通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

摘要

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。

摘要

早期红系祖细胞最初是根据其集落形成潜能定义的 体外 并分为爆式集落形成和集落形成 "单位" 称为BFU-e和CFU-e。直到最近，仍缺乏能够直接、前瞻性地从新鲜分离的成年小鼠骨髓中完整分离出纯BFU-e和CFU-e前体细胞的方法。为填补这一空白，研究人员分析了小鼠骨髓的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，筛选编码细胞表面标志物的基因表达情况。该分析结合细胞命运测定实验，从而建立了一种新型流式细胞术方法，可识别并分离小鼠骨髓或脾脏中完整且纯净的BFU-e和CFU-e前体细胞亚群。该方法还可识别其他前体细胞亚群，包括富含嗜碱性粒细胞/肥大细胞潜能和巨核细胞潜能的亚群。该方法包括使用靶向Kit和CD55的抗体标记新鲜骨髓或脾脏细胞。表达这两种标志物的前体细胞进一步被划分为五个主要群体：群体1（P1或CFU-e，Kit⁺ CD55⁺ CD49f^医学/低 CD105^中/高 CD71^中/高) 包含所有CFU-e祖细胞，可进一步细分为P1-低（CD71^医学 CD150^高）以及 P1-hi（CD71^高 CD150^低），分别对应早期和晚期CFU-e；群体2（P2或BFU-e，Kit⁺ CD55⁺ CD49f^中/低 CD105^中/高 CD71^低 CD150^高) 包含所有的BFU-e祖细胞；P3群（P3，Kit⁺ CD55⁺ CD49f^中/高 CD105^医学/低 CD150^低 CD41^低) 富含嗜碱性粒细胞/肥大细胞祖细胞；群体4（P4，Kit⁺ CD55⁺ CD49f^中/高 CD105^中/低 CD150^高 CD41⁺) 富含巨核细胞祖细胞；而群体5（P5，Kit⁺ CD55⁺ CD49f^中/高 CD105^中/低 CD150^高 CD41^-) 包含具有红系、嗜碱性粒细胞/肥大细胞和巨核细胞潜能的前体细胞（EBMP），以及红系/巨核细胞/嗜碱性粒细胞偏向的多能前体细胞（MPPs）。这一新方法在分析红系及其他造血前体细胞时具有更高的精确性，并可对每一流式细胞术定义的细胞群体进行转录组信息的比对与参考。

引言

红细胞生成可分为两个主要阶段：早期红细胞生成和红系终末分化（图1)^1,2,3在早期红细胞生成过程中，造血干细胞定向分化为红系谱系，并产生早期红系祖细胞，这些祖细胞于20世纪70年代首次被鉴定，其依据是在半固体培养基中形成集落的能力。^4,5,6,7,8,9一般来说，红系祖细胞分为两类：较早期的祖细胞，每个都能产生一个 "爆发" （由多个较小的红系细胞簇聚集而成的大团块），称为 "红系爆式集落形成单位" 或BFU-e^4,5,6；及其子代，每个子代形成一个单一的小型红系细胞簇或集落，称为....

方案

所有实验均按照马萨诸塞大学陈医学院机构动物照护与使用委员会批准的动物实验方案 A-1586 和 202200017 进行。

注意：本文详细介绍了两种实验方案：首先为流式细胞术分析（第1部分），随后为流式细胞分选的方案调整（第2部分）。以下方案使用具有10个通道的流式细胞仪/分选仪。步骤1.14.5中参考了表1提供的示例设置。本方案也可使用9个通道完成；详见表2中的图注。

1. 流式细胞术分析

1. 使用贵机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的适当方法（例如，CO₂ 吸入后行颈椎脱位）对成年（>6 周龄）Balb/C 或 C57BL6 小鼠实施安乐死。进行流式细胞术分析时，单只小鼠的骨髓（BM）已足够。若用于分选，则所需小鼠数量取决于下游应用。各细胞群体的细胞产量见下文（步骤 2.3.3）。
2. 组织收获：
   1. 在冰上准备含有 3 mL 冷（4 °C）染色缓冲液（"SB5"：磷酸盐缓冲液（PBS）、0.2% 牛血清白蛋白（BSA）、0.08% 葡萄糖、5 mM EDTA）的 5 mL 荧光激活细胞分选（FACS）管，用于放置收获的组织。
   2. 为每只小鼠解剖出的每种组织分别准备独立的离心管。不要将多只小....

结果

本方案描述了一种通过流式细胞术鉴定 freshly harvested 骨髓和脾脏细胞中 BFU-es 和 CFU-es 的方法。首先从实验小鼠中获取新鲜的骨髓（BM）和脾脏组织，并立即将组织置于冰上。所有操作均在低温条件下进行，以维持细胞活性。细胞使用“谱系”（lineage）抗体混合物进行标记，从而排除所有表达已分化血液谱系标志物的细胞（在流式细胞术分析中使用 FITC 标记的 Lin 抗体混合物，见表3；或使用磁珠富集法获取谱系阴性细胞，见表4）。同时，细胞还使用针对特定标志物的抗体进行标记，以便在谱系阴性细胞组分中区分多种早期前体细胞群体。标记完成后，进行流式细胞术分选或分析。流式细胞术分选的方法与流式分析类似，但需先通过磁珠富集 Lin^- 细胞组分，以减少分选大量细胞所需的时间和成本。在分选前体细胞时，骨髓样本通常来自多只小鼠，具体数量取决于后续实验用途。一般而言，来自总共10只小鼠的骨髓（约 1 × 10⁹ 个细胞）可分别获得至少 50,000 至 100,000 个 P1-hi、P1-low 和 P2 细胞群体，.......

讨论

此前，研究人员一直难以直接从新鲜组织中前瞻性地分离出高纯度的BFU-e和CFU-e祖细胞。我们提出的新方法已通过单细胞RNA测序（scRNAseq）和细胞命运检测验证^1,27，现在提供了实现这一目标的工具。

成功执行分选和分析方案的关键要点有若干。首先，细胞需以 900 x g 离心，以防止低密度细胞丢失。处于 CFU-e 阶段的许多细胞体积较大且密度较低，若不采取此措施则容易丢失。其次，在移液操作中上下吹打时，必须使用大孔径吸头，以帮助打散细胞聚集体，并防止脆弱的 P1 和 P2 细胞丢失。此步骤至关重要，因为许多 CFU-e 祖细胞与红细胞岛巨噬细胞（EBIs）相关联，若未能有效解离则会导致细胞丢失。第三，在染色前需用含 EDTA 的缓冲液（"SB5"）孵育细胞，以促进 EBIs 的解离。第四，在流式细胞术数据采集过程中，采集速率不应超过每秒 7,000 个事件，或不应超过所用流式细胞仪推荐的最大采集速率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	Life Technologies	15575020
1000 µL型大孔吸头	美国科学公司	1011-9000
Alexa Fluor 647 标记抗小鼠 CD55（DAF）抗体	BioLegend	131806
APC/Cyanine7 标记抗小鼠 CD117（c-kit）抗体	BioLegend	105826
生物素-CD11b	BD 生物科学	557395	M1/70（克隆）
生物素-CD19	BD 生物科学	553784	1D3（克隆）
生物素-CD4	BD 生物科学	BDB553045	RM4-5（克隆）
生物素-CD8a	BD 生物科学	BDB553029	53-6.7（克隆）
生物素-F4/80	Biolegend	123106	BM8（克隆）
Biotin-Ly-6G 和 Ly-6C	BD 生物科学	553125	RB6-8C5（克隆）
Biotin-TER-119	BD 生物科学	553672	TER-119（克隆）
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A1470
Brilliant Violet 421 抗人/小鼠 CD49f 抗体	BioLegend	313624
Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD41 抗体	BioLegend	133921
Brilliant Violet 650 抗小鼠 CD150（SLAM）抗体	BioLegend	115931
BUV395 大鼠抗小鼠 TER-119/红系细胞	BD 生物科学	563827
ChromPure 兔 IgG，全分子	杰克逊免疫研究实验室	011-000-003
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）	Life Technologies	D1306
用于 LSR II 的 Digital DIVA 硬件和软件	BD 生物科学
FITC 标记的抗小鼠 F4/80 抗体	BioLegend	123108
FITC 标记大鼠抗 CD11b	BD 生物科学	557396
FITC 标记大鼠抗小鼠 CD19	BD 生物科学	553785
FITC 标记大鼠抗小鼠 CD4	BD 生物科学	553047
FITC 标记大鼠抗小鼠 CD8a	BD 生物科学	553031
FITC 标记大鼠抗小鼠 Ly-6G 和 LY-6C	BD 生物科学	553127
FlowJo 软件	FlowJo	版本 10	流式细胞仪分析软件
LSR II 数字多参数流式细胞仪分析仪	BD 生物科学		流式细胞仪
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正常大鼠血清	干细胞技术	13551
PE 抗小鼠 CD105 抗体	BioLegend	120408
PE/Cy7 抗小鼠 CD71 抗体	BioLegend	113812
磷酸盐缓冲液，10倍浓缩液	Fisher Scientific	BP3994
链霉亲和素纳米珠	BioLegend	480016	磁珠