本实验方案描述了茶园中产吡咯里西啶生物碱（PAs）杂草对茶叶样品中PAs污染的情况。
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本文内容
摘要
摘要
有毒的吡咯里西啶生物碱（PAs）存在于茶叶样品中，对人类健康构成威胁。然而，茶叶样品中PAs污染的来源和途径仍不明确。本研究建立了一种结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的吸附剂方法，用于测定杂草中的15种PAs Ageratum conyzoides L., A. conyzoides 根际土壤、新鲜茶叶和干茶样品。平均回收率为78%–111%，相对标准偏差为0.33%–14.8%。十五对 A. conyzoides 和 A. conyzoides 根际土壤 从中国安徽省金寨茶园采集了60份新鲜茶叶样品，并对其中15种吡咯里西啶生物碱（PAs）进行了分析。在新鲜茶叶中仅检测到前葶芦骨-N-氧化物（intermedine-N-oxide, ImNO）和千里光宁（senecionine, Sn），其余13种PAs均未检出。ImNO的含量（34.7 µg/kg）高于Sn（9.69 µg/kg）。此外，ImNO和Sn均主要富集于茶树的嫩叶中，而在老叶中的含量较低。结果表明，茶叶中的PAs是通过产PA杂草—土壤—新鲜茶叶的途径在茶园中迁移的。
引言
作为次生代谢产物，吡咯里西啶生物碱（PAs）可保护植物免受草食动物、昆虫和病原体的侵害1,2。迄今为止，全球已在6000多种植物物种中发现660多种结构不同的PAs及其N-氧化物（PANOs）3,4。产PAs的植物主要分布于菊科（Asteraceae）、紫草科（Boraginaceae）、豆科（Fabaceae）和夹竹桃科（Apocynaceae）5,6。PAs易被氧化为不稳定的脱氢吡咯里西啶生物碱，后者具有强亲电性，可攻击DNA和蛋白质等亲核物质，导致肝细胞坏死、静脉闭塞、肝硬化、腹水及其他症状7,8。PAs毒性的主要靶器官是肝脏，还可引起肺、肾等其他器官的毒性，并具有致突变性、致癌性以及发育毒性9,10。
已有多国报告因摄....
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方案
本研究采集了以下杂草种类：Ludwigia prostrata Roxb.、Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn.、Ageratum conyzoides L.、Chenopodium ambrosioides、Trachelospermum jasminoide (L.) Lem.、Ageratum conyzoides L.、Emilia sonchifolia (L.) DC、Ageratum conyzoides L. 以及 Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore。新鲜茶叶采自龙井43# 品种茶树，干燥茶叶样品为市售绿茶，按绿茶加工工艺制成（见材料表）。
1. 样品采集
- 采集40个实际样品。
- 从多个茶园中随机采集10种杂草、10份土壤和10份新鲜茶叶。
注：本研究中，土壤采样深度为20 cm，取样量为200 g。 - 从超市随机采集10份干茶产品（每份250 g）。
- 从多个茶园中随机采集10种杂草、10份土壤和10份新鲜茶叶。
- 采集杂草、土....
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结果
建立了15种吡咯里西啶生物碱（PAs）在干茶样品、新鲜茶叶、杂草和土壤中的优化吸附剂纯化与分析方法，并与常用的固相萃取小柱（SPE cartridge）纯化方法进行了比较。结果表明，使用SPE小柱时，干茶样品、杂草和新鲜茶叶中15种PAs的回收率为72%–120%，而采用吸附剂纯化法的回收率为78%–98%（图1）。使用吸附剂纯化法时，土壤中15种PAs的回收率为79%–111%（图1）。随机采集了40个实际样品用于检测PAs含量，以比较两种净化方法（补充表1–7）。采用吸附剂方法在全部10个干茶样品中均检出千里光宁（Heliotrine, He），含量为1.3–22 µg/kg；而使用SPE小柱仅在3个干茶样品中检出，含量为1.8–24.6 µg/kg（补充表3–4）。
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讨论
本研究旨在建立一种高效且灵敏的方法，用于探究茶叶样品中吡咯里西啶生物碱（PAs）的污染途径和来源，以及PAs在茶树不同部位的分布情况。然而，在本研究中，仅有15种PAs在色谱柱上实现了成功分离，与植物物种中存在的大量生物碱相比，这一数量非常有限3,4。这不仅与色谱柱自身的填料特性有关，也与所检测茶叶样品复杂的基质有关。因此，针对多种PAs的检测，仍需进一步探索更优的分离与纯化方法。
固相萃取（SPE）小柱和吸附剂方法已被用于检测多种样品基质中的多种吡咯里西啶生物碱（PAs），但在茶叶这种复杂基质中，尚未见报道采用吸附剂方法24。因此，本研究建立了GCB:PSA:C18（10 mg:20 mg:15 mg）比例的吸附剂净化方法，15种PAs的回收率均满足不同样品基质中PAs的检测要求。相比之下，使用SPE小柱净化时，干燥茶叶中ImNO、Eu和Re的回收率平均分别为119%、120%和115%，显示出显著的基质效应。此外，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（32102244）、国家农产品质量安全与风险评估项目（GJFP2021001）、安徽省自然科学基金（19252002）以及美国农业部（HAW05020H）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈（99.9%） | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS 号：75-05-8 |
| 氨水（25%-28%） | 无锡展旺化学试剂有限公司 | 181210 | CAS 号：1336-21-6 |
| 甲酸铵（97.0%） | 安谱实验科技（上海） | G0860050 | CAS 号：540-69-2 |
| 碳-GCB | CNW | B7760030 | 120-400目，每盒10克 |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 转/分（最小值：10 转/分），尺寸（宽 × 高 × 深）： 71.5 厘米× 42 cm × 51 cm |
| 市售茶叶产品 | 吕明，青山，陆玉春，长岭，惠兴，乌云健，和生春 | 散装茶叶 | 绿茶 |
| Europine N-氧化物 (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS 号：65582-53-8 |
| 欧匹宁（Eu）（98.0%） | BioCrick | 98222 | CAS 号：570-19-4 |
| 甲酸（98.0%） | Aladdin | E2022005 | CAS 号：64-18-6 |
| HC-C18 | 中国台湾 | D2110060 | 40-63 μm，每盒100克 |
| 千里光碱（He）（98.0%） | BioCrick | 906426 | CAS 号：303-33-3 |
| 千里光宁-N-氧化物（HeNO）（98.0%） | BioCrick | 22581 | CAS 号：6209-65-0 |
| 高速离心机 TG16-WS | 荧光 | 203158000 | 最大转速：16000 r/min，330 × 390 × 300 mm（长 × W × H），容量：6 × 50 mL |
| HSS T3 色谱柱 | 沃特斯 | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| 野百合碱（Im）（98.0%） | BioCrick | 114843 | CAS 号：10285-06-0 |
| 倒千里光宁-N-氧化物（ImNO）（98.0%） | BioCrick | 340066 | CAS 号：95462-14-9 |
| 雅各宾碱（Jb）（98.0%） | BioCrick | 132282048 | CAS 号：6870-67-3 |
| Jacobine-N-氧化物（JbNO）（98.0%） | ChemFaces | CFN00461 | CAS号：38710-25-7 |
| 甲醇（99.9%） | Tedia Company, Inc. | 21115100 | CAS 号：67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μ米，60 Å 每盒100克 |
| 野百合碱（Re）（98.0%） | BioCrick | 5281743 | CAS号：480-54-6 |
| 野百合碱-N-氧化物（ReNO）（98.0%） | BioCrick | 5281734 | CAS 号：15503-86-3 |
| 千里光宁（Sc）（98.0%） | BioCrick | 5280906 | CAS 号：130-01-8 |
| 千里光宁碱-N-氧化物（ScNO）（98.0%） | BioCrick | 5380876 | CAS 号：13268-67-2 |
| 千里光叶碱 N-氧化物 (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS号：38710-26-8 |
| 千里光菲林碱（Sp）（98.0%） | BioCrick | 5281750 | CAS 号：480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS号：2318-18-5 |
| SPE PCX | 安捷伦科技 | 12108206 | 阳离子混合模式，6 mL |
| 硫酸（97%） | 无锡展旺化学试剂有限公司 | 1003019 | CAS 号：7664-93-9 |
| 柠檬酸三钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 20121009 | CAS号：6132-04-3 |
| 超声波清洗机 | Supmile | KQ-600B | 内槽尺寸：500 × 300 × 150 毫米；容量：22.5 升 |
| UPLC-xevoTQMS | 沃特斯 | ZPLYY-003 | 三重四级杆四段杆质量分析仪，Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC 液相系统 |
| 水浴恒温振荡器 | 国语仪器 | SHY-2AHS | 振荡时间： 60-300 次/分钟，恒温范围：室温至 100 °C |
参考文献
- Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498(2019).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in fo....
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