测定 体外 荧光RNA适体的细胞内激活动力学

Madeline M. Mumbleau; Madeline R. Meyer; Ming C. Hammond

doi:10.3791/64367

需要JoVE订阅才能观看此内容。请登录或开始免费试用

方法文章

测定体外荧光RNA适体的细胞内激活动力学

2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64367

⸱

2022年8月9日

Madeline M. Mumbleau^*¹ , Madeline R. Meyer^*¹ , Ming C. Hammond¹

¹Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案介绍了两种测定荧光RNA适体Spinach2和Broccoli动力学特性的方法。第一种方法描述了如何测量荧光适体的动力学参数体外使用酶标仪进行检测，而第二种方法详细描述了通过流式细胞术测量细胞中荧光生成型适配体动力学的过程。

摘要

荧光生成型RNA适体已被应用于活细胞中，用于标记和可视化RNA、报告基因表达，以及激活可检测代谢物和信号分子水平的荧光生物传感器。为了研究上述每个系统的动态变化，理想情况下需获得实时测量数据，但测量的准确性取决于荧光生成反应的动力学速度是否快于采样频率。本文描述了测定体外使用配备样品注射器的酶标仪和流式细胞仪，分别测定荧光生成型RNA适体的细胞群体激活动力学和单细胞激活动力学。我们证明了体外 Spinach2和Broccoli适体荧光激活的动力学可建模为双相缔合反应，其快速相速率常数分别为0.56 s⁻¹⁻¹ 和 0.35 秒⁻¹分别。此外，我们显示了Spinach2荧光激活的细胞动力学过程 大肠杆菌，尽管染料向革兰氏阴性菌的扩散会进一步限制其效果，但仍足够快速，可在分钟级时间尺度上实现准确的采样频率。这些分析荧光激活动力学的方法同样适用于已开发的其他荧光原生RNA适体。

引言

荧光生成反应是指能够产生荧光信号的化学反应。荧光生成RNA适体通常通过结合小分子染料以增强其荧光量子产率来实现这一功能（图1A）¹。目前已开发出多种不同的荧光生成RNA适体系统，每种系统均由特定的RNA适体序列及其对应的染料配体组成¹。荧光生成RNA适体已被作为荧光标签连接到RNA转录本上，用于在活细胞中对mRNA和非编码RNA进行成像²^,³^,⁴。它们还被置于启动子序列之后，作为基因表达的荧光报告元件，其作用类似于绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子，但其报告功能发生在RNA水平⁵^,⁶。最后，荧光生成RNA适体已被整合到基于RNA的荧光生物传感器中，这类传感器被设计为在响应特定小分子时触发荧光生成反应。基于RNA的荧光生物传感器已成功用于活细胞中多种非荧光代谢物和信号分子的成像研究⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹。

人们对开发荧光生成型RNA适体以可视化RNA定位、基因表达和小分子信号的动态变化日益关注。在这些应用中，获得实时测量结果是理想目标，但测量的准确性取决于荧光生成反应的动力学速度是否快于采样频率。本文描述了测定体外 Spinach2 荧光RNA适体的动力学¹² 和西兰花¹³ 使用配备样品进样器的酶标仪，测定在细胞中表达的Spinach2的细胞激活动力学 大肠杆菌 使用流式细胞仪。选择这两种RNA适配体是因为它们已被用于研究RNA定位²^,³^,⁴，它们已被用于报告基因系统中⁵^, ⁶ 和生物传感器⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹，相应的染料配体（DFHBI 或 DFHBI-1T）可商业获得。它们的概述体外文献中确定的性质如下所示表1⁴^,¹³^,¹⁴这些结果为实验方案的制定提供了依据（例如所用的波长和染料浓度）。结果表明，受RNA适配体影响的荧光生成反应迅速，不会妨碍所需细胞生物学应用中的准确测量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 体外动力学实验

通过PCR制备DNA模板
1. 设置PCR反应：准备PCR反应时，将以下试剂加入薄壁PCR管中：
  33 µL 双蒸水（ddH₂O
  高保真DNA聚合酶用5倍缓冲液10 µL
  2 mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）各 5 µL
  0.5 µL 40 µM 正向引物
  0.5 µL 40 µM 反向引物
  0.5 µL（10–100 ng）DNA 模板（仅用于 Spinach2 PCR；Broccoli 引物存在重叠）
  0.5 µL 高保真DNA聚合酶（最后加入）
  注意：合成寡核苷酸通常以干粉形式运输。配制储存液时，加入已知体积的无核酸酶水（推荐100 µL）。₂O，并测量A₂₆₀ 使用该溶液测定其浓度，依据朗伯-比尔定律，其中消光系数可通过在线邻近碱基对法则计算。随后可利用该储备液配制适用于PCR的适当稀释液。
2. 运行热循环仪程序。
  1. 使用以下热循环仪程序扩增全长 Spinach2 和 Broccoli DNA 模板：
    初始变性：98 °C，2 分钟
    35 个循环：
    变性：98 °C 变性 15 秒
    退火：72 °C，30 s
    延伸：72 °C，30 秒
    终末延伸：72 °C 反应 5 分钟。
  2. 反应结束后，取少量产物与低分子量DNA标记物（片段大小范围：25-766个核苷酸）一同进行2%琼脂糖凝胶电泳分析，以确认目标DNA产物的存在。
  3. 使用市售凝胶回收试剂盒或PCR纯化试剂盒纯化产物，并用ddH₂O洗脱。₂O 或制造商提供的缓冲液。
    注意：选择PCR纯化试剂盒时，务必确保柱子的分子量截留阈值足够低，能够保留T7-Broccoli（81个核苷酸），否则PCR产物将会丢失。
    注意：可选暂停点：将 DNA 储存于 −20 °C。
Spinach2 和西兰花 RNA 的制备方法体外体外转录（IVT）
1. 设置转录反应。
  1. 配制100 µL转录反应体系：在1.5 mL微量离心管中加入以下试剂：10 µL 10×转录缓冲液 + 20 µL 10 mM核糖核苷三磷酸（rNTPs）+ 1–64 µL DNA模板（总量为1 µg）+ 2 µL无机焦磷酸酶 + ddH₂O₂O至98 µL，再加2 µL T7 RNA聚合酶（最后加入）。
  2. 在37 °C下孵育该反应4小时。加入100 µL 2倍尿素凝胶加样缓冲液（2x ULB，含20%蔗糖、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、1倍Tris-硼酸-EDTA（1x TBE）缓冲液和约18 M尿素）以终止反应。
    注意：可选暂停点：将淬灭的反应物于 −20 °C 保存。
RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化
1. Spinach2 和 Broccoli RNA 的 PAGE 纯化
  警告：未聚合的（液态或粉末状）丙烯酰胺具有极高毒性。称量丙烯酰胺粉末时，应在通风橱内操作。务必穿戴适当的个人防护装备，并立即脱去被丙烯酰胺粉末或溶液污染的手套，彻底清洗双手。若丙烯酰胺直接接触皮肤，应用肥皂和水冲洗暴露部位至少15分钟。若丙烯酰胺直接接触眼睛，应立即用水冲洗至少15分钟。
  1. 制备PAGE凝胶：为去除全长转录产物中混杂的截短转录物和未反应的核糖核苷三磷酸（rNTP），配制6%尿素-聚丙烯酰胺凝胶。通常可使用尺寸为28 cm × 16.5 cm × 1.5 mm的凝胶，搭配8孔梳。安装凝胶及电泳装置，并用1× TBE缓冲液填充上下电泳槽。
  2. 将RNA样品上样至PAGE胶：每条泳道上样一个淬灭的200 µL反应体系。另设一条泳道，上样含有二甲苯青和溴酚蓝示踪染料的2x ULB，其在凝胶中的迁移位置分别对应于106个核苷酸和26个核苷酸。¹⁵在每个样本之间留出一个空白泳道，以避免后续步骤中可能发生污染。
  3. 运行PAGE凝胶：为分离95-nt Spinach2和49-nt Broccoli及其相应的截短产物，以25 W功率电泳1.5–2小时，此时溴酚蓝染料应已迁移至凝胶长度的约5/6处。
  4. 在PAGE胶中观察RNA样品：拆卸凝胶周围的玻璃板，用塑料膜将凝胶两面覆盖，并在膜上标记加样孔位置。在暗室中，将包有塑料膜的凝胶置于荧光TLC板上，用紫外阴影法在紫外灯下观察RNA条带。迅速用记号笔勾画出对应产物的RNA条带边缘，随后关闭紫外灯，以尽量减少紫外线对RNA的损伤。
  5. 从PAGE凝胶中切取并提取RNA样品：每一样品使用新的剃须刀片切下目标条带，切成约1 mm³的小块，将凝胶碎片转移至含有500 µL破碎浸泡缓冲液的2 mL微量离心管中，在旋转摇床上于室温（RT）孵育2小时或4 °C过夜，以提取RNA。
    注意：可选暂停点：样品可在 −20 °C 保存。
  6. 沉淀RNA
    1. 为将凝胶碎片与缓冲液中提取的 RNA 分离开，以 13,000 x g 在4 °C下静置20分钟，然后使用窄口移液枪吸取上清液，并转移至新的2 mL微量离心管中。
    2. 为沉淀RNA，加入1.5 mL预冷乙醇和1 µL 20 mg/mL糖原，涡旋混匀，于−20 °C或−80 °C保存至少1 h。
      注：可选暂停点：RNA 可在 −20 °C 保存数月。
  7. RNA沉淀物的收集：通过在13,000 x g离心使沉淀的RNA形成沉淀 pellet。 g 4 °C下孵育20分钟。移除上清液，将残留乙醇在开放空气中挥发约1小时，然后将沉淀重悬于30 µL ddH₂O中。₂O 或 1× TE 缓冲液。
    注意：此过程通常可获得约 10 µM 的最终 RNA 浓度。
    注意：可选暂停点：RNA 样本可在 −20 °C 保存数月。
2. 测定RNA储存液的浓度。
  1. 准备一份RNA等分试样用于水解反应。
    1. 进行该实验时，首先使用紫外/可见光纳米分光光度计测定A₂₆₀ 将原始RNA样品稀释至约10个吸光度单位（AU），使用ddH₂O制备稀释分装样品₂O.
    2. 在0.5 mL PCR管中配制以下反应体系：16 µL ddH₂O₂O + 2 µL 10x Na₂CO₃ 缓冲液 + 约稀释至10 AU的2 µL RNA等分试样。在95 °C孵育反应90分钟，然后冷却至室温。
  2. 使用核苷酸吸光度测定RNA浓度：测量A₂₆₀ 使用紫外/可见光纳米分光光度计检测该样品，并利用以下公式计算RNA浓度：
    
    其中 c RNA 的浓度 b 是光程长度， i 是特定的核苷酸（A、C、G 或 U）， n_i 是核苷酸的频率 i 在RNA序列中，以及 ε_i 是核苷酸的摩尔消光系数 i. 为确定原始储存液RNA浓度，乘以 c 稀释倍数。
    注意：可选暂停点：RNA 可在 −20 °C 保存数月。
执行一项体外酶标仪动力学检测
1. 设置RNA复性程序：通过选择以下方式创建热循环仪程序 创建新程序 > 添加新相 > 添加新步骤 多次重复添加以下各个步骤，然后再按保存:
  70 °C 反应 3 分钟
  65 °C 下 45 秒
  60 °C 下 45 秒
  55 °C 下 45 秒
  50 °C 下 45 秒
  45 °C 下 45 秒
  40 °C 反应 45 秒
  35 °C 反应 45 秒
  30 °C 下 45 秒
2. 复性RNA：为了复性Spinach2和Broccoli RNA，用ddH₂O配制每种RNA的2 µM储存液₂将样品加入0.5 mL薄壁PCR管中，然后加入等体积的2×复性缓冲液（80 mM HEPES，pH 7.5 [KOH]，250 mM KCl，6 mM MgCl₂）₂) 配制 1 µM 的 RNA 溶液。将试管放入热循环仪中，打开已保存的复性程序，然后按下运行.
  注意：如果无热循环仪，可将RNA在70 °C金属浴中孵育3分钟，随后在实验台上缓慢冷却至室温。
3. 配制结合反应缓冲液：为准备一次适配体-染料结合反应的缓冲液，配制含有缓冲成分的预混液（69.5 µL ddH₂O、4 µL 5 M NaCl 和 25 µL 10× PBS 缓冲液），总体积为 100 µL。₂O + 4 µL 1 M HEPES（pH 7.5 [KOH]）+ 6.2 µL 2 M KCl + 0.3 µL 1 M MgCl₂）。根据所需的样本数量和重复次数，将这些数值乘以样本数加一。通常情况下，每个RNA样本设置三个重复即可满足要求。
4. 准备酶标仪。
  1. 设置酶标仪加样器程序：在荧光酶标仪上选择温度并将设定温度设为 37 °C，确保在开始动力学实验前温度已充分平衡至该值。打开酶标仪软件，选择 设置 > 采集视图，并输入以下程序以进行动力学测量：
    环：每个孔
    基线设置：60 次基线读数
    SmartInject 设置：10 µL 进样（将在基线读数后进行）
    荧光（或 FL）读数:
    激发：448 nm（带宽：9 nm）
    发射：506 nm（带宽：15 nm）
    墨盒：MONO（序列号 3297）
    时间：
    总阅读时间：10 分钟
    读取间隔：0.5 s
    PMT与光学系统：每次读取6次闪光
    环下一个孔
  2. 准备注射器
    1. 清洗并抽吸注射器：为准备酶标仪注射器，首先选择注射在酶标仪上，根据提示为酶标仪提供废液收集板，然后选择洗涤，并使用ddH₂O以1 mL体积按照酶标仪说明书清洗进样管₂O，ddH₂O 中的 75% 乙醇₂O，然后加入ddH₂O₂O. 接下来，选择吸出，使注射器能够排出多余液体。
    2. 启动注射器：退出至前一屏幕后，选择启动用两份260 µL的待注射配体对注射器进行预冲洗，以确保实验过程中加入样品的是纯净且高浓度的配体——本实验中，使用100 µM DFHBI溶于ddH₂O中进行预冲洗₂O.
5. 执行体外动力学实验：进行一次动力学实验时，首先向96孔透明底板的一个孔中加入80 µL预先配制的结合缓冲液主混合液，随后加入10 µL复性RNA。将该板与注射器中的DFHBI溶液在酶标仪中于37 °C平衡15分钟。
6. 在酶标仪软件中设置在……下方 读取区域，选择要分析的孔，然后在首页标签，选择运行执行先前所述的动力学程序。重复此过程，直至所有实验完成。
  注意：至关重要的是，动力学实验应一次只进行一个孔，以确保在重复样本和不同样本之间，RNA动力学的测量条件完全一致。
7. 清洗注射器：为去除注射管中残留的DFHBI溶液，用1 mL去离子水按1.4.4.2.1步骤所述清洗注射管。₂O，ddH₂O 中的 75% 乙醇₂O，然后加入ddH₂O₂O.
  注：可选暂停点。
分析体外荧光RNA适体的动力学
1. 将数据输入分析软件：将实验数据导出为电子表格，以便轻松复制数据进行后续处理。在分析软件中创建一个新的XY格式数据表。在X列中输入每次读数的时间点，其中t = 0表示DFHBI注射的时间。在Y列中输入对应时间点各重复样本之间的平均荧光值，起始时间为t = 0。
2. 标准化并绘制数据：为了标准化荧光值，点击 分析 > 数据处理 > 标准化，然后点击好的选择使用数据集的最小值和最大值进行归一化，以分数形式呈现结果，并 绘制结果，然后点击好的要创建随时间变化的归一化平均荧光强度图，请单击 [Dataset Name]的标准化 图标并选择图族：XY 与 仅限要点.
  注意：当绘制的时间点数量较少时，误差线有助于数据的可视化。如果需要显示误差线，在选择XY格式数据表时，应选择“Y”下方的选项，以将重复测量值输入到并列的列中。使用默认选项绘制生成的数据表后，所得图形将包含误差线。
3. 进行曲线拟合以获得动力学参数：要对动力学数据进行曲线拟合，请点击 分析 > 分析数据 并选择 非线性回归（曲线拟合） 在……之下 XY 分析 标签。在下方模型标签，点击 指数 > 两相关联 使用以下双相关联方程拟合动力学数据：
  
  其中 Y 是时间点处的荧光强度 X, Y₀ t = 0 时的荧光强度， K_快速 和 K_缓慢 分别为快速和慢速反应的速率常数，SpanFast 和 SpanSlow 分别表示由快速和慢速反应速率所贡献的荧光开启范围（参见代表性结果，图1）。点击 非线性拟合 按 Tab 键查看速率常数，t_1/2 值和 PercentFast 值。
  注意：为了获得这些数值的标准偏差，可将单个酶标仪实验的重复样本按照上述相同方法进行处理。

2. 细胞动力学实验

制备 E. coli 菌株
1. 转化BL21 Star (DE3) E. coli 按照制造商的说明书，用约100 ng的pET31b tRNA-Spinach2质粒转染细胞。
  注意：质粒构建体为商业可得产品（质粒编号 #79783）。
2. 将细胞接种于含有羧苄青霉素（Carb：50 mg/mL）的LB琼脂平板上，37 °C培养12–16小时。含有质粒的细胞将在平板上形成菌落。
  注意：可选暂停点：转化后的BL21 Star细胞平板可用封口膜包裹后于4 °C保存1周。
培养细胞并诱导荧光生成RNA适体的表达
1. 接种一株转化后的BL21 Star细胞单菌落于2 mL含羧苄青霉素（Carb：50 mg/mL）的非诱导培养基（NI）中。至少重复三次生物学重复实验。将培养物置于37 °C、250 rpm的摇床培养箱中培养22–24小时。
  注：可选暂停点：在 NI 培养基中培养的细胞可保留质粒，并可在 4 °C 保存 1 周。
2. 在NI培养基中培养后，将菌液按100倍稀释接种于含有羧苄青霉素（Carb：50 mg/mL）的新鲜3 mL ZYP-5052自诱导培养基（AI）中。将细胞置于37 °C、250 rpm的恒温摇床中培养16–18小时以诱导表达。
  注意：典型的OD₆₀₀ 培养18小时后，培养物的细胞密度范围为2.0–3.3。最佳细胞密度范围为2.5–3.0。
进行细胞动力学实验
1. 设置流式细胞仪。
  1. 打开流式细胞仪及与之连接的计算机。登录流式细胞仪软件后，在软件界面中依次进入仪器标签，点击 初创企业 图标。按照软件屏幕上的步骤操作，以确保仪器正确初始化。
    注意：某些流式细胞仪将仪器启动程序称为引发请务必遵循实验所用流式细胞仪制造商提供的操作规程。
  2. 运行性能测试（如适用）。在 主菜单 标签，点击 性能测试在培养管中，加入三滴制造商提供的性能追踪微珠到3 mL聚焦液中。
  3. 将培养管放入样品管升降架中，并升起升降架。在点击之前 运行性能测试，确保追踪微珠管的批号与标注的批号一致 性能测试设置 屏幕。单击 性能测试 进行测试。
  4. 为本实验设置流式细胞仪软件，单细胞荧光检测的采集参数如下：
    激发激光：488 nm
    发射通道：GFP（也称为 FITC）
    采集体积：40 µL（总吸取体积为90 µL）
    流速：200 µL/min
    每次测量的细胞计数：30,000
    仪器设置：
    电压：
    FSC：480 V
    SSC：400 V
    BL1：540 V
    BL2：392 V
    BL3：422 V
2. 设置实验文件。
  1. 在软件中创建一个新的实验文件 实验探索器 右键点击流式细胞仪用户名进行标签操作。选择 新实验 在下拉窗口中。当计算机屏幕上弹出新窗口时，选择好的.
  2. 在新的实验文件中，右键单击“Group”文件夹，然后选择 添加新样本管. 通过右键单击为每个特定时间点和重复样本的样品管进行标记样本并选择 重命名 在下拉菜单中重复此步骤，以完成研究计划时间过程中所需的全部重复次数和时间点。
3. 制备稀释细胞悬液：取一支新的培养管，加入1.5 mL 1×PBS溶液。随后，将3 µL AI培养基中的诱导细胞加入该1×PBS溶液中，制成稀释细胞悬液。对不同培养管中的每个生物学重复均重复此步骤。
4. 测量细胞的背景荧光：在加入染料之前，对每份含有细胞的1×PBS溶液的生物学重复培养管进行读数，以测定细胞自身的荧光背景，从而在加入染料后观察荧光信号随时间变化的倍数增长情况。
  1. 读取数据时，将培养管放入样品管托架中，手动抬起托架至样品进样针位置。在系统中选择正确的样品文件 采集面板 标签，然后单击记录.
  2. 当运行结束后，用手将样品管升降器连同培养管一起降下。这将启动一个冲洗冲洗流体系统并尽量减少每个生物学重复样本之间的残留。运行结束后，数据将自动保存到计算机中。
  3. 重复步骤 2.3.4，至少对三个生物学重复样本测量细胞荧光背景。要切换至下一个样本文件，请点击样本管名称下方靠近样本管名称处的右箭头图标以选择下一个样本文件记录图标。
5. 对染色细胞在不同时间点进行荧光测定。
  1. 向含细胞的1× PBS溶液中加入1.4 µL浓缩染料储备液（DMSO中50 mM DFHBI-1T），使DFHBI-1T的终浓度为50 µM。随后拧紧培养管盖，反复倒置培养管3至5次，充分混匀溶液，然后进行第一个时间点的读数。
    注意：培养管中 DMSO 的总体积百分比不得超过 E. coli 不应超过10%，否则可能影响细胞活力¹⁶.
  2. 取下管盖，将培养管放入样品管托架中。用手将托架抬升至样品进样针位置，并在相应的样品文件下点击记录此外，通过按下计时器开始计时开始用于实验。
  3. 运行结束后，手动降低试管提升器，然后重复步骤2.3.5.1–2.3.5.2（计时器持续运行），向每支培养管中加入1.4 µL浓缩的DFHBI-1T，倒置混匀，依次对所有剩余的生物学重复样本进行读数。这些首次记录即为各生物学重复样本在0 min时的读数。每次仅对一个生物学重复样本进行操作。
    注意：记录按下流式细胞术采集按钮的时间。在实验过程中，各时间点均需严格遵循此时间间隔。
  4. 继续通过将样品管提升器中的培养管升至样品进样针位置，选择正确的样品文件，点击记录每次运行结束后手动降低升降器。对所有额外的时间点和生物学重复样本进行相同操作。重复上述步骤，直至实验完成。
    注意：为避免溶液中的DFHBI-1T发生光漂白，需用铝箔覆盖样品以避光。
6. 在未加染料的细胞（对照）中，于不同时间点测定荧光。
  1. 在按照制造商的方案使用阴性对照重复实验之前，应先对流式细胞仪运行适当的清洁程序。此步骤旨在尽量减少前次实验对对照时间点分析实验的残留干扰。以下为每次实验间流式细胞仪所遵循的操作步骤：
    1. 用手将一个空的培养管放入试管提升器中，抬起试管架，然后点击疏通图标位于仪器标签。这将启动流体系统的反向冲洗，以清除任何粘性样品。手动降低试管架，然后取出试管疏通测序完成。
    2. 使用新的培养管，加入3 mL 10%次氯酸钠溶液，将培养管放入试管架中，并手动将试管架升至样品进样针位置。此外，如适用于流式细胞仪，将一块洁净的96孔板放入自动进样器中。
    3. 点击 SIP消毒/SIP自动进样器消毒 运行流体系统全管路10%次氯酸钠清洗程序的图标。降低试管架以完成清洗程序。
  2. 按照步骤 2.3.3 中的说明，设置对照时间点分析运行的样本文件。
  3. 在新的培养管中，用1.5 mL 1×PBS溶液制备稀释的细胞悬液。取3 µL AI培养基中诱导后的细胞加入1×PBS溶液中，制成稀释的细胞悬液。每个生物学重复均重复此步骤。
  4. 向含有细胞的1x PBS溶液中，逐个向培养管内加入1.4 µL DMSO，并在相同时间点进行检测。盖紧培养管管盖，然后将培养管颠倒混匀3–5次，使溶液充分混合，随后立即进行第一个时间点的测定。每个生物学重复均需依次单独操作。
  5. 按照步骤 2.3.5.2-2.3.5.4，对对照细胞采用与染色细胞相同的分析方案。
7. 关闭流式细胞仪：按照仪器制造商提供的规程正确关闭设备。对于该流式细胞仪，应按以下方式准备关机：
  1. 按照步骤 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3 执行流式细胞仪的初始清洁程序。
  2. 将含有10%次氯酸钠溶液的培养管更换为含有3 mL聚焦液的培养管。用手抬起试管架，然后在关闭图标，点击下拉菜单并选择 彻底的.
    注：可选暂停点。
流式细胞术数据分析
1. 导出所有 FCS 文件用于分析。使用流式细胞术分析软件打开 FCS 文件。
2. 使用其中一个仅含细胞的 FCS 文件，基于前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）点图（FSC-Area/SSC-Area），在双对数坐标轴上设门，以排除碎片产生的信号。创建该门时，点击 AutoGate 在流式细胞术分析软件中点击图标并为其命名 门控1对所有在相同条件下测试的样本应用此门控策略 所有样本 数据处理工作区中的标签页。这将导致 门控1 位于所有正在处理的 FCS 文件下方。
3. 使用步骤 2.4.2 中的仅细胞 FCS 文件，通过双击创建一个新的子集文件。将坐标轴设置更改为 FSC-Area/FSC-Height，两者均使用对数坐标轴。单击 AutoGate 在流式细胞术分析软件中点击图标以生成椭圆门，并将其命名为 门控2将此门控作为第2.4.2步中门控集合的子集，应用于所有测试样本。这将使得所有样本具有 门控1 > 第二步 与每个 FCS 文件相关联。
4. 在步骤2.4.2和步骤2.4.3中设置的两个门均应用后，通过双击创建另一个子集文件 门控 2. 将坐标轴设置更改为 FSC-Area/直方图。将此直方图门控作为子集应用于所有测试样本，使所有样本均具有 门控1 > 门控 2 > 门控 2 与每个 FCS 文件相关联。
  注意：直方图可以从 门控 2 到 直方图 以协助将直方图移至布局窗口，并使数据处理更具条理性。
5. 为分析平均荧光强度（MFI）值，打开布局窗口。将各时间点的直方图门控逐个点击并拖拽至布局窗口中。
6. 对每个测试样本的“∑ 均值：BL1-A”（GFP）进行统计分析，以在布局窗口中显示MFI结果。
7. 计算至少三个独立生物学重复样本在每个时间点分析中的MFI值的标准差。
8. 将布局窗口导出为 PDF 文件，以保存每个时间点的直方图和 MFI 值。
  注：可选暂停点。
图像流式细胞术数据
1. 打开包含各时间点直方图和MFI值的PDF文件。将MFI值复制到数据分析软件中。在数据绘图软件中，创建一个新的XY格式数据表。
  1. 选择以创建一个XY表格，包含以下选定内容：
    数据表：将数据输入或导入新表格
    选项：
    X：经过时间
    Y：在并列的子列中输入（三到四个）重复数值
  2. 在 X 轴上标注实验组和对照组运行的所有时间点。
  3. 在A组中，将所有生物学重复的MFI值输入到每个时间点，用于分析添加染料后细胞的荧光。
  4. 在B组中，将所有生物学重复的MFI值输入至每个时间点，用于分析未添加染料（DMSO）的细胞。
  5. 要观察结果，请点击 [插入数据集名称] 在……之下图表标签。这将显示各数据点的均值，误差线表示每个时间点的标准差（s.d.）。X轴表示经过的时间，Y轴表示MFI值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

体外动力学
合成寡核苷酸购自供应商，其DNA模板和引物序列见表2，试剂配方见补充文件1。通过PCR扩增增加含有T7启动子的DNA模板数量，以用于后续的体外转录（IVT）反应。此外，PCR扩增可在同一反应中实现两个目的：通过引物延伸生成全长的Broccoli DNA模板，同时扩增DNA模板的量。

体外转录（IVT）反应合成RNA后，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化可去除全长RNA产物中存在的任何不需要的截短转录本、降解产物以及未反应的核糖核苷三磷酸（rNTP）。首选此类纯化方法，是因为截短或降解的RNA会导致RNA浓度测定不准确。由于核苷酸碱基可吸收紫外光，因此在紫外光照射下，凝胶上的RNA条带和rNTP可在荧光薄层色谱（TLC）板背景上以阴影形式显现。因此，可选择性地切取对应于正确产物大小的条带进行回收。

最近邻法由于未考虑碱基配对引起的减色效应，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

对于体外动力学实验，可对相同的一般性方案进行修改以测量体外基于RNA的荧光生物传感器的动力学研究，该传感器包含配体结合域和荧光团结合域⁸在此情况下，应在加入配体之前，先将RNA与荧光染料孵育，以便在注入配体后测量配体响应动力学。若在重复样本间观察到较高的变异性，可通过检查每个样本在96孔板中测量前是否均经过相同时间的平衡来排查问题。每个样本或重复应分别在单独孔中制备，并在15分钟平衡步骤结束后立即测量，而不是一次性制备所有样本。

对于细胞动力学实验，可根据需要缩短或延长实验时间，但必须提前规划好生物学重复的次数，并相应调整所需的细胞溶液体积。建议每次生物学重复的检测间隔控制在30秒至1分钟之间，以确保有充足时间仔细完成每一步操作。另一种改进方法是测试使用一种不与RNA适体结合的荧光原性染料作为替代的阴性对照，该对照不应表现出超出背景水平的荧光激活。若观察到结果不一致，可通过检查流式细胞仪在不同实验运行之间是否已按照制造商的协议进行彻底清洗，以排除前一次实验的细胞或染料残留对后续实验的干扰。<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了以下基金对 MCH 的资助：NSF-BSF 1815508 和 NIH R01 GM124589。MRM 部分得到了培训基金 NIH T32 GM122740 的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Thermo Fischer Scientific	BP160500
琼脂糖凝胶电泳设备	Thermo Fischer Scientific	B1A-BP
α-D-(+)-乳糖一水合物	Thermo Fischer Scientific	18-600-440
琥珀色 1.5 mL 微量离心管	Thermo Fischer Scientific	22431021
过硫酸铵（APS）	Sigma-Aldrich	A3678
硫酸铵（(NH₄)₂SO₄)	Sigma-Aldrich	A4418
Attune NxT 流式细胞仪	Thermo Fischer Scientific	A24861
Attune 1x 聚焦液	Thermo Fischer Scientific	A24904
Attune 关机溶液	Thermo Fischer Scientific	A24975
Attune 性能追踪微球	Thermo Fischer Scientific	4449754
Attune 清洗液	Thermo Fischer Scientific	J24974
硼酸	Sigma-Aldrich	B6768
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126
羧苄青霉素二钠盐	Sigma-Aldrich	C3416
含氯漂白剂	Amazon	B07J6FJR8D
Corning Costar 96 孔板	Daigger Scientific	EF86610A
培养管，12 mm × 75 mm，5 mL，带双位置盖	Globe Scientific	05-402-31
DFHBI	Sigma-Aldrich	SML1627
DFHBI-1T	Sigma-Aldrich	SML2697
D-葡萄糖（无水）	Acros Organics	AC410955000
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	DTT-RO
DNA 上样染料	New England Biolabs	B7025S
DNA LoBind 管（2.0 mL）	Eppendorf	22431048
dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dTTP	New England Biolabs	N0446S
EDTA，pH 8.0	Gibco, Life Technologies	AM9260G
乙醇（EtOH）	Sigma-Aldrich	E7023
带滤芯的移液器吸头	Thermo Fischer Scientific	AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo 软件	BD Biosciences	N/A	FlowJo v10 软件
带加热控制的荧光酶标仪	VWR	10014-924
凝胶电泳电源	Thermo Fischer Scientific	EC3000XL2
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
糖原 AM95010	Thermo Fischer Scientific	AM95010
GraphPad Prism	Dotmatics	N/A	来自学术团体许可的分析软件
加热块	Thomas Scientific	1159Z11
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
无机焦磷酸酶	Sigma-Aldrich	I1643-500UN
低分子量 DNA Marker	New England Biolabs	N3233L	随附一管免费的紫色胶上样染料（6×），不含 SDS（NEB #B7025）。
六水合氯化镁（MgCl₂)	Sigma-Aldrich	M2670
硫酸镁（MgSO₄)	Fisher Scientific	MFCD00011110
微量离心管（1.5 mL）	Eppendorf	22363204
带温控的微量离心机	Marshall Scientific	EP-5415R
移液器	Gilson	FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
移液器吸头	Sigma-Aldrich	Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
带 BioPak 单元的 Millipore 水过滤器	Sigma-Aldrich	CDUFBI001, ZRQSVR3WW
窄口移液器吸头	DOT Scientific	RN005R-LRS
PBS，10×	Thermo Fischer Scientific	BP39920
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28181
PCR 引物和模板	Integrated DNA technologies
用于薄壁 PCR 管的 PCR 扩增仪	Bio-Rad	1851148
用于 0.5 mL 管的 PCR 扩增仪	Techne	5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 质粒	Addgene	质粒 #79783
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530L	购买 Phusion 高保真酶时，会附带提供 5× Phusion HF 缓冲液、5× Phusion GC 缓冲液，以及 MgCl₂ 和 DMSO 溶液。
聚丙烯酰胺凝胶电泳梳子，C.B.S. Scientific	C.B.S. Scientific	VGC-1508
聚丙烯酰胺凝胶电泳设备	C.B.S. Scientific	ASG-250
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9333
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655
刀片	Genesee Scientific	38-101
rNTPs：ATP、CTP、GTP、UTP	New England Biolabs	N0450L
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
短波紫外光源	Thermo Fischer Scientific	11758221
碳酸钠（Na₂CO₃)	Sigma-Aldrich	S7795
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	S8045
无水磷酸氢二钠	Thermo Fischer Scientific	S375-500
SoftMax Pro	Molecular Devices	N/A	通过学术团体许可获得的 SoftMax Pro 6.5.1（酶标仪软件）
无菌过滤装置	Thermo Fischer Scientific	09-741-88
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
SYBR Safe DNA 凝胶染色剂	Thermo Fischer Scientific	S33102
琼脂糖凝胶电泳用 TAE 缓冲液	Thermo Fischer Scientific	AM9869
四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma-Aldrich	T9281
Tris 碱	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
胰蛋白胨（颗粒状）	Thermo Fischer Scientific	M0251S
T7 RNA 聚合酶	New England Biolabs	M0251S
尿素-PAGE 凝胶系统	National Diagnostics	EC-833
紫外荧光 TLC 板	Sigma-Aldrich	1.05789.0001
紫外-可见分光光度计	Thermo Fischer Scientific	ND-8000-GL
涡旋混合器	Thermo Fischer Scientific	2215415
二甲苯氰蓝	Sigma-Aldrich	X4126
酵母提取物（颗粒状）	Thermo Fischer Scientific	BP9727-2

参考文献

Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295(2015).
Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139(2016).
Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194(2012).
Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002(2020).
Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356(2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

测定 体外 荧光RNA适体的细胞内激活动力学

本文内容

摘要

摘要

引言

方案

结果

讨论

披露

致谢

材料

参考文献

重印与许可

标签

测定体外荧光RNA适体的细胞内激活动力学