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方法文章

茶叶样品中吡咯里西啶生物碱污染的来源与途径

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DOI：

10.3791/64375

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2022年9月28日

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1Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province, School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, 2State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agricultural University, 3Key Laboratory of Tea Quality and Safety & Risk Assessment, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture, 4Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii at Manoa

本文内容

摘要

本实验方案描述了茶园中产吡咯里西啶生物碱（PAs）杂草对茶叶样品中PAs污染的情况。

摘要

有毒的吡咯里西啶生物碱（PAs）存在于茶叶样品中，对人类健康构成威胁。然而，茶叶样品中PAs污染的来源和途径仍不明确。本研究建立了一种结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的吸附剂方法，用于测定杂草中的15种PAs Ageratum conyzoides L., A. conyzoides 根际土壤、新鲜茶叶和干茶样品。平均回收率为78%–111%，相对标准偏差为0.33%–14.8%。十五对 A. conyzoides 和 A. conyzoides 根际土壤 从中国安徽省金寨茶园采集了60份新鲜茶叶样品，并对其中15种吡咯里西啶生物碱（PAs）进行了分析。在新鲜茶叶中仅检测到前葶芦骨-N-氧化物（intermedine-N-oxide, ImNO）和千里光宁（senecionine, Sn），其余13种PAs均未检出。ImNO的含量（34.7 µg/kg）高于Sn（9.69 µg/kg）。此外，ImNO和Sn均主要富集于茶树的嫩叶中，而在老叶中的含量较低。结果表明，茶叶中的PAs是通过产PA杂草—土壤—新鲜茶叶的途径在茶园中迁移的。

引言

作为次生代谢产物，吡咯里西啶生物碱（PAs）可保护植物免受草食动物、昆虫和病原体的侵害1,2。迄今为止，全球已在6000多种植物物种中发现660多种结构不同的PAs及其N-氧化物（PANOs）3,4。产PAs的植物主要分布于菊科（Asteraceae）、紫草科（Boraginaceae）、豆科（Fabaceae）和夹竹桃科（Apocynaceae）5,6。PAs易被氧化为不稳定的脱氢吡咯里西啶生物碱，后者具有强亲电性，可攻击DNA和蛋白质等亲核物质，导致肝细胞坏死、静脉闭塞、肝硬化、腹水及其他症状7,8。PAs毒性的主要靶器官是肝脏，还可引起肺、肾等其他器官的毒性，并具有致突变性、致癌性以及发育毒性9,10。

已有多国报告因摄入含有吡咯里西啶生物碱（PAs）的传统草药、补充剂或茶类，或通过被污染的食品（如牛奶、蜂蜜或肉类，因食用含PAs的牧草而具有毒性）间接摄入而导致人和动物中毒的病例。11,12,13欧洲食品安全局（EFSA）的研究结果表明，诸如（草本）茶等物质是人类接触吡咯里西啶生物碱（PAs/PANOs）的重要来源。14茶样品不产生PAs，而产PAs的植物在茶园中却很常见（例如 Emilia sonchifolia, Senecio angulatus，以及 Ageratum conyzoides)15此前曾怀疑茶叶在采摘和加工过程中可能受到产生物碱植物的污染。然而，在一些人工采摘的茶叶（即未混入产生物碱植物）中也检测到了生物碱，这表明必然存在其他污染途径或污染源。16. 一株千里光（ ragwort ）的共培养实验千里光（Senecio jacobaea）) 与香蜂草（melissa）Melissa officinalis），薄荷（薄荷（Mentha piperita）），欧芹（ parsley ）Petroselinum crispum），洋甘菊（母菊（Matricaria recutita））和旱金莲（Tropaeolum majus植物中进行了检测，结果显示这些植物中均检出了PAs17已证实，植物碱（PAs）确实可在活体植物之间发生转移与交换 通过 土壤18,19. Van Wyk 等20 发现路易波士茶（Aspalathus linearis在杂草较多的地区，其污染严重，且含有相同类型和比例的PAs。然而，在无杂草地区的路易博斯茶中未检测到PAs。

目前，具有高选择性和高灵敏度的超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）已广泛应用于农产品和食品中吡咯里西啶生物碱（PAs）的定性和定量分析21,22。样品前处理方法通常包括固相萃取（SPE）或QuEChERS（快速、简便、廉价、有效、耐用、安全）净化复杂食品基质提取物，以获得尽可能高的灵敏度12,19。然而，目前仍缺乏能够用于土壤、杂草和新鲜茶叶等复杂基质中PAs检测与定量的可靠分析方法。

本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）结合吸附净化方法，分析了干茶样品、新鲜茶叶、杂草及杂草根际土壤样品中的15种吡咯里西啶生物碱（PAs）。此外，从中国安徽省金寨茶园的五个采样点采集了15组配对的杂草及杂草根际土壤样品和60份新鲜茶叶样品，并对其中的15种PAs进行了检测。这些结果可为茶叶样品中PAs（污染）的来源与途径提供调查方法及相关信息，从而保障茶叶的质量与安全。

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方案

本研究采集了以下杂草种类：Ludwigia prostrata Roxb.、Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn.、Ageratum conyzoides L.、Chenopodium ambrosioides、Trachelospermum jasminoide (L.) Lem.、Ageratum conyzoides L.、Emilia sonchifolia (L.) DC、Ageratum conyzoides L. 以及 Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore。新鲜茶叶采自龙井43# 品种茶树，干燥茶叶样品为市售绿茶，按绿茶加工工艺制成（见材料表）。

1. 样品采集

  1. 采集40个实际样品。
    1. 从多个茶园中随机采集10种杂草、10份土壤和10份新鲜茶叶。
      注：本研究中，土壤采样深度为20 cm，取样量为200 g。
    2. 从超市随机采集10份干茶产品（每份250 g）。
  2. 采集杂草、土壤和新鲜茶叶样品，用于研究茶叶中吡咯里西啶生物碱（PAs）的污染来源。
    1. 在同一茶园内设置五个采样点，每个点设三个重复。
    2. 采集茶园中常见且吡咯里西啶生物碱含量最高的杂草——Ageratum conyzoides L. 的样品。
      注：本研究中，样品取样量为250 g。
    3. 采集土壤样品。
      注：土壤样品为深度20 cm的A. conyzoides根际土壤，取样量为200 g。
    4. 从茶树的不同部位采集新鲜茶叶，包括一芽二叶、一芽三叶、一芽四叶以及成熟叶片。
      ​注：样品取样量为250 g。

2. 样品处理

  1. 按照以下步骤对样品进行预处理。
    1. 使用研磨机研磨干燥的茶叶和土壤样品，将粉碎后的样品过200目筛，并于−20 °C保存。
      注：所用干燥茶叶为市售茶叶产品（见材料表），因此可直接粉碎、过筛后保存。土壤样品（200 g）置于避光通风处风干约一周。
    2. 使用均质器对杂草和新鲜茶叶进行均质处理，并于−20 °C保存。
  2. 对干燥茶叶产品、新鲜茶叶和杂草样品进行处理。
    1. 准确称取1.00 g各份样品（干燥茶叶产品、新鲜茶叶和杂草），置于50 mL离心管中。
    2. 加入10 mL 0.1 mol/L硫酸溶液，涡旋振荡2 min用于固相萃取（使用SPE小柱，见材料表），吸附剂净化时涡旋1 min。进行超声提取23 15 min，随后在室温下以9,390 × g离心10 min。
      注：超声振荡器功率为290 W，振荡频率为35 kHz，温度设定为30 °C。
    3. 用塑料尖滴管将上清液转移至另一50 mL离心管中。
    4. 重复上述步骤进行一次提取，合并两次上清液。
      1. 用5 mL甲醇和5 mL去离子水活化SPE小柱。将10 mL上清液加入预活化的小柱中，进行样品净化。
      2. 待样品溶液液面降至小柱上层时，依次用5 mL 1%甲酸溶液和5 mL甲醇洗脱目标物，弃去洗脱液。
      3. 用5 mL含0.5%氨水的甲醇洗脱，收集洗脱液，经0.22 µm膜过滤后，采用UPLC-MS/MS分析（见材料表）。
    5. 使用吸附剂进行样品净化。
      1. 取2 mL上清液（步骤2.2.4）加入含有GCB:PSA:C18吸附剂（10 mg:20 mg:15 mg，见材料表）的10 mL离心管中，涡旋振荡1 min，室温下以9,390 × g离心8 min。
      2. 取1 mL上清液经0.22 µm膜过滤后，用于UPLC-MS/MS分析。
  3. 对土壤样品进行处理。
    1. 准确称取1.00 g土壤样品，置于50 mL离心管中，加入0.1 mL 0.1 mol/L柠檬酸三钠溶液（见材料表），调节土壤pH至6.0。
    2. 静置2 min后，加入10 mL 0.1 mol/L硫酸甲醇溶液，涡旋振荡2 min，振荡30 min，随后进行30 min超声提取。
    3. 在室温下以9,390 × g离心10 min，用塑料尖滴管将上清液转移至50 mL离心管中。
    4. 重复上述步骤进行一次提取，合并两次上清液。
      ​注：纯化方法同步骤2.2.5.1和步骤2.2.5.2。

3. 仪器分析

  1. 使用市售的UPLC-MS/MS系统（2.1 mm x 100 mm，1.8 µm）（见材料表），检测干燥茶叶样品、新鲜茶叶、杂草和土壤（步骤2中的样品）中的15种PAs。
  2. 设置色谱柱温度为40 °C，流速为0.250 mL/min，进样体积为3 µL。
  3. 流动相A：甲醇（含0.1%甲酸 + 1 mmol/L甲酸铵），流动相B：水（含0.1%甲酸 + 1 mmol/L甲酸铵）。
  4. 设置梯度洗脱程序：0.0 min至0.25 min为10% A，0.25 min至6.0 min为10%–30% A，6.0 min至9.0 min为30%–40% A，9.0 min至9.01 min为40%–98% A并保持1.9 min，11.0 min至11.1 min为98%–100% A并保持2.9 min。
  5. 设置质谱仪参数：电离模式为电喷雾正离子源（ESI+）；雾化器压力为7.0 bar；毛细管电压为4.0 kV；锥孔反吹气流为150 L/h；溶剂气体流速为800 L/h；脱溶剂温度为400 °C；碰撞气流速为0.25 mL/min。

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结果

建立了15种吡咯里西啶生物碱（PAs）在干茶样品、新鲜茶叶、杂草和土壤中的优化吸附剂纯化与分析方法，并与常用的固相萃取小柱（SPE cartridge）纯化方法进行了比较。结果表明，使用SPE小柱时，干茶样品、杂草和新鲜茶叶中15种PAs的回收率为72%–120%，而采用吸附剂纯化法的回收率为78%–98%（图1）。使用吸附剂纯化法时，土壤中15种PAs的回收率为79%–111%（图1）。随机采集了40个实际样品用于检测PAs含量，以比较两种净化方法（补充表1–7）。采用吸附剂方法在全部10个干茶样品中均检出千里光宁（Heliotrine, He），含量为1.3–22 µg/kg；而使用SPE小柱仅在3个干茶样品中检出，含量为1.8–24.6 µg/kg（补充表3–4）。

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讨论

本研究旨在建立一种高效且灵敏的方法，用于探究茶叶样品中吡咯里西啶生物碱（PAs）的污染途径和来源，以及PAs在茶树不同部位的分布情况。然而，在本研究中，仅有15种PAs在色谱柱上实现了成功分离，与植物物种中存在的大量生物碱相比，这一数量非常有限3,4。这不仅与色谱柱自身的填料特性有关，也与所检测茶叶样品复杂的基质有关。因此，针对多种PAs的检测，仍需进一步探索更优的分离与纯化方法。

固相萃取（SPE）小柱和吸附剂方法已被用于检测多种样品基质中的多种吡咯里西啶生物碱（PAs），但在茶叶这种复杂基质中，尚未见报道采用吸附剂方法24。因此，本研究建立了GCB:PSA:C18（10 mg:20 mg:15 mg）比例的吸附剂净化方法，15种PAs的回收率均满足不同样品基质中PAs的检测要求。相比之下，使用SPE小柱净化时，干燥茶叶中ImNO、Eu和Re的回收率平均分别为119%、120%和115%，显示出显著的基质效应。此外，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（32102244）、国家农产品质量安全与风险评估项目（GJFP2021001）、安徽省自然科学基金（19252002）以及美国农业部（HAW05020H）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈（99.9%）Tedia Company,Inc.21115197CAS 号：75-05-8
氨水（25%-28%）无锡展旺化学试剂有限公司181210CAS 号：1336-21-6
甲酸铵（97.0%）安谱实验科技（上海）G0860050CAS 号：540-69-2
碳-GCBCNWB7760030120-400目，每盒10克 
Centrifuge Z 36 HKHERMLEZ36HK30000 转/分（最小值：10 转/分），尺寸（宽 × 高 × 深）： 71.5 厘米× 42 cm × 51 cm
市售茶叶产品吕明，青山，陆玉春，长岭，惠兴，乌云健，和生春散装茶叶绿茶
Europine N-氧化物 (EuNO) (98.0%)BioCrick323256CAS 号：65582-53-8
欧匹宁（Eu）（98.0%）BioCrick98222CAS 号：570-19-4
甲酸（98.0%）AladdinE2022005CAS 号：64-18-6
HC-C18中国台湾D211006040-63 μm，每盒100克
千里光碱（He）（98.0%）BioCrick906426CAS 号：303-33-3
千里光宁-N-氧化物（HeNO）（98.0%）BioCrick22581CAS 号：6209-65-0
高速离心机 TG16-WS荧光203158000最大转速：16000 r/min，330 × 390 × 300 mm（长 × W × H），容量：6 × 50 mL
HSS T3 色谱柱沃特斯186004976ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
野百合碱（Im）（98.0%）BioCrick114843CAS 号：10285-06-0
倒千里光宁-N-氧化物（ImNO）（98.0%）BioCrick340066CAS 号：95462-14-9
雅各宾碱（Jb）（98.0%）BioCrick132282048CAS 号：6870-67-3
Jacobine-N-氧化物（JbNO）（98.0%）ChemFacesCFN00461CAS号：38710-25-7
甲醇（99.9%）Tedia Company, Inc.21115100CAS 号：67-56-1
PSAAgelaP19-0083340-60 μ米，60 Å 每盒100克
野百合碱（Re）（98.0%）BioCrick5281743CAS号：480-54-6
野百合碱-N-氧化物（ReNO）（98.0%）BioCrick5281734CAS 号：15503-86-3
千里光宁（Sc）（98.0%）BioCrick5280906CAS 号：130-01-8
千里光宁碱-N-氧化物（ScNO）（98.0%）BioCrick5380876CAS 号：13268-67-2
千里光叶碱 N-氧化物 (SpNO) (98.0%)BioCrick6442619CAS号：38710-26-8
千里光菲林碱（Sp）（98.0%）BioCrick5281750CAS 号：480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%)BioCrick5281752CAS号：2318-18-5
SPE PCX安捷伦科技12108206阳离子混合模式，6 mL
硫酸（97%）无锡展旺化学试剂有限公司1003019CAS 号：7664-93-9
柠檬酸三钠国药集团化学试剂有限公司20121009CAS号：6132-04-3
超声波清洗机SupmileKQ-600B内槽尺寸：500 × 300 × 150 毫米；容量：22.5 升
UPLC-xevoTQMS沃特斯ZPLYY-003三重四级杆四段杆质量分析仪，Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC 液相系统
水浴恒温振荡器国语仪器SHY-2AHS振荡时间：  60-300 次/分钟，恒温范围：室温至 100 °C

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