已知体积（推荐 100 μL）的 ddH2O，并测量该溶液的 A260 ，以根据比尔定律确定浓度，其中消光系数可以通过最近邻规则在线计算。然后，该储备溶液可用于制备适合PCR的稀释液。
    2. 运行热循环仪协议。
      1. 使用以下热循环仪方案扩增全长菠菜2和西兰花DNA模板:
        初始变性:98°C2分钟
        35 个周期:
        变性:98°C变性15秒
        退火:72°C30秒
        延长:72 °C 持续 30 秒
        最终延伸:72°C5分钟。
      2. 反应后，用2%琼脂糖凝胶和低分子量分子量标准（大小范围:25-766个核苷酸）分析少量等分试样，以确认所需DNA产物的存在。
      3. 通过市售凝胶提取或PCR纯化试剂盒纯化产品，并用ddH2O或制造商提供的缓冲液洗脱。
        注意:选择PCR净化试剂盒时，请确保柱分子量截止值足够低以保留T7-西兰花（81个核苷酸），否则PCR产物将丢失。
        注意:可选的暂停点:将DNA储存在-20°C。
  2. 通过 体外 转录（IVT）制备菠菜2和西兰花RNA
    1. 设置转录反应。
      1. 要制备 100 μL 转录反应，请将以下试剂合并到 1.5 mL 微量离心管中:10 μL 10 x 转录缓冲液 + 20 μL 10 mM 核糖核苷三磷酸 （rNTP） + 1-64 μL DNA 模板（共 1 μg）+ 2 μL 无机焦磷酸酶 + ddH 2 O 至 98 μL +2μL T7 RNA 聚合酶（最后添加）。
      2. 将该反应在37°C孵育4小时。 加入 100 μL 2x 尿素凝胶上样缓冲液 （2x ULB），由 20% 蔗糖、0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS）、1x 三硼酸盐-EDTA （1x TBE） 缓冲液和 ~18 M 尿素组成，淬灭反应。
        注意:可选的暂停点:将淬灭的反应储存在-20°C。
  3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化RNA的
    1. 菠菜2和西兰花RNA的PAGE纯化
      注意:非聚合（液体或粉末）丙烯酰胺具有剧毒。如果称出丙烯酰胺粉末，请在通风橱中称量。始终穿戴适当的防护设备，并立即摘下被丙烯酰胺粉末或溶液污染的手套，彻底洗手。如果丙烯酰胺与皮肤直接接触，请用肥皂和水清洗暴露区域至少15分钟。如果丙烯酰胺直接接触眼睛，请用水冲洗15分钟。
      1. 准备PAGE凝胶:要从全长产品中去除不需要的流产转录本和未反应的rNTP，请制备6%尿素聚丙烯酰胺凝胶。通常，28 cm x 16.5 cm x 1.5 mm凝胶可与8孔梳子一起使用。设置凝胶和电泳设备，使用1x TBE缓冲液填充储液槽。
      2. 在PAGE凝胶中上样RNA样品:每泳道进行一次200 μL淬灭反应，上样凝胶。在单独的泳道中，用跟踪染料二甲苯氰和溴酚蓝加载2x ULB，它们在凝胶中分别以106个核苷酸和26个核苷酸迁移，分别为15。在每个样品之间留出一条空通道，以避免后续步骤中的潜在污染。
      3. 运行PAGE凝胶:要将95-nt菠菜2和49-nt西兰花与其各自的截短产物分离，请在25 W下运行凝胶1.5-2小时，此时溴酚蓝染料将迁移~凝胶长度的~5/6。
      4. 可视化PAGE凝胶中的RNA样品:拆卸凝胶周围的玻璃板，并在两面用保鲜膜覆盖凝胶，在包装上标记泳道。通过在紫外线下将包裹的凝胶放在荧光TLC板上，通过UV阴影在暗室中可视化RNA条带。用记号笔快速勾勒出与产品对应的RNA条带的边缘，并关闭紫外线灯，以尽量减少紫外线照射造成的损害。
      5. 从PAGE凝胶中切除并提取RNA样品:每个样品用新鲜的剃须刀片，切除所需的产物条带，切成~1 mm立方体，然后将凝胶块加入带有500 μL压榨浸泡缓冲液的2 mL微量离心管中，以在室温（RT）下或在4°C下在旋转器上提取RNA2小时或过夜。
        注意:可选的暂停点:样品可以储存在-20°C。
      6. 沉淀核糖核酸
        1. 为了在缓冲液中从提取的RNA中分离凝胶块，将样品在4°C下以13，000× g 离心20分钟，然后使用窄头移液管提取上清液并将其加载到新的2 mL微量离心管中。
        2. 要沉淀RNA，加入1.5 mL冰冷乙醇和1 μL 20 mg/mL糖原，涡旋，并在-20°C或-80°C下储存至少1小时。
          注意:可选的暂停点:RNA可以在-20°C下储存几个月。
      7. RNA沉淀物的收集:通过在4°C下以13，000× g 离心20分钟来沉淀沉淀的RNA。 除去上清液，让剩余的乙醇在露天（~1小时）下蒸发，然后将沉淀重悬于30μL的ddH2O或1x TE缓冲液中。
        注意:此过程通常导致最终RNA浓度为~10μM。
        注意:可选的暂停点:RNA样品可以在-20°C下储存几个月。
    2. 确定RNA储液浓度。
      1. 准备用于水解反应的RNA等分试样。
        1. 为了进行该测定，首先，使用紫外可见纳米分光光度计测定原液RNA样品的A260 ，并将样品稀释的等分试样在ddH2O中稀释至~10吸光度单位（AU）。
        2. 在 0.5 mL PCR 管中制备以下反应:稀释至 ~10 AU 的 16 μL ddH 2 O + 2 μL 10x Na2CO3 缓冲液 +2μL RNA 等分试样。将反应在95°C孵育90分钟，然后使其冷却至室温。
      2. 使用核苷酸吸光度测定RNA浓度:用紫外/可见纳米分光光度计测量该样品的A260 ，并使用以下公式计算RNA浓度:
        figure-protocol-1
        其中c是RNA的浓度，b是路径长度，i是特异性核苷酸（A，C，G，或U），n i是RNA序列中核苷酸i的频率，ε i是核苷酸i的摩尔消光系数。要确定原始储备RNA浓度，请将c乘以稀释因子。
        注意:可选的暂停点:RNA可以在-20°C下储存几个月。
  4. 正在执行 in vitro 酶标仪动力学测定
    1. 设置 RNA 复性程序:通过多次选择创建新程序>添加新阶段>添加新步骤以添加以下每个步骤来创建以下热循环仪实验方案:
      70°C3分钟
      65 °C 持续 45 秒
      60 °C 持续 45 秒
      55 °C 持续 45 秒
      50 °C 持续 45 秒
      45 °C 持续 45 秒
      40 °C 持续 45 秒
      35 °C 持续 45 秒
      30 °C 持续 45 秒
    2. 变性RNA:要使菠菜2和西兰花RNA复性，请在0.5 mL薄壁PCR管中制备2 μM每种RNA的2μM储备液，然后加入等体积的2x复性缓冲液（80 mM HEPES，pH 7.5 [KOH]，250 mM KCl，6 mM MgCl2）制成1μM RNA溶液。将试管添加到热循环仪中，打开保存的复性程序，然后按运行。
      注意:如果没有热循环仪，可以将RNA在70°C加热块上孵育3分钟，然后在工作台上缓慢冷却至RT。
    3. 制备结合反应缓冲液:要制备用于一种适配体-染料结合反应的缓冲液，请制备含有缓冲液组分（69.5 μL ddH 2 O + 4 μL 1 M HEPES，pH 7.5 [KOH] + 6.2 μL 2 M KCl + 0.3 μL 1 M MgCl2）的预混液。根据所需的样本和重复数量，将这些值乘以样本数加一。通常，每个RNA样品重复三次是令人满意的。
    4. 准备读板器。
      1. 设置酶标仪进样器程序:在荧光酶标仪上，选择温度并将所需温度设置为37°C，确保 温度 已平衡到该值，然后再开始动力学实验。打开酶标仪软件，选择 设置>采集视图，然后输入以下程序进行动力学测量:
        回路:对于每个孔
        基线设置:60 个基线读数
        智能进样设置:10 μL 进样（将在基线读数后发生）
        荧光（或FL）读数为:
        激发波长:448 nm（带宽:9 nm）
        发射波长:506 纳米（带宽:15 纳米）
        墨盒:单声道 （s/n 3297）
        定时:
        总阅读时间:10分钟
        读取间隔:0.5 s
        光电倍增和光学元件:每次读取 6 次闪光
        循环:下一口井
      2. 准备注射器
        1. 清洗并吸出进样器:要准备酶标器进样器，首先选择在读板器上 注射 ，根据指示向读板器提供废物收集板，然后选择 洗涤，并按照酶标仪上的说明用 1 mL 体积的 ddH2O、75% 乙醇在 ddH2O 中清洁进样管， 然后是ddH 2O。接下来，选择 吸出，允许注射器喷射多余的液体。
        2. 注满进样器:退出上一个屏幕后，选择 Prime 以用两个260 μL体积的配体注注进样器，以确保在实验过程中将纯、浓缩的配体添加到样品中 - 在这种情况下，在ddH2O中用100 μM DFHBI灌注。
    5. 进行 体外 动力学实验:要进行一项动力学实验，首先将 80 μL 先前制备的结合缓冲液预混液加入 96 孔透明底板的一个孔中，然后加入 10 μL 变性 RNA。让该板和进样器中的DFHBI溶液在读板器中平衡至37°C15分钟。
    6. 在读取区域下的酶标仪软件设置中，选择要分析的孔，然后在"主页"选项卡下，选择"运行"以执行前面描述的动力学程序。重复此过程，直到所有实验完成。
      注意:至关重要的是，动力学实验应一次进行一个孔，以确保在重复和样品之间的相同条件下测量RNA动力学。
    7. 清洗进样器:要从进样管中除去剩余的DFHBI溶液，请按照步骤1.4.4.2.1中所述用1mL体积的ddH 2 O，75%乙醇在ddH2O中洗涤进样管，然后用ddH2O洗涤。
      注意:可选暂停点。
  5. 荧光RNA适配体 外动力学分析 。
    1. 将数据输入分析软件:将实验数据导出为电子表格，以便轻松复制数据进行处理。在分析软件中，创建一个 XY 格式的新数据表。在 X 列中，输入每个读数时间点，其中 t = 0 是 DFHBI 注入的时间。在Y列中，输入从t = 0开始的相应时间点重复之间的平均荧光值。
    2. 归一化和绘制数据图表:要归一化荧光值，请单击 "分析>数据处理">"归一化"，然后单击" 确定"。选择使用数据集的最小值和最大值进行归一化，将结果显示为分数，并绘制 结果图表，然后单击" 确定"。要创建一段时间内归一化平均荧光的图形，请单击 [数据集名称] 的归一化 图标，然后选择 图形族: 仅带点的 XY。
      注意:在绘制少量时间点的情况下，查看误差线可能很有用。如果需要这些，在选择 XY 格式数据表时，选择"Y"下的选项以在并排列中输入复制值。使用选定的默认选项绘制生成的表将生成带有误差线的图形。
    3. 执行曲线拟合以获得动力学参数:要将曲线拟合到动力学数据，请单击分析>分析数据，然后在 XY 分析选项卡下选择非线性回归（曲线拟合）。在"模型"选项卡下，单击"指数>两相关联"，使用以下两相关联方程拟合动力学数据:
      figure-protocol-2
      其中Y是时间X处的荧光，Y 0是t = 0时的荧光，K快和K慢分别是快速率和慢速常数，SpanFast和SpanSlow分别是由快速率和慢速率引起的荧光开启范围（参见代表性结果，图1）。单击"Nonlin 拟合"选项卡以查看速率常量、t1/2 值和快速百分比值。
      注意:为了获得所有这些值的标准偏差，可以采用与上述相同的方式处理单个酶标仪实验重复。

2. 细胞动力学实验

  1. 大肠杆菌菌株的制备
    1. 按照制造商的方案，用 ~100 ng 的 pET31b tRNA-Spinach2 构建体转化 BL21 星 （DE3） 大肠杆菌 细胞。
      注意:质粒构建体是市售的（质粒#79783）。
    2. 将细胞接种在含有羧苄青霉素（碳水化合物:50mg / mL）平板的LB琼脂上，并在37°C下孵育12-16小时。含有质粒的细胞将在平板上以菌落的形式生长。
      注意:可选的暂停点:板上转化的BL21星形细胞可以在4°C下用封口膜包裹1周。
  2. 生长细胞并诱导荧光RNA适配体的表达
    1. 用转化的 BL21 Star 细胞的单个菌落接种含有羧苄青霉素（碳水化合物:50 mg/mL）的非诱导培养基 （NI） 的 2 mL 培养物。重复此操作至少三个生物学重复。将培养物在37°C的培养箱/摇床中以250rpm孵育22-24小时。
      注意:可选的暂停点:在NI培养基中生长的细胞保留质粒，可以在4°C下储存1周。
    2. 在NI培养基中生长后，将培养物稀释100倍到含有羧苄青霉素（碳水化合物:50 mg/mL）的新鲜3 mL ZYP-5052自动诱导培养基（AI）中。在37°C的培养箱/振荡器中以250rpm培养细胞16-18小时以诱导表达。
      注意:培养物的典型OD600 在生长18小时后的范围为2.0-3.3。最佳细胞密度范围在2.5-3.0之间。
  3. 进行细胞动力学实验
    1. 设置流式细胞仪。
      1. 打开流式细胞仪和连接到仪器的计算机。登录流式细胞仪软件后，在" 仪器 "选项卡下，单击 "启动 "图标。按照软件屏幕上指示的步骤操作，以确保正确初始化仪器。
        注意:某些流式细胞仪将仪器启动序列称为 启动。确保遵循制造商关于将用于实验的流式细胞仪的方案。
      2. 运行性能测试（如果适用）。在 主菜单 选项卡下，单击 性能测试。在培养管中，将三滴制造商的性能跟踪珠加入 3 mL 聚焦液中。
      3. 将培养管放入样品管升降器中并抬起升降管。在单击"运行性能测试"之前，请确保跟踪微珠管的批次#与"性能测试设置"屏幕上指示的内容相同。单击"性能测试"以运行测试。
      4. 使用以下单细胞荧光采集参数为本实验设置流式细胞仪软件:
        激发激光:488 nm
        发射通道:GFP（也称为FITC）
        采集体积:40 μL（总抽吸体积为 90 μL）
        流速:200 μL/分钟
        每次测量的细胞计数:30，000
        仪器设置:
        电压:
        FSC: 480 V
        固态继电器: 400 V
        BL1: 540 V
        BL2: 392 V
        BL3: 422 V
    2. 设置实验文件。
      1. 在"实验资源管理器"选项卡中，通过右键单击流式细胞仪用户名创建新的实验文件。在下拉窗口中选择"新建实验"。当计算机屏幕上弹出一个新窗口时，选择"确定"。
      2. 在新实验文件中，右键单击"组"文件夹，然后选择 添加新样品管。标记每个特定时间点的样品管，并通过右键单击 样品 并在下拉菜单中选择 重命名 进行复制。对研究预期时间过程的重复总数和时间点重复此步骤。
    3. 制备稀释的细胞溶液:在新培养管中，加入 1.5 mL 的 1x PBS 溶液。接下来，将 AI 培养基中的 3 μL 诱导细胞添加到 1x PBS 溶液中，制成稀释的细胞溶液。对不同培养管中的每个生物重复重复此步骤。
    4. 测量细胞的背景荧光:在添加染料之前，读取每个生物复制培养管，其中包含1x PBS溶液中的细胞。这是为了测量细胞的荧光背景，以观察添加染料后折叠随时间推移而打开。
      1. 要读取读数，请将培养管放入样品管升降器中，然后用手将提升器抬高到样品注射针上。在 "收集面板 "选项卡中选择正确的示例文件，然后单击" 记录"。
      2. 运行完成后，用手用培养管降低样品管升降器。这将启动一个冲洗步骤，该步骤将 冲洗 流体系统并最大限度地减少每个生物重复样品之间的残留。运行完成后，数据将自动保存到计算机中。
      3. 重复2.3.4中的步骤以测量至少三次生物学重复的细胞荧光背景。要移动到下一个样本文件，请单击 "记录 "图标下方样品管名称附近的右箭头图标来选择下一个样本文件。
    5. 用染料在时间点测量细胞的荧光。
      1. 将 1.4 μL 浓缩染料储备液（DMSO 中的 50 mM DFHBI-1T 溶液）加入 1x PBS 溶液中，得到 50 μM DFBHI-1T 的终浓度。接下来，盖上培养管盖，然后将培养管倒置3x-5x以在获取第一个时间点读数之前均匀混合溶液。
        注意: 大肠杆菌 培养管中DMSO的总百分比不应超过10%，因为这会影响细胞活力16。
      2. 取下盖子并将培养管放入样品管提升器中。用手将支架举到样品进样针上，然后在正确的样品文件下，单击 "记录" 图标。此外，通过按"开始"进行实验来 开始 计时器。
      3. 运行完成后用手放下管升降机，重复步骤2.3.5.1-2.3.5.2。（计时器运行）通过加入 1.4 μL 浓缩的 DFHBI-1T，倒置培养管，并读取所有剩余的生物学重复。这些第一次记录将是所有生物学重复在0分钟获得的读数。对于每个生物重复，一次做一个。
        注意:记下按下记录流式细胞术采集的时间。在实验过程中坚持这个时间错开时间点。
      4. 通过将样品管提升器中的培养管升高到样品进样针，选择适当的样品文件 ，单击记录，并在每次运行完成后手动降低提升器来继续读取读数。对正在测试的所有其他时间点和生物学重复执行此操作。重复这些步骤，直到实验完成。
        注意:用铝箔覆盖样品，使样品远离光线，以避免DFHBI-1T在溶液中光漂白。
    6. 在时间点测量没有染料的细胞的荧光（对照）。
      1. 在按照制造商的方案再次使用阴性对照重复实验之前，为流式细胞仪运行适当的清洁方案。这样做是为了尽量减少从先前实验到对照时间点分析实验的任何残留。以下是两次实验之间流式细胞仪的步骤:
        1. 用手将空培养管放入试管升降器中，抬起试管支架，然后单击仪器选项卡中的疏通图标。这将在流体系统中运行反冲洗以清理任何粘性样品。用手降低管架，并在疏通序列完成后取出管子。
        2. 使用新的培养管，加入3 mL的10%漂白剂溶液，将培养管放入管架中，然后用手将支架抬高到样品注射针上。此外，如果适用于流式细胞仪，将干净的 96 孔板放入自动进样器中。
        3. 单击消毒 SIP/消毒自动进样器 SIP 图标，在整个流体系统中运行含有 10% 漂白剂的清洁序列。降低管架以完成清洁顺序。
      2. 按照步骤 2.3.3 中的说明设置控制时间点分析运行的示例文件。
      3. 在新的培养管中，在 1.5 mL 的 1x PBS 溶液中制备稀释的细胞溶液。将 AI 培养基中的 3 μL 诱导细胞添加到 1x PBS 溶液中，制成稀释的细胞溶液。对每个生物重复重复此步骤。
      4. 将 1.4 μL DMSO 逐个加入培养管中，加入一个到带细胞的 1x PBS 溶液中，并测试相同的时间点。盖上培养管盖，然后在获取第一个时间点读数之前将培养管倒置3x-5x以均匀混合溶液。对于每个生物重复，一次做一个。
      5. 使用步骤2.3.5.2-2.3.5.4，遵循与染料细胞相同的方案分析对照细胞。
    7. 关闭流式细胞仪:按照制造商的协议正确关闭仪器。对于流式细胞仪，仪器准备通过以下方式关闭:
      1. 按照步骤2.3.6.1.1-2.3.6.1.3执行流式细胞仪的初始清洁方案。
      2. 用装有 3 mL 聚焦液的培养管用 10% 漂白剂溶液替换培养管。用手提起试管支架，然后在 关闭 图标下，单击下拉菜单并选择 彻底。
        注意:可选暂停点。
  4. 流式细胞术数据分析
    1. 导出所有 FCS 文件进行分析。使用流式细胞术分析软件打开FCS文件。
    2. 使用仅单元 FCS 文件之一，从前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 点图（FSC-面积/SSC-区域）生成门，使用两个对数轴从碎片中排除任何信号。要创建此门，请单击流式细胞术分析软件上的 自动 门图标并将其命名 为门 1。将此门应用于数据处理工作区中 "所有 样本"选项卡下测试的所有样本。这将导致正在处理的所有 FCS 文件下方的 门 1 。
    3. 双击步骤 2.4.2 中使用的仅单元格 FCS 文件创建新的子集文件。将轴设置更改为 FSC 面积/FSC 高度，两者都使用对数轴。单击流式细胞术分析软件上的自动门图标以生成椭圆形 门 ，并将其命名 为Gate 2。将此门作为步骤 2.4.2 中门集下方的子集应用于所有测试样品。这将导致所有样本的 门 1 >门 2 与每个 FCS 文件相关联。
    4. 通过双击 门 2，创建另一个子集文件，其中在步骤 2.4.2 和步骤 2.4.3 中设置了两个门。将轴设置更改为 FSC 面积/直方图。将此直方图门作为子集应用于所有测试的样本，从而使所有样本都具有与每个FCS文件关联的 门1>门2>门2 。
      注意:直方图可以从 门 2 重命名为直方图，以帮助将 直方图 移动到布局窗口中，以及通过数据处理创建更多组织。
    5. 要分析平均荧光强度 （MFI） 值，请打开布局窗口。单击每个时间点的直方图门并将其拖动到布局窗口中。
    6. 对每个测试样本执行"∑平均值:BL1-A"（GFP）的统计分析，以在布局窗口中显示MFI结果。
    7. 计算至少三个独立生物学重复的每个时间点分析的MFI值的标准偏差。
    8. 通过将布局窗口导出为 PDF 文件来保存每个时间点的直方图和 MFI 值。
      注意:可选暂停点。
  5. 流式细胞术数据图表
    1. 打开包含每个时间点的直方图和 MFI 值的 PDF 文件。MFI值将被复制到数据分析软件中。在数据绘图软件中，创建一个 XY 格式的新数据表。
      1. 选择此选项可创建已选择以下内容的 XY 表:
        数据表:在新表中输入或导入数据
        选项:
        X:已用时间
        Y:在并排子列中输入（三到四个）复制值
      2. 在 X 轴上标记实验和对照运行的所有时间点。
      3. 在A组中，将所有生物重复的MFI值输入到每个时间点，以便对添加染料的细胞进行荧光分析。
      4. 在B组中，将所有生物重复的MFI值输入到每个时间点，以分析未添加染料（DMSO）的细胞。
      5. 要观察结果，请单击图表选项卡下的 [插入数据集名称]。这将把数据点显示为平均值，误差线表示每个时间点的标准偏差（s.d.）。X 轴表示经过的时间，Y 轴表示 MFI 值。

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结果

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体外 动力学
作为合成寡核苷酸购买的DNA模板和引物的序列如 表2所示， 试剂配方如 补充文件1所示。PCR扩增用于扩大带有T7启动子的DNA模板的量，这是随后的 体外 转录（IVT）反应所必需的。此外，PCR扩增可用于同一反应中的两个目的:通过引物延伸生成全长西兰花DNA模板，以及放大DNA模板。

在IVT反应合成RNA后，PAGE纯化将从全长RNA产物中去除任何不需要的截短转录本，降解产物和未反应的rNTP。这种类型的纯化是优选的，因为截短或降解的RNA会导致RNA浓度的不准确测定。由于核苷酸碱基吸收紫外线，凝胶上的RNA条带和rNTP可以在紫外下可视化为荧光TLC板的阴影。因此，可以选择性地提取对应于正确产品尺寸的条带。

最近邻方法高估了消光系数，因此高估了结构化RNA的浓度，因为它没有考虑由于碱基配对引起的低色素性

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讨论

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对于体外动力学实验，可以修改相同的通用方案以测量含有配体结合域和荧光团结合结构域的基于RNA的荧光生物传感器的体外动力学8。在这种情况下，RNA应在注射配体后进行测量之前与荧光团一起孵育，以获得配体反应动力学。如果在重复之间观察到高变异性，则可以通过在测量前检查每个样品是否允许在96孔板中平衡相同的时间来排除故障。每个样品或重复样品应在孔中单独制备，并在15分钟平衡步骤后立即测量，而不是一次制备所有样品。

对于细胞动力学实验，可以修改方案以缩短或延长时间过程，但计划生物学重复次数并调整所需的细胞溶液体积至关重要。建议将每个生物重复读数间隔在30秒至1分钟之间，以便有足够的时间仔细执行这些步骤。另一种修改是测试一种不同的荧光染料，该染料不结合RNA适配体作为替代阴性对照，其不应在背景上显示荧光活化。如果观察到不一致的结果，可以通过检查流式细胞仪是否按照制造商的方案在不同实验运行之间进行正确清洁来进行故障排除，以防止细胞或染料从上一次运行到下一次运行的任何渗漏。

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披露

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作者声明不存在利益冲突。

致谢

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这项工作得到了MCH的以下资助:NSF-BSF 1815508和NIH R01 GM124589。MRM得到了NIH T32 GM122740培训资助的部分支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Thermo Fischer ScientificBP160500
琼脂糖凝胶电泳设备Thermo Fischer ScientificB1A-BP
Alpha D-（+）-乳糖一水合物Thermo Fischer Scientific18-600-440
琥珀色 1.5 mL 微量离心管Thermo Fischer Scientific22431021
过硫酸铵 （APS）Sigma-AldrichA3678
硫酸铵 （（NH4）2SO4）Sigma-AldrichA4418
Fischer ScientificA24975
Attune 性能跟踪珠Thermo Fischer Scientific4449754
Attune 洗涤液Thermo Fischer ScientificJ24974
硼酸Sigma-AldrichB6768
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126
羧苄青霉素二钠盐Sigma-AldrichC3416
氯漂白剂AmazonB07J6FJR8D
Corning Costar 96 孔板Daigger ScientificEF86610A
培养管，12 mm x 75 mm，5 mL，带双位置盖Globe Scientific05-402-31
DFHBISigma-AldrichSML1627
DFHBI-1TSigma-AldrichSML2697
D-葡萄糖（无水）Acros OrganicsAC410955000
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma-AldrichD8418
二硫苏糖醇 （DTT）Sigma-AldrichDTT-RO
DNA 上样染料New England BiolabsB7025S
DNA LoBind Tubes （2.0 mL）Eppendorf22431048
dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTPNew England BiolabsN0446S
EDTA，pH 8.0Gibco，Life TechnologiesAM9260G
乙醇 （EtOH）Sigma-AldrichE7023
过滤吸头微量移液器吸头Thermo Fischer ScientificAM12635、AM12648、AM12655 AM12665
FlowJo 软件BD BiosciencesN/AFlowJo v10 软件
带加热控制的荧光读板器VWR10014-924
凝胶电泳电源Thermo Fischer ScientificEC3000XL2
甘油Sigma-AldrichG5516
糖原 AM95010Thermo Fischer ScientificAM95010
GraphPad PrismDotmaticsN/A来自学术组的分析软件许可证 
加热块 Thomas Scientific1159Z11
HEPESSigma-AldrichH-4034
无机焦磷酸酶Sigma-AldrichI1643-500UN
低分子量 DNA 分子量标准品New England BiolabsN3233L随附免费小瓶凝胶上样染料，紫色 （6x），无 SDS （NEB #B7025）。
氯化镁六水合物 （MgCl<亚>2）Sigma-AldrichM2670
硫酸镁 （MgSO<亚>4）Fisher ScientificMFCD00011110
微量离心管 （1.5 mL）Eppendorf22363204
微量离心机，带温度控制Marshall ScientificEP-5415R
微量移液器GilsonFA10001M、FA10003M、FA10005M FA10006M
微量移液器吸头Sigma-AldrichZ369004、AXYT200CR AXYT1000CR
Millipore滤水器，带 BioPak 装置Sigma-AldrichCDUFBI001、 ZRQSVR3WW
窄型微量移液器吸头DOT ScientificRN005R-LRS
PBS，10xThermo FischerScientificBP39920
PCR 纯化试剂盒Qiagen28181
PCR 引物和模板集成 DNA 技术
用于薄壁 PCR 管的 PCR 热循环仪Bio-Rad1851148
PCR 热循环仪Techne5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 质粒Addgene质粒 #79783
Phusion 高保真 DNA 聚合酶 New England BiolabsM0530L购买的 Phusion 高保真酶随附 5x Phusion HF 缓冲液、5x Phusion GC 缓冲液和 MgCl2 和 DMSO 溶液。
聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶梳，C.B.S. ScientificCBS ScientificVGC-1508
聚丙烯酰胺凝胶电泳设备C.B.S. ScientificASG-250
氯化钾 （KCl）Sigma-AldrichP9333
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP5655
剃须刀片Genesee科学38-101
rNTP：ATP、CTP、GTP、UTPNew England BiolabsN0450L
SDSSigma-AldrichL3771
短波紫外光源Thermo Fischer Scientific11758221
碳酸钠 （Na2CO3）Sigma-AldrichS7795
钠氯化物 （NaCl）Sigma-AldrichS7653
氢氧化钠 （NaOH）Sigma-AldrichS8045
磷酸氢二钠，无水Thermo Fischer ScientificS375-500
SoftMax Pro 分子设备N/ASoftMax Pro 6.5.1（读板软件） 通过学术团体许可证获得
无菌过滤装置ThermoFischer Scientific09-741-88
蔗糖Sigma-AldrichS0389
SYBR Safe DNA 凝胶染料Thermo Fischer ScientificS33102
用于琼脂糖凝胶电泳的 TAE 缓冲液Thermo Fischer ScientificAM9869
四甲基乙二胺 （TEMED）Sigma-AldrichT9281
Tris 碱Sigma-AldrichTRIS-RO
胰蛋白胨（颗粒）Thermo Fischer ScientificM0251S
T7 RNA 聚合酶New England BiolabsM0251S
尿素-PAGE 凝胶系统 National DiagnosticsEC-833
紫外荧光 TLC 板Sigma-Aldrich1.05789.0001
紫外/可见分光光度计Thermo Fischer ScientificND-8000-GL
涡旋混合器Thermo Fischer Scientific2215415
二甲苯青Sigma-AldrichX4126
酵母提取物（颗粒）Thermo Fischer ScientificBP9727-2
Attune NxT 流式细胞仪 Thermo Fischer Scientific A24861 Attune 1x 聚焦液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机溶液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机溶液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机液 Thermo Fischer Scientific A24904 Attune 关机 用于 0.5 mL 管的

参考文献

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