流式细胞术从小鼠组织中鉴定和分离爆破形成单元和集落形成单元红系祖细胞

Summary

在这里，我们描述了一种新的流式细胞术方法，用于直接从新鲜小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期爆发形成单位红系（BFU-e）和集落形成单位红系（CFU-e）祖细胞。该协议基于单细胞转录组学数据开发，是第一个以高纯度分离所有组织红系祖细胞的方案。

Abstract

早期的红系祖细胞最初由其在体外的集落形成潜力定义，并分为爆发形成和集落形成"单位"，称为BFU-e和CFU-e。直到最近，还没有从新鲜分离的成年小鼠骨髓中直接前瞻性和完全分离纯BFU-e和CFU-e祖细胞的方法。为了解决这一差距，分析了小鼠骨髓的单细胞RNA-seq（scRNAseq）数据集，以表达编码细胞表面标志物的基因。该分析与细胞命运测定相结合，允许开发一种新的流式细胞术方法，该方法可鉴定并允许分离小鼠骨髓或脾脏中BFU-e和CFU-e祖细胞的完整和纯亚群。这种方法还可以识别其他祖细胞亚群，包括富集碱性粒细胞/肥大细胞和巨核细胞潜力的亚群。该方法包括用针对Kit和CD55的抗体标记新鲜骨髓或脾脏细胞。然后，表达这两种标记的祖细胞细分为五个主要群体。群体 1（P1 或 CFU-e，Kit+ CD55⁺ CD49f 中/低 CD105 中/高 CD71 ^中/高）包含所有 CFU-e 祖细胞，可进一步细分为 P1-低（CD71 med CD150^高）和 P1-hi（CD71^高 CD150^低），分别对应于早期和晚期 CFU-e; 群体 2（P2 或 BFU-e，Kit+ CD55⁺ CD49f 中/低 CD105 ^中/高 CD71^低 CD150^高）包含所有 BFU-e 祖细胞;群体 P3（P3、试剂盒⁺ CD55⁺ CD49f 中/高 CD105^中/低 CD150 低 CD41^低）富集用于嗜碱性粒细胞^/肥大细胞祖细胞;群体 4（P4，Kit+ CD55+ CD49f 中/高 CD105^中/低 CD150^高 CD41⁺）富集巨核细胞祖细胞;和群体 5（P5、Kit+ CD55⁺ CD49f 中^/高 CD105 中/^低 CD150^高 CD41^-）包含具有红细胞、嗜碱性粒细胞/肥大细胞和巨核细胞潜力 （EBMP） 和红细胞/巨核细胞/嗜碱性粒细胞偏向的多电位祖细胞 （MPP） 的祖细胞。这种新方法在分析红系和其他造血祖细胞时可以提高精度，并且还可以参考每个流式细胞术定义的群体的转录组信息。

Introduction

红细胞生成可分为两个主要阶段:早期红细胞生成和红系末端分化（图1）¹，^2，3。在早期红细胞生成中，造血干细胞致力于红系并产生早期红系祖细胞，这些祖细胞在 1970 年代首次根据其在半固体培养基中的集落形成潜力被鉴定⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9.从广义上讲，红系祖细胞分为两类:早期祖细胞，每个祖细胞产生"爆发"（较小红细胞簇的大集合），称为"爆发形成单位红细胞"或BFU-e⁴，^5，6;和它们的后代，每个形成一个单一的小红细胞簇或集落，称为"集落形成单位红细胞"或CFU-e⁷，^8，9。BFU-e和CFU-e尚未表达终末红系基因，并且在形态上不可识别。经过多次自我更新或扩增细胞分裂后，CFU-e经历转录开关，其中诱导珠蛋白等红系基因，从而转变为红系末端分化（ETD）^1，10。在ETD期间，成红细胞在剜除形成网织红细胞之前经历三到五次成熟细胞分裂，网织红细胞成熟为红细胞。

终末分化期间的成红细胞最初根据其形态分为原成红细胞、嗜碱性、多色和正色。流式细胞术的出现允许基于细胞大小（通过前向散射，FSC测量）和两个细胞表面标记CD71和Ter119 11，^12，13进行前瞻性分选和分离（图1）。这种和类似的流式细胞术方法¹⁴彻底改变了ETD分子和细胞方面的研究，允许在体内和体外对成红细胞进行发育阶段特异性分析10，¹⁵，¹⁶，^17，18，^19，20。CD71/Ter119方法现在常规用于红系前体的分析。

直到最近，研究人员还缺乏一种类似的、可访问的流式细胞术方法，用于从小鼠组织中直接、高纯度地前瞻性分离CFU-e和BFU-e。相反，研究人员使用了流式细胞术策略，仅分离出这些祖细胞的一小部分，通常是在存在在同一流式细胞术亚群中共同纯化的非红系细胞的情况下²¹。因此，BFU-e和CFU-e的研究仅限于体外分化系统，这些系统从早期骨髓祖细胞衍生和扩增BFU-e和CFU-e。然后可以在这些富含红系祖细胞的培养物中应用流式细胞术策略来区分CFU-e和BFU-e22^，23。另一种方法是利用胎儿CFU-e和BFU-e，它们在妊娠中期小鼠胎儿肝脏的Ter119阴性部分中高度富集¹⁰，^24，25。然而，这两种方法都不允许研究体内生理状态下的成年BFU-e和CFU-e。当回想一下，基于集落形成测定，这些细胞分别以0.025%和0.3%的频率存在于成人骨髓中时，可以理解挑战的严重^性6。

这里描述的方案是一种新颖的流式细胞术方法，基于新鲜收获的Kit⁺小鼠骨髓细胞的单细胞转录组学分析（Kit由骨髓的所有早期祖细胞群表达）¹。我们的方法包含一些已被Pronk等人使用的细胞表面标记物^21，26。单细胞转录组用于确定识别红系和其他早期造血祖细胞的细胞表面标志物的组合（图2）。具体而言，谱系阴性（Lin^-）Kit+细胞的CD55⁺部分可以细分为五个群体，其中三个产生红系轨迹的连续片段（图2）。通过分选确认这些群体中每个群体的转录组身份，然后进行scRNAseq并将分选的单细胞转录组投影回原始转录组图谱（五个群体中每个群体和整个骨髓数据集的基因表达可以在 https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html 中探索）¹.使用传统的集落形成测定（图2）以及新颖的高通量单细胞命运测定1^，27确认了每个群体的细胞命运潜力。这些分析表明，新型流式细胞术方法可高纯度分离新鲜成人骨髓和脾脏的所有BFU-e和CFU-e祖细胞。具体而言，群体 1 （P1） 仅包含 CFU-e 而不包含其他造血祖细胞，群体 2 （P2） 包含骨髓的所有 BFU-e 祖细胞和少量 CFU-e，但没有其他祖细胞¹。下面的详细方案通过注射盐水或促红细胞生成激素促红细胞生成素（Epo）的小鼠的示例实验进一步说明。

Protocol

所有实验均按照动物协议A-1586进行，并202200017马萨诸塞大学陈医学院机构动物护理和使用委员会批准。

注意:此处详细介绍了两种方案:首先，流式细胞术分析（第1节），然后是流式细胞术分选的方案调整（第2节）。以下方案使用具有10个通道的流式细胞仪/分选仪。 表 1 中提供了一个示例设置，如步骤 1.14.5 中所述。也可以仅使用九个通道运行此协议;请参阅 表 2 中的图例。

1. 流式细胞术分析

1. 使用机构动物护理和使用委员会批准的适当方法对成年（>6 周龄）Balb/C 或 C57BL6 小鼠实施安乐死（例如，吸入_{CO 2} 后颈椎脱位）。对于流式细胞术分析，来自单个小鼠的骨髓（BM）就足够了。对于分类，小鼠的数量取决于下游应用。每个群体的细胞产量如下（步骤2.3.3）。
2. 组织收获:
   1. 在冰上制备含有 3 mL 冷 （4 °C） 染色缓冲液（"SB5":磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、0.2% 牛血清白蛋白 （BSA）、0.08% 葡萄糖、5 mM EDTA 的 5 mL 荧光激活细胞分选 （FACS） 管。用它来放置收获的组织。
   2. 为从每只小鼠解剖的每个组织准备单独的管。不要汇集来自多只小鼠的组织。
   3. 收获股骨和胫骨。从骨头上去除所有肌肉，然后用SB5将它们放入管中。
   4. 通过腹部左侧的切口解剖脾脏。
3. 骨髓细胞提取:
   1. 将新鲜解剖的股骨和胫骨直接放入冷染色缓冲液（SB5）中，并将管子放在冰上，直到准备好提取骨髓（BM）。将干净的消毒研钵放在桶中的冰上。将骨头与管中的SB5一起转移到砂浆中。
   2. 用解剖剪刀剪掉每块骨头末端约1毫米，使骨头的孔口变得清晰可见。
   3. 使用26 G针头和装有SB5的3 mL注射器将骨髓从骨头中冲洗出来并将其收集到研钵中。每次使用新鲜缓冲液重复该过程3-5次，直到骨骼呈现无色。
   4. 通过100μm网状过滤器过滤冲洗的骨髓，并将细胞收集在置于冰上的50mL离心管中。
   5. 使用研钵和研杵在 5-10 mL SB5 中压碎冲洗的骨头。过滤碎骨的混合物，并通过100μm细胞过滤器和缓冲液与步骤1.3.4中收集的细胞池。
4. 脾细胞提取:
   1. 在放置在冰上的空 50 mL 离心管上设置 100 μm 网状过滤器。将单个脾脏放在网状过滤器上。
   2. 向脾脏中加入 0.5-1 mL SB5，以确保其不会干燥。
   3. 使用 3 mL 或 5 mL 注射器柱塞的橡胶侧，将脾脏捣碎。一次加入更多的SB5，5 mL，并继续捣碎，直到所有细胞都收集在管中。
5. 从这一点开始，骨髓和脾细胞以相同的方式治疗。
6. 将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟。使用真空抽吸装置吸出上清液。
7. 要制作单细胞悬液，请将细胞重悬于 2 mL SB5 中，并使用带有大孔尖端的 P1000 上下移液 50 次（参见 材料表）。它们具有宽大的尖端开口，有助于防止对脆弱细胞的损害。
8. 要计数细胞，请通过上下移液20次重悬。在SB5中以1:100的比例稀释细胞。将 10 μL 稀释细胞与 10 μL 台盼蓝混合，并在血细胞计数器和/或细胞计数器上计数。
9. 将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟。吸出上清液并将细胞重悬在 SB5 中的 33 x 10⁶ 活细胞/mL。
10. 通过混合 表3中等体积的每种抗体来制备Lin-FITC混合物。
11. 为单色对照和"荧光减一"（FMO）对照准备细胞。在步骤1.14（流式细胞术分析样品）和/或步骤2.1（流式细胞术分选）中，在制备和染色样品细胞的同时执行步骤1.11-1.12。
    1. 通过将 50 μL（1.6 x 10⁶ 个细胞）的细胞悬液转移到冰上的 FACS 管中，制备用于未染色细胞对照的细胞。通过将 50 μL（1.6 x 10^{6 个细胞} ）的细胞悬液转移到冰上的 FACS 管中，为每个单色对照（11 个管）准备细胞。
    2. 通过将 300 μL（10 x 10^{6 个细胞} ）的细胞悬液转移到冰上的单独 FACS 管中，制备以下颜色（试剂盒、CD41、CD150、CD49f [四管]）的 FMO 对照。
    3. 将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟并吸出上清液。
12. FMO 和单色对照的抗体染色
    1. 在 FACS 管中以 33 x 10⁶ 个细胞/mL（总体积为 300 μL）对 FMO 进行染色。对于每个对照，添加除FMO同名抗体之外的所有抗体。例如，对于试剂盒FMO，省略试剂盒抗体。对于每种抗体，使用表 2所示的稀释度和最终浓度。
    2. 在 FACS 管中以 20 x 10⁶ 个细胞/mL（总体积为 50 μL）对单色对照进行染色;对于每个对照，加入 表2中列出的浓度的单一抗体。
    3. 以3，000rpm（每分钟转数）涡旋每个控制管2-3秒，然后在4°C下孵育，在黑暗中摇摆2.5小时，避光。用平行于管子长度的旋转轴摇动管子，与水平面成大约 10° 到 60° 角，这样内容物就不会接触盖子。
    4. 用SB5洗涤细胞:用SB5将细胞悬液的体积补足至4mL。将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟，并吸出上清液。
13. 细胞重悬:
    1. 将未染色和所有单色对照（DAPI 对照除外）重悬于 300 μL SB5 中，并通过 40 μm 过滤网过滤到新的 FACS 管中。
    2. 通过在 SB5 中以 1:10，000 的比例稀释 DAPI 储备液（100% 乙醇溶液 1mg/mL）来制备 DAPI/SB5 溶液。
    3. 将 FMO 重悬于 1.8 mL DAPI/SB5 中，并通过 40 μm 过滤网过滤到新的 FACS 管中
    4. 将 DAPI 单色对照重悬于 300 μL DAPI/SB5 中，并通过 40 μm 滤网过滤到新的 4 mL FACS 管中。
14. 样品制备:如果正在准备用于流式细胞术分析的细胞，请转到步骤1.14。如果准备要排序的单元格，请跳至步骤 2.1。
15. 在 FACS 管中以 300 μL（10 x 10⁶ 个细胞）的总体积将流式细胞术分析样品以 33 x 10⁶ 细胞/mL 染色:
    1. 准备抗体预混液。通过样品数量确定预混液的体积，每个样品 300 μL。通过在SB5中以指示的稀释度稀释表 2 中列出的所有抗体来制备预混液。预混液中的兔 IgG 用作 Fc 块。
    2. 以3，000rpm涡旋每个管2-3秒，然后在4°C下孵育，在黑暗中摇摆2.5小时，避光。
    3. 用SB5洗涤细胞:用SB5将细胞悬液的体积补足至4mL。将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟，并吸出上清液。
    4. 按照步骤1.12.5.2制备的方法，将样品重悬于1.8mL的DAPI / SB5中以进行流式细胞术分析，并通过40μm过滤网过滤到FACS管中。
    5. 在具有10个通道的细胞仪上分析样品，以容纳 表2 中的抗体偶联物和活性染料DAPI。 表 1 中提供了示例通道设置。也可以只使用九个通道;请参阅 表 2 图例。
    6. 在流式细胞术数据分析期间，借助单色对照和FMO对照使用标准光谱补偿方法，如步骤2.4中所述。

2. 流式细胞术分选方案调整

1. 林^的制备
   1. 将来自10只小鼠的同一组织（BM或脾脏）的所有提取细胞汇集到50mL管中。通过使用带有大孔吸头的P1000移液来重悬每个混合样品。
   2. 将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟并吸出上清液。
   3. 使用未富集的单元格准备单色和 FMO 对照，如第 1 节中所述。
   4. 富集Lin-细胞，使用Lin^-细胞的磁珠富集进行分选:
   5. 用SB5以1 x 10⁸ 个细胞/mL重悬细胞，并将其转移到15 mL管中。加入正常大鼠血清和 表4 中列出的生物素化抗体，并在4°C下振荡孵育1小时。
   6. 将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟并吸出上清液。将细胞重悬于 15 mL 冷 SB5 中。
   7. 将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟并吸出上清液。将细胞重悬于1 x 10⁸ 个细胞/mL的冷SB5中，并将其保存在冰上。
   8. 以 3，000 rpm 的速度涡旋磁性纳米珠 5-10 秒。每 10 mL 细胞取 1 mL 磁性纳米珠。
   9. 在 5 mL FACS 管中洗涤纳米珠。用SB5将体积补足至4mL，以900× g，4°C旋转5分钟，并吸出上清液。
   10. 将纳米珠重悬于500μL SB5中，并与步骤2.1.7中制备的细胞混合。在4°C下摇动孵育15分钟。
   11. 将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟并吸出上清液。用SB5将细胞重悬至1 x 10⁸ 个细胞/mL。
   12. 将管子放在4°C的磁铁上5分钟。
   13. 小心地将上清液倒入新的 15 mL 管中。
   14. 将含有步骤2.1.13上清液的管放在4°C的磁铁上5分钟。小心地将上清液倒入新的 15 mL 管中。
   15. 在步骤2.1.14中以900× g，4°C旋转上清液中的细胞10分钟，并吸出上清液。
   16. 将富含Lin^的细胞重悬于1 mL SB5中。
   17. 在 SB5 中以 1:100 稀释 10 μL 细胞。将 10 μL 稀释细胞与 10 μL 台盼蓝混合，并在血细胞计数器和/或细胞计数器上计数。
   18. 根据步骤2.1.17中的细胞计数，将富含Lin^的细胞重悬至33 x 10⁶ 个细胞/mL。
2. 富集细胞染色:
   1. 通过添加表 2 中列出的所有抗体，将富集的细胞样品在 FACS 管中以 33 x 10⁶ 个细胞/mL 染色。以3，000rpm涡旋每个管2-3秒，然后在4°C下孵育，在黑暗中摇摆2.5小时，避光。
   2. 用SB5洗涤细胞:用SB5将FACS管的体积补足至4mL。将细胞在900× g，4°C下旋转10分钟，并除去上清液。
   3. 按照步骤1.12.5.2制备的方法，将样品重悬于4-6 mL DAPI / SB5中以进行流式细胞术分析，并通过40 μm过滤网过滤到新的4 mL FACS管中。
3. 样品分类:
   1. 用大喷嘴和低压对样品进行分选，以最大限度地提高CFU-e产量，因为CFU-e细胞在高压下很容易损坏。对于本研究中使用的流式细胞仪，请使用 14 psi 和 100 μm 喷嘴或 12 psi 和 130 μm 喷嘴。按照下面的步骤 2.4 中所述设置分拣门。
   2. 准备收集缓冲液:向PBS中加入20%胎牛血清。
   3. 要检查已排序群体的纯度，请在包含 DAPI 的缓冲区中从每个排序的群体中重新运行一小等分试样，如步骤 1.12.5.2 中所述。
      注意:通常，来自总共10只小鼠（约1 x 10⁹ 个细胞）的BM为每个P1-hi，P1-low和P2群体产生至少50，000-100，000个细胞，活力约为70%。
4. 使用 图 3 中所示的门控策略进行分析或设置分拣门。
   1. 使用前向散射 （FSC） 参数根据大小清除碎片。使用 FSC 高度与 FSC 区域直方图排除细胞聚集体并选择单个细胞;重复侧向散射 （SSC） 高度与 SSC 区域直方图。
   2. 通过门控对DNA染料DAPI呈阳性的细胞来排除死细胞，活细胞是不可渗透的。
   3. 选择Lin-Ter119-Kit+细胞，并从中选择表达CD55的亚群。
   4. 根据CD49f和CD105的表达，将Lin-Ter119-Kit+CD55 ⁺细胞细分为两个主要群体P6和P7。
   5. 根据 CD150 和 CD41 的表达，将 P6 进一步细分为 P3（嗜碱性粒细胞或肥大细胞祖细胞）、P4（巨核细胞祖细胞）和 P5（EBMP 和红细胞偏向的 MPP）。
   6. 根据CD150和CD71的表达，将P7进一步细分为P2（BFU-e），早期CFU-e（P1-low）和晚期CFU-e（P1-hi）。

Results

该协议描述了一种流式细胞术方法，用于鉴定新鲜收获的骨髓和脾脏细胞中的BFU-es和CFU-es。它首先从小鼠身上收获新鲜的BM和脾脏，并立即将组织放在冰上。所有程序均在低温下进行，以保持细胞活力。用"谱系"抗体混合物标记细胞，该混合物允许排除所有表达分化血系标志物的细胞（FITC-Lin鸡尾酒，表 3，在流式细胞术分析的情况下;或磁珠富集， 表4，用于谱系阴性细胞）。细胞还用针对标记物的抗体标记，这些标记物使我们能够区分谱系阴性细胞组分中的许多早期祖细胞群。标记后进行流式细胞术分选或分析。流式细胞术分选方法与流式细胞术分析方法相似，但之前对Lin^- 细胞组分进行磁珠富集，以减少分选大量细胞的时间和费用。在对祖细胞进行分选时，BM从多只小鼠中汇集，数量取决于下游应用。通常，来自总共10只小鼠（约1 x 10⁹ 个细胞）的BM对于P1-hi，P1-low和P2群体中的每一个产生至少50，000-100，000个细胞，活力约为70%。

该协议确定的脾脏和BM来源群体之间的关键区...

Discussion

直接从高纯度新鲜组织中前瞻性分离BFU-e和CFU-e祖细胞的能力以前是研究人员所没有的。我们的新方法使用scRNAseq和细胞命运测定¹，²⁷进行了验证^，现在提供了实现这一目标的工具。

成功执行排序和分析方案有许多关键点。首先，细胞需要以900 x g 的速度旋转，以防止低密度细胞的损失。CFU-e阶段的许多细胞是大的低密度细胞，否则可能会丢失。其次，上下移液时必须使用大孔吸头，以帮助破坏细胞聚集体并防止脆弱的P1和P2细胞丢失。这一步很重要，因为许多CFU-e祖细胞与成红细胞岛巨噬细胞（EBI）相关，如果不成功解离，就会丢失。第三，在染色前将细胞与含EDTA的缓冲液（"SB5"）孵育，这有助于解离EBI。第四，在流式细胞术数据采集过程中，采集速率不应超过7，000个事件/秒或正在使用的流式细胞仪仪器的推荐速率。

P1 和 P2 群体分别包含骨髓中的所有 CFU-e 和 BFU-e 祖细胞，...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA，pH 值 8.0	Life Technologies	15575020
1000 和微量;L 大孔头	美国 sceintific	1011-9000
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD55 （DAF） 抗体	BioLegend	131806
APC/Cyanine7 抗小鼠 CD117 （c-kit） 抗体	BioLegend	105826
生物素-CD11b	BD Biosciences	557395	M1/70（克隆）
生物素-CD19	BD Biosciences	553784	1D3（克隆）
生物素-CD4	BD Biosciences BDB553045		RM4-5（克隆）
生物素-CD8a	BD Biosciences	BDB553029	53-6.7（克隆）
生物素-F4/80	Biolegend	123106	BM8（克隆）
生物素-Ly-6G 和 Ly-6C	BD Biosciences	553125	RB6-8C5（克隆）
生物素-TER-119	BD Biosciences	553672	TER-119（克隆）
牛血清白蛋白	Sigma aldritch	A1470
Brilliant Violet 421 抗人/小鼠 CD49f 抗体	BioLegend	313624
Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD41 抗体	BioLegend	133921
Brilliant Violet 650 抗小鼠 CD150 （SLAM） 抗体	BioLegend	115931
BUV395 大鼠抗小鼠 TER-119/Erythroid 抗体细胞	BD Biosciences 563827
ChromPure 兔 IgG，全分子	Jackson ImmunoResearch Laboratories	011-000-003
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯吲哚，二盐酸盐）	Life Technologies	D1306
用于 LSR II 的数字 DIVA 硬件和软件	BD Biosciences
FITC 抗小鼠 F4/80 抗体	BioLegend	123108
FITC大鼠抗小鼠CD11b	BD生物科学	557396
FITC大鼠抗小鼠CD19	BD生物科学	553785
FITC大鼠抗小鼠CD4	BD生物科学	553047
FITC大鼠抗小鼠CD8a	BD Biosciences 553031
FITC大鼠抗小鼠Ly-6G和LY-6C	BD Biosciences
FlowJo 软件	FlowJo	版本 10	流式细胞仪分析软件
LSR II 数字多参数流式细胞仪分析仪	Biosciences		流式细胞仪
NewlineNY 不锈钢手动捣碎机 &碗、研钵和研杵套装	Amazon
正常大鼠血清	干细胞技术	13551
PE 抗小鼠 CD105 抗体	BioLegend	120408
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD71 抗体	BioLegend	113812
磷酸盐缓冲盐水，10x 溶液	Fisher scientific	BP3994
链霉亲和素Nanobeads	BioLegend	480016	磁珠