腺相关病毒肽展示文库的构建，以及通过条形码标记具有新特性的候选病毒，用于下一代腺相关病毒的创制与后续验证。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
源自腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）的基因递送载体是治疗遗传性疾病最有前景的工具之一，已有多个AAV基因疗法获得批准，并展现出令人鼓舞的临床数据。AAV载体取得成功的主要原因有两个：（i）先前已分离出多种具有不同特性的天然病毒血清型；（ii）随后建立了高效的分子工程技术，可用于高通量地对这些载体进行改造和再利用。近年来，通过在DNA和RNA水平对选定的AAV衣壳进行条形码标记的新策略进一步提升了这些技术的潜力，使得在单个动物体内即可对所有主要器官和细胞类型中的衣壳进行全面且并行的体内分层分析。本文介绍了一套涵盖这些互补途径的基本流程，以AAV肽展示技术为代表，体现当前可用的多种衣壳工程化技术。首先，我们描述了构建AAV肽展示文库的关键步骤，用于体内筛选具有理想特性的候选衣壳；随后演示如何对最具潜力的衣壳变体进行条形码标记，以便开展二次体内筛选。接下来，我们举例说明构建用于下一代测序（NGS）文库的方法，包括条形码扩增和接头连接；最后概述NGS数据分析过程中最关键的步骤。由于本文所报告的实验方案具有良好的通用性和可适配性，研究人员可便捷地利用这些方法，在其偏好的疾病模型中富集最优的AAV衣壳变体，用于基因治疗应用。
引言
基因转导治疗是指将遗传物质导入细胞，以修复、替换或改变细胞内的遗传物质，从而预防、治疗、治愈或改善疾病。基因转导包括体内（in vivo）和体外（ex vivo）两种方式，依赖于不同的递送系统，包括非病毒性和病毒性系统。病毒在自然界中已进化出高效转导靶细胞的能力，因此可被用作递送载体。在基因治疗所采用的多种病毒载体中，腺相关病毒（adeno-associated viruses）因其无致病性、安全性高、免疫原性低，以及最重要的是能够实现长期、非整合性的基因表达，近年来应用日益广泛1,2,3。过去十年中，AAV基因治疗已取得显著进展；已有三种疗法获得欧洲药品管理局和美国食品药品监督管理局批准用于人类3,4。目前还有多项临床试验正在进行中，旨在治疗血友病、肌肉疾病、心脏疾病和神经系统疾病等多种疾病，相关综述已有报道3。尽管该领域已发展数十年，但近年来基因治疗仍遭遇一系列挫折4，其中最严重的是临床试验中出现的死亡病例5，由于剂量限制性毒性问题，部分试验已被暂停，尤其针对肌肉等大体积组织或脑等难以到达的组织时更为突出6。
目前临床试验中使用的AAV载体大多属于天然血清型，仅有少数例外1。AAV工程化为开发具有更优器官或细胞特异性和更高效率的载体提供了可能。在过去二十年中，已有多种方法被成功应用，例如肽段展示、环区替换、衣壳DNA重排、易错PCR以及靶向设计，以生成具有不同特性的单个AAV变体或其文库 7。随后，这些文库会经历多轮定向进化，以筛选出具备理想特性的变体，相关过程已在其他综述中介绍1,3。在所有衣壳进化策略中，肽段展示AAV文库应用最为广泛，因其具有一些独特优势：易于构建，能够实现高多样性及高通量测序，从而便于追踪其进化过程。
首个成功的肽段插入型AAV文库的构建于近20年前被报道。在早期研究中，Perabo等人8 构建了一个修饰的 AAV2 衣壳文库，将一组随机生成的寡核苷酸插入质粒中，插入位置对应于衣壳蛋白 VP1 第 587 位氨基酸，位于衣壳表面三重轴突出区域。通过腺病毒共感染，对该 AAV 文库进行多轮筛选进化，最终获得的重定向变异体被证实能够转导对亲本 AAV2 不敏感的细胞系8随后，Müller 等人9 引入了用于文库构建的两步法系统，这是对原有方案的重要改进。首先，将质粒文库与腺病毒辅助质粒共同转染，以产生包含嵌合衣壳的腺相关病毒（AAV）文库。该AAV穿梭文库以较低的感染复数（MOI）感染细胞，旨在实现每个细胞仅导入一个病毒基因组。通过同时感染腺病毒，确保所产生的AAV具有匹配的基因组与衣壳。9大约十年后，Dalkara10 使用 体内 通过定向进化技术创建7m8变体。该变体含有10个氨基酸的插入序列（LALGETTRPA），其中三个氨基酸作为连接子，在玻璃体内注射后可高效靶向视网膜外层10这种经过工程改造的衣壳是一个极为成功的案例，因为迄今为止，它已成为少数几种成功进入临床应用的工程化衣壳之一11.
随着新一代测序（NGS）技术的引入，该领域迎来了第二次发展推动。Adachi 等人12 于 2014 年和 Marsic 等人13 于 2015 年发表的两篇论文展示了 NGS 在高精度追踪条形码标记的 AAV 衣壳文库分布方面的强大能力。几年后，条形码区域的 NGS 技术被应用于肽插入区域，以追踪衣壳的进化过程。Körbelin 等人14采用 NGS 指导的筛选方法，鉴定出一种靶向肺部的基于 AAV2 的衣壳。NGS 分析有助于计算三个评分指标：筛选轮次之间的富集评分、用于确定组织特异性的总体特异性评分，以及最终的综合评分14。同年，Gradinaru 实验室15发表了基于 Cre 重组酶的 AAV 靶向进化（CREATE）系统，该系统可实现细胞类型特异性筛选。在该系统中，衣壳文库携带一个 Cre 可逆开关，因为 polyA 信号序列两侧被两个 loxP 位点所包围。随后将 AAV 文库注射到表达 Cre 的小鼠体内，仅在 Cre+ 细胞中发生 polyA 信号的反转，从而提供反向 PCR 引物与衣壳基因内正向引物结合的模板。这种高度特异性的 PCR 回收技术使得 AAV-PHP.B 变体得以被鉴定，该变体能够穿越血脑屏障15。该系统进一步发展为 M-CREATE（多重化 CREATE）系统，其中将 NGS 与合成文库构建整合到同一工作流程中16。
Maguire 实验室开发的一种改进的基于 RNA 的 系统版本 iTransduce17，可在 DNA 水平上筛选出能够有效转导细胞并表达其基因组的衣壳。该肽展示文库的病毒基因组包含一个由组成型启动子驱动的 Cre 基因，以及一个由 p41 启动子驱动的衣壳基因。将该文库注射到携带 loxP-STOP-loxP-tdTomato 报告基因小鼠体内后，被 AAV 变体转导并表达病毒基因组（从而表达 Cre）的细胞会表达 tdTomato，结合细胞表面标志物即可进行分选和筛选17。类似地，Nonnenmacher 等人18 和 Tabebordbar 等人19 将衣壳基因文库置于组织特异性启动子的调控之下。在注射至不同动物模型后，利用病毒 RNA 分离出功能性衣壳变体。
另一种方法是使用条形码对衣壳文库进行标记。Björklund 实验室20 采用该方法对肽插入衣壳文库进行条形码标记，并开发了条形码理性腺相关病毒载体进化技术（barcoded rational AAV vector evolution, BRAVE）。在一个质粒中，将Rep2Cap表达盒克隆至反向末端重复序列（inverted terminal repeats, ITR）两侧、表达黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）且带有条形码标签的转基因元件的邻近位置。利用位于末端之间的loxP位点 帽 条形码的起始位置 体外 Cre 重组产生足够小的片段用于二代测序（NGS），从而实现肽段插入与唯一条形码（查找表，LUT）的关联。使用质粒文库进行 AAV 生产，并在 mRNA 中表达的条形码随后被筛选 体内 应用，再次使用NGS20当衣壳文库包含完整衣壳基因的变异体（即重排文库）时，需使用长读长测序技术。多个研究团队已采用条形码对这些多样性文库进行标记，从而实现更高测序深度的下一代测序（NGS）。Kay 实验室21 在衣壳随机重组文库的下游用条形码标记 帽 polyA 信号。首先，构建一个带有条形码的质粒文库，并将随机化衣壳基因文库克隆其中。随后，结合使用 MiSeq（短读长，测序深度较高）和 PacBio（长读长，测序深度较低）的下一代测序技术以及 Sanger 测序，以生成其 LUT212019年，Church实验室的Ogden及其同事22 利用在每个位点包含单点突变、插入和缺失的文库，阐明了AAV2衣壳在多种功能中的适应性，最终实现了机器引导的设计。文库构建过程中，合成了衣壳基因的较短片段，加上条形码标签后进行下一代测序，随后克隆至完整的衣壳基因中。利用NGS数据生成查找表（LUT）。随后仅通过条形码和短读长测序对文库进行筛选，从而实现更高的测序深度22.
条形码文库已占主导地位 用于在经过多轮衣壳文库筛选或独立于衣壳进化研究的情况下，对已知的天然及人工改造变体库进行筛选。此类文库的优势在于可同时筛选多种衣壳，同时减少实验动物使用数量，并最大限度降低个体间变异。首次将该技术引入腺相关病毒（AAV）领域的研究发表于近十年前。Nakai 实验室12 标记了191个AAV9 VP1蛋白第356至736位氨基酸的双丙氨酸突变体，并为每个突变体添加了一对12核苷酸的条形码。利用高通量测序（NGS）对文库进行筛选 体内 用于半乳糖结合及其他特性12Marsic 及其同事使用双条形码分析方法，进一步描绘了 AAV 变体在 1 年后的生物分布情况13一项近期在非人灵长类动物中开展的研究，通过不同递送途径比较了29种衣壳在中枢神经系统中的生物分布23我们实验室近期发表了一项针对183种变异体（包括天然型和工程化AAV）的条形码AAV文库筛选研究。该研究在DNA和RNA水平上的筛选鉴定出一种具有高度嗜肌性的AAV变异体24 在小鼠中以及其他在小鼠脑内表现出高细胞类型特异性的研究中25.
本文描述了本研究中使用的方法，并进一步扩展以涵盖腺相关病毒（AAV）肽展示文库的筛选。该方法包括构建AAV2肽展示文库、采用数字滴定PCR（dd-PCR）进行定量分析，以及最终基于Weinmann及其同事部分研究成果24建立的下一代测序（NGS）分析流程，用于分析AAV变异体。最后，还介绍了在同一研究中条形码标记的AAV文库的构建方法及所使用的NGS分析流程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. AAV2 随机 7 肽展示文库的制备
注意：制备 AAV2 随机肽展示文库时，需合成简并寡核苷酸作为单链 DNA，将其转化为双链 DNA，进行酶切消化，连接至受体质粒，然后电转化。
- 简并寡核苷酸的设计
- 订购简并寡核苷酸，并避免密码子偏好性。在寡核苷酸序列 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3' 中，X01 对应 20 个密码子，每个密码子编码 20 种氨基酸中的一种。W 可以是 A 或 T，产生 AGA 或 AGT 密码子，分别编码精氨酸（R）或丝氨酸（S）。
- 订购扩增引物：5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3'（详见 图 1）。该引物将产生如下蛋白插入序列：R/S G X7。理论多样性计算如下：1 × 2 × 207 = 2.56 × 109 个独特变体。
注意：应注意该多样性可能受限于转化效率。
- 第二链合成
- 用 TE 缓冲液将两条寡核苷酸（简并寡核苷酸和扩增引物）重悬至终浓度为 100 µM。
- 进行 PCR 反应时，配制 50 µL 反应体系，包含每种引物各 1 µL、缓冲液 10 µL、DMSO 1.5 µL、dNTPs（10 mM）0.5 µL、Hi-fidelity Hot Start Polymerase II 0.5 µL，以及无核酸酶水 35.5 µL。
- 将反应转移至热循环仪，先在 98 °C 预孵育 10 秒，随后进行三个循环：98 °C 变性 10 秒，59 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 10 秒，最后在 72 °C 延伸 5 分钟，并进行最终冷却。
- 使用核苷酸去除试剂盒纯化反应产物，并用 100 µL 无核酸酶水洗脱。
- 通过 Bioanalyzer 分析确认第二链合成效率（详见 图 2）。按照制造商说明，将 1 µL 反应产物加载至 DNA 1000 试剂盒的微流控芯片上，以分析双链插入片段的大小和纯度。该试剂盒适用于检测大小为 25–1,000 bp 的双链 DNA 片段的大小和浓度。
- 用 TE 缓冲液将两条寡核苷酸（简并寡核苷酸和扩增引物）重悬至终浓度为 100 µM。
- 插入片段与质粒载体的酶切
- 在终体积为 100 µL 的反应体系中，用 10 µL 10× 缓冲液和 5 µL BglI 酶对 85 µL 纯化后的插入片段进行酶切（详见 图 1）。在 37 °C 过夜孵育。使用核苷酸去除试剂盒纯化，用 50 µL 无核酸酶水洗脱，并在分光光度计中使用“Oligo DNA”模式定量。
- 在终体积为 200 µL 的反应体系中，用 20 µL 10× 缓冲液和 10 µL SfiI 酶对 10 µg 复制能力完整的 AAV 质粒（pRep2Cap2_PIS）26（ITR 包围的病毒基因组）进行酶切（详见 图 1）。在 50 °C 过夜孵育。使用凝胶提取试剂盒从 1% 琼脂糖凝胶中纯化载体，再使用 DNA 纯化试剂盒进行额外纯化步骤。在分光光度计中测定其浓度。
- 插入片段与载体的连接
- 在 20 µL 连接反应体系中，将 955 ng 质粒载体与 45 ng 插入片段、2 µL 缓冲液和 2 µL 连接酶混合。在 16 °C 过夜孵育，随后在 70 °C 加热 10 分钟以灭活连接酶。
- 转化、复杂度计算及质粒文库制备
- 按照制造商说明，使用 DNA 纯化试剂盒纯化反应产物。用起始体积约 80% 的无核酸酶水洗脱，并置于冰上保存，用于后续转化。
- 转化电感受态细胞：将一管电感受态细胞在冰上解冻 10 分钟。然后向 30 µL（一管）电感受态细胞中加入 1–2 µL 纯化后的连接反应产物，轻轻弹击混匀。接着，小心地将细胞/DNA 混合物移入预冷的 1 mm 电穿孔比色皿中，避免引入气泡。
- 使用以下参数进行电穿孔：1800 V、600 Ω、10 µF。电穿孔脉冲后 10 秒内，向比色皿中加入 970 µL 预热的复苏培养基（随电感受态细胞提供），并通过移液混匀。最后将细胞转移至微量离心管中，在 37 °C、250 rpm 条件下孵育 1 小时。为达到所需多样性，进行 10–100 次反应，孵育后将所有反应合并至同一管中。
- 通过将 10 µL 合并转化产物用 PBS 进行 10 倍、100 倍或 1000 倍稀释，取 100 µL 涂布于含适当抗生素（75 mg/mL 氨苄青霉素）的营养琼脂平板上，以计算多样性。
- 理论多样性计算如下：
理论最大多样性 = 10 × 稀释倍数 × 菌落数 × 电穿孔反应次数。
注意：为确认文库质量，需对至少 20 个克隆进行 Sanger 测序。大多数克隆应含有插入片段，且所有序列均应为唯一序列。 - 将剩余的合并转化产物接种至 400–1,000 mL 含适当抗生素的 LB 培养基中，在 37 °C、180 rpm 条件下过夜培养。
- 质粒文库的制备
- 从过夜培养物中制备甘油菌种（将等体积的细菌培养物与 50% 甘油溶液在无核酸酶水中混合，于 -80 °C 冻存），并使用质粒大提试剂盒纯化质粒文库。
- AAV 病毒文库的制备
- 按照先前描述的方法制备病毒文库27。使用转染试剂（如聚乙烯亚胺，PEI）将质粒文库（pRep2Cap2_PI，含肽插入片段）与腺病毒辅助质粒共同转染至 HEK293T 细胞中。
- 3 天后收集细胞，并进行三次冻融循环。使用氯化铯梯度超速离心纯化病毒裂解物，随后置换缓冲液至 PBS，最后浓缩病毒颗粒。
- 使用数字滴定 PCR（dd-PCR）对 AAV 载体进行滴定
- 将 2 µL AAV 载体原液用 198 µL 无核酸酶水逐级稀释，最终稀释倍数为 1:106。每次稀释后使用 200 µL 移液器充分混匀。设置一个无模板对照（NTC）作为阴性对照。
注意：可检测其他更低或更高稀释度（1:105–1:107）。 - 配制 20× 引物-探针混合液。在 1.5 mL 离心管中加入各 3.6 µL 的 100 µM 引物（正向和反向，Rep2 和 ITR）、各 1 µL 的 100 µM dd-PCR 探针（Rep2 和 ITR），以及 3.6 µL 无核酸酶水。
注意：AAV 文库使用靶向转基因的引物-探针组（Rep2）配合 FAM 标记探针检测，以及靶向 ITR 的引物-探针组配合 HEX 标记探针检测。 - 通过加入 5.5 µL 样品、1.1 µL 20× 引物-探针混合液、11 µL dd-PCR 探针预混液（不含 dUTP）和 4.4 µL 无核酸酶水，配制 22 µL PCR 反应体系。引物和探针的终浓度分别为 900 nM 和 250 nM。
- 使用液滴生成器生成液滴，将反应转移至 96 孔板，放入热循环仪，先在 94 °C 变性 10 分钟，随后进行 40 个循环（94 °C 30 秒，58 °C 1 分钟），然后在 98 °C 灭活聚合酶 10 分钟，并进行最终冷却。在液滴读取仪中读取反应结果并进行分析28。
- 使用分析软件打开保存的 dd-PCR 板文件。在 1D 振幅标签页（荧光振幅 vs. 事件数）中使用阈值工具，以 NTC 为参考，分离每个通道的阴性和阳性液滴，并将数据导出为 csv 文件。
- 计算载体浓度时，首先使用以下公式计算校正因子 CF：
CF 用于确定仅含转基因的阳性液滴 [Positives] 中同时含有转基因和 ITR 的液滴比例 [Ch1+ Ch2+]，以确保检测到功能性载体颗粒。最终载体浓度 c 可通过以下公式计算：
DF 为稀释倍数（1:105–1:107，由前述步骤确定）。每 20 µL/孔反应中的拷贝数对应于 5 µL 稀释样品。因子 1,000 用于将单位换算为 VG/mL（病毒基因组/mL）。示例性滴定结果见 表 1 和 图 3。
- 将 2 µL AAV 载体原液用 198 µL 无核酸酶水逐级稀释，最终稀释倍数为 1:106。每次稀释后使用 200 µL 移液器充分混匀。设置一个无模板对照（NTC）作为阴性对照。
- 通过 NGS 分析 AAV 病毒文库
- 使用高保真聚合酶试剂盒（2×；详见 图 4）配制 20 µL PCR 反应体系，扩增 96 核苷酸的肽插入片段。向反应中加入含 1 × 108 vg 的 AAV 原液 1 µL、100 µM 引物（NGS_forward 和 NGS_reverse）各 0.5 µL、酶混合液 10 µL，最后用无核酸酶水定容至 20 µL。
- 将反应转移至热循环仪，先在 98 °C 变性 3 分钟，随后进行 30–35 个循环（98 °C 10 秒，59 °C 10 秒，72 °C 20 秒），然后在 72 °C 延伸 5 分钟，并进行最终冷却。
- 使用 PCR 纯化试剂盒纯化样品。在分光光度计中测定浓度，并运行 3% 琼脂糖凝胶以验证纯度和片段大小。
- 根据制造商说明，使用低复杂度样本文库制备试剂盒处理 PCR 片段以构建 NGS 文库。使用 30 ng PCR 片段进行末端修复反应，随后进行接头连接和 10 个循环的 PCR 扩增。使用 PCR 纯化试剂盒纯化各反应产物。
- 使用 Bioanalyzer 和 DNA 试剂盒按照制造商说明对最终产物进行分析，以验证其大小和纯度。
- 使用荧光计定量扩增子并进行混合。再次使用荧光计对最终混合的 NGS 文库进行定量（按制造商说明），并在 Bioanalyzer 上验证其质量。
- 使用 75 个循环的高通量试剂盒以单端（SE）模式对 NGS 文库进行测序，读长为 84，Index 1 为 8。
注意：本文示例的测序工作在 EMBL Heidelberg 的 GeneCore 平台完成（http://www.genecore.embl.de/）。 - 使用 Python 3 和 biopython 分析 NGS 测序数据。相关文件可从 https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 获取（或 https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215）。NGS 分析分为两个步骤。
- 第一步，在序列文件中搜索满足特定条件的序列（如插入位点两侧存在识别序列）（详见 图 4，步骤 1.9.8.5）。此过程通过脚本（Script#1）和提供必要信息的配置文件完成。一旦识别出正确序列，程序将提取并存储至输出文件中，输出文件为与测序文件同名的 txt 文件。
- 第二步为输出文件分析。文库中的序列以六个核苷酸之一（AGWggc，W = A/T）起始，对应九氨基酸插入片段。基于该起始序列进行肽段翻译，生成包含肽变体（PVs）的输出文件。
- 准备两个文件夹：Script 和 Data。将测序产生的 gzip 压缩文件复制到 Data 文件夹中。将以下文件复制到 Script 文件夹中：Python 文件 Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py；Python 文件 Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py；配置文件 Barcode_Script_JoVE.conf；查找表（LUT）文件 Zuordnung.txt。
- 运行脚本前，编辑 Script 文件夹中的以下文件。打开 "Zuordnung.txt" 文件，在两列中以制表符分隔的方式输入 gzip 文件名（第一列）和期望的最终名称（第二列）。
注意：示例 txt 文件位于 GitHub 文件夹 "PV_analysis_script" 中。GitHub 文件夹中提供的文件已为上述文库的三个样本数据（xaa.txt.gz、xab.txt.gz 和 xac.txt.gz）分析做好准备，输出文件也一并提供。 - 修改配置文件 "Barcode_Script_JoVE.conf" 中的以下变量：
my_dir = "~/Data/"
filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
序列特异性变量：BCV_size = 27，BCVleft = TCCAGGGCCAG，BCVright = GCCCAGG，BCVloc = 30，BCVmargin = 8，BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC，BCVright_revcomp = CTGGCCC，BCVloc_revcomp = 41（详见 图 4）。 - 使用以下命令调用变体序列检测与提取：
>python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
注意：输出为包含提取的 DNA 序列及其读数的 txt 文件。文件头部包含统计信息（如总读数和提取读数），这些数据将传递至后续文件。这些 txt 数据作为 Script#2 的输入文件，用于 DNA 序列的翻译、排序和分析。 - 使用以下命令执行 PV 提取与分析：
>python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf - 分析 Script#2 的文本输出文件。Script#2 的输出文件名基于 "Zuordnung.txt" 中 LUT 的第二列，并根据分析类型添加扩展名。
注意：确保三个输出文件的前几行包含统计信息（“# of Valid PV reads”、“# of Invalid PV reads” 和 “# of unique PV reads”），第一列为输入 txt 文件中每个 DNA 序列的索引（Script#1 的输出），后续列为：(1) “…analyzed_all.csv”：“Sample:”（DNA 序列）、“#”（读数）、“Frw or Rev”（正向或反向读取）和 “PVs”（翻译后的肽序列）。无效序列在最后两列中显示为 “NA” 和 “not valid”。(2) “…analyzed_validSeq.csv”：与前一文件相同，但仅保留有效序列。(3) “…analyzed_PV.csv”：“PVs”（翻译后的肽序列）、“#”（读数）和 “count”（前一文件中正向和反向计数合并，计数为 1 或 2）。 - 根据用户需求使用可用软件可视化输出文件。
2. AAV2 随机 7 肽展示文库筛选
- 在完成定量和质量控制（第1节）后，使用AAV文库在选定的模型中进行定向进化，以迭代筛选具有理想特性的候选序列（见图5）16,18,21。
注意：随后将这些候选序列用于生成带条形码的文库，具体方法如下文第3节所述。
3. 条形码AAV衣壳文库的制备与分析
注意：在肽段展示筛选中鉴定出一组可能具有特异性和高效性的 AAV 衣壳后，需验证所鉴定肽段序列的功能性，并将其与一组常用或已有明确描述的参考 AAV 衣壳变体进行比较。为此，将衣壳序列插入不含 ITR 的 Rep/Cap 辅助质粒中。
- 条形码AAV文库的制备
- 使用三质粒系统，针对每种衣壳变异体进行重组腺相关病毒的生产，具体步骤如前所述24.
注意：为了区分不同的衣壳变异体，位于ITR侧翼的报告基因转录单元质粒在增强型黄色荧光蛋白（EYFP）与多聚腺苷酸信号（polyA）之间的3'非翻译区（3' UTR）包含一段长度为15个核苷酸的独特条形码（见 图6AEYFP的表达由强效的普遍性巨细胞病毒（CMV）启动子驱动，可提供足够的RNA转录水平。 - 设计长度为15个核苷酸的条形码，其中同聚物长度少于3个核苷酸，GC含量为 <65%29，且汉明距离大于四个核苷酸24.
- 分别制备每种衣壳，并与携带独特条形码的转基因质粒组合。通过这种方法，每种衣壳变体均被标记上独特的条形码，从而实现对其特异性追踪（参见 图6B).
- 使用三质粒系统，针对每种衣壳变异体进行重组腺相关病毒的生产，具体步骤如前所述24.
- 使用数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）对AAV载体进行滴度测定
- 按照第1.8节所述方法进行AAV滴度测定，将Rep2引物对替换为YFP引物对。
- 定量测定各个AAV的产量，并将每种产物取等量混合，以构建最终的条形码文库。
- 再次定量最终文库以检测最终浓度和质量（参见 图7).
- 条形码AAV文库 体内 应用
- 将条形码标记的AAV文库通过全身性途径应用于所选的模型系统（例如，在小鼠中进行全身性应用）24).
- 根据实验需要收集靶组织和非靶组织（即肝脏、肺、心脏、膈肌、平滑肌、十二指肠、胰腺、结肠、肱二头肌、卵巢、胃、内耳、肾脏、腹主动脉、胸主动脉、脑、棕色脂肪和白色脂肪以及脾脏）或细胞类型。将组织在 -80 °C 冷冻，提取 DNA/RNA，并按照下一节所述进行 NGS 定量分析。
- DNA/RNA 提取
- 使用DNA/RNA Mini Kit从目标组织中提取DNA和RNA。
- 取一小块目标组织（1 mm）3，约5 mg）置于2 mL反应管中。
- 加入350 µL裂解缓冲液（含1% β-巯基乙醇）和5 mm钢珠至组织中（含β-巯基乙醇的样品需在通风橱中操作）。
- 使用组织研磨器在40 Hz条件下匀浆组织45秒。
- 加入10 µL蛋白酶K（10 mg/mL），在55 °C、400 rpm振荡条件下孵育15分钟。
- 在 20,000 离心 x g 室温孵育3分钟，收集上清液，然后按照DNA/RNA试剂盒的制造商说明书进行操作。
- 将洗涤步骤分为两步，每步使用350 µL洗涤缓冲液。在这两次洗涤步骤之间，用无RNase的DNase I消化柱上的残留DNA。根据制造商说明书配制DNase I溶液，取80 µL加至柱上，在室温下孵育15分钟。
- 用无核酸酶的水从柱子上洗脱RNA/DNA。将分离得到的RNA在-80 °C保存，gDNA在-20 °C保存。
- cDNA合成
- 在逆转录反应前，将RNA样品再次进行15–30分钟的DNase I处理（以彻底去除RNA样品中残留的DNA污染）。向212 ng RNA中加入1 µL DNase I溶液、4 µL缓冲液（随试剂盒提供）以及无核酸酶水，补至终体积为40 µL。室温孵育30分钟，随后在70 °C加热失活10分钟。
- 使用150 ng RNA，按照试剂盒说明书合成cDNA。设置不含逆转录酶的对照反应，以确保样品中无污染性病毒DNA。将cDNA储存于-20 °C。
注意：最佳逆转录反应所需的输入RNA量可能因组织类型及该组织中预期的转导效率不同而有所差异。
- 腺相关病毒文库分析（体内）通过高通量测序（NGS）
- 为了以较低成本实现高测序深度，进行下一代测序（NGS） 通过 Illumina测序，如前所述（第1.9节）。扩增条形码序列，然后将测序接头连接至扩增产物。
- 由于短读长以及扩增子两侧连接测序接头的缘故，在设计时需确认扩增子足够小，以确保条形码序列能包含在高通量测序读长范围内。针对病毒基因组及病毒转录本中条形码的测序，PCR扩增子设计为113 bp长（参见 图8).
- 使用BC-seq正向引物和BC-seq反向引物扩增带条形码的区域。配制以下PCR反应体系：0.5 µL高保真DNA聚合酶，10 µL 5x缓冲液，每种100 µM引物（BC-seq fw/BC-seq rv）各0.25 µL，1 µL 10 mM dNTPs。以25 ng cDNA或DNA/反应作为模板，用无核酸酶水调整终体积至50 µL。
- 在洁净的PCR操作台中配制PCR预混液，以避免污染。采用以下扩增程序：98 °C 预变性30 s，随后进行40个循环，每个循环为98 °C 变性10 s、72 °C 延伸20 s，最后72 °C 延伸5 min。
- 包括PCR对照以确认PCR预混液中无污染性DNA。对于cDNA样品，需设置不含逆转录酶的对照。最后，加入AAV输入文库样本。这些信息将用于生成分析中所用的Normalization_Variant.txt文件。
- 通过凝胶电泳验证每个样本PCR片段的大小，然后再进行PCR纯化。后者可使用市售的磁珠或基于离心柱的DNA纯化系统完成（参见 材料表).
- 根据制造商说明书，按照第1.9节所述方法，使用适用于低复杂度样本的文库构建系统制备NGS文库。
- 测定DNA浓度 通过 使用dsDNA HS试剂盒分析文库质量（如前文1.9.6节所述），随后进行文库混合。在荧光计上定量混合后的文库，并使用Bioanalyzer评估其质量。
- 按照第1.9.7节所述进行NGS测序。
- 通过qPCR定量测定转基因（病毒基因组）和看家基因的拷贝数，以评估DNA水平上混合文库在不同组织或器官间的分布情况。
- 按照以下方案配制30 µL qPCR反应体系，用于测定EYFP（转基因）和GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，看家基因）的拷贝数：
- 配制60倍浓度的EYFP引物/探针混合液（1.5 µM YFP_fw、1.5 µM YFP_rv和0.6 µM YFP_probe；见材料表）。使用GAPDH引物/探针混合液（见 材料表) 以确定看家基因的拷贝数。在冰上设置反应体系。
- 配制PCR预混液（15 µL，参见 材料表）并为所有样本和标准品加入 60× 引物/探针混合液（0.5 µL）（如需计算标准品的拷贝数，请使用以下链接：http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html）。在冰上配制反应体系。
- 将15.5 µL预混液转移至96孔板中，向相应孔中加入14.5 µL样本（总DNA浓度为75 ng）或标准品。用封口膜密封96孔板，涡旋混匀后短暂离心。
- 将每个样本的 10 µL 以复孔形式转移至 384 孔板中。用封板膜密封后，在 800 x g 4 °C下离心5分钟。
- 在PCR仪中孵育反应体系，初始温度为50 °C，持续2 min，随后在95 °C下初始激活10 min。进行40个循环，每个循环包括：95 °C变性15 s，60 °C退火/延伸1 min。24.
- 使用GAPDH拷贝数除以2，得到二倍体基因组数（dg）。然后，用EYFP拷贝数除以dg数，得到每个二倍体基因组的载体基因组数（vg/dg）。利用该数值生成用于生物信息学分析的Normalization_Organ.txt文件。
- 按照Weinmann等人的方法对NGS测序数据进行分析24，使用 Python3 中的自定义代码（https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022）。该工作流程包括基于侧翼序列、长度和位置检测条形码序列（Script#1_BarcodeDetection.py），以及分析条形码在各组织样本中的富集情况和分布（Script#2_BarcodeAnalysis.py）。
- 检测条形码并将其分配给AAV变异体。将测序数据作为归档的fastq文件放入一个目录中（例如，“Data_to_analyze”）。输入文库的测序数据文件也包含在该目录中，仅用于计算输入文库中衣壳的比例。
- 在执行脚本之前，创建两个以制表符分隔的文本文件：一个是衣壳变异体文件（参见示例文件“Variants.txt”），其中包含分配给AAV衣壳变异体名称的条形码序列；另一个是污染文件（参见“Contaminations.txt”），其中包含可能来源于污染的条形码序列（如实验室中其他可用的条形码，可能造成污染）。
- 最后，编辑配置文件“Barcode_Script.conf”，包含以下信息：测序数据所在文件夹的路径（例如，“Data_to_analyze”）、条形码侧翼区域的序列、其位置以及条形码检测的窗口大小（类似于1.9.8.5，请参见 图8).
- 使用以下命令调用条形码检测功能，并提供 Script#1_BarcodeDetection.py 和配置文件的路径：
>python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
注意：Script#1_BarcodeDetection.py 执行后的输出结果为文本文件，其中包含每个衣壳变异体的读段数以及从原始数据中回收的总读段数。 - 通过运行 Script#2_BarcodeAnalysis.py 并结合以下 txt 文件，评估条形码标记的 AAV 衣壳在不同组织或器官中的分布情况：
- 在“Zuordnung.txt”文件中，将条形码检测运行所获得的每个txt文件的名称对应分配给相应的组织/器官名称：第一列为txt文件名称，第二列以制表符分隔的对应组织/器官名称。
注意：示例请参见“示例”文件夹（https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022）。需要注意的是，组织/器官名称可包含用于定义cDNA或gDNA检测及生物学重复编号的字符（如M1、M2等）。 - 创建一个名为“organs.txt”的文本文件，其中包含靶器官和非靶器官的名称列表，这些名称需与赋值文件“Zuordnung.txt”中给出的名称相对应（参见“Example”文件夹：https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022）。
- 创建制表符分隔的文本文件“Normalization_Organ.txt”和“Normalization_Variant.txt”，其中包含所有衣壳变异体及所有器官/组织的归一化值。在“Normalization_Organ.txt”文件的第一列中，填写每个器官的名称（与分配文件“Zuordnung.txt”中的命名一致），第二列填写在第3.6.11节中生成的相应组织的归一化值。
- 在“Normalization_Variant.txt”文件的第一列中填入衣壳名称列表，第二列中填入混合文库中每种衣壳读数计数的标准化值（标准化值可根据第一个脚本生成的输入文库的txt输出文件进行计算）。
- 编辑配置文件，指定上述所有附加文件的完整路径。执行 Script#2_BarcodeAnalysis.py，命令如下：
>python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
注意：条形码分析脚本会输出多个文件：包含基于前述多种归一化步骤所得不同组织中衣壳分布相对浓度（RC）值的文本文件，以及将文本文件数据整合为合并矩阵数据的电子表格文件。后者可用于聚类分析和可视化。 - 可视化数据并对矩阵数据进行聚类分析，以区分衣壳特性，并基于不同组织中的 RC 谱型评估其相似性。使用存储库中的附加脚本 PCA_heatmap_plot.R：
>Rscript --vanilla ~/PCA.R ~/relativeconcentration.xls
注意：该脚本以 relativeconcentration.xls 文件作为输入，生成层次聚类热图和主成分分析（PCA）图各一张。 - 如需修改图表（热图的坐标轴、PCA 的主成分）或 PNG 参数（颜色、大小、标签），请打开 R 脚本并按照注释部分提供的说明进行操作。
- 在“Zuordnung.txt”文件中，将条形码检测运行所获得的每个txt文件的名称对应分配给相应的组织/器官名称：第一列为txt文件名称，第二列以制表符分隔的对应组织/器官名称。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
AAV2 肽展示文库的构建。作为筛选工程化 AAV 的第一步，本文描述了质粒文库的构建过程。肽插入片段通过使用简并引物进行扩增获得。将密码子组合从 64 种减少至 20 种，其优势在于可消除终止密码子，并通过降低 DNA 水平的文库多样性（而非蛋白质水平）来简化下一代测序（NGS）分析。寡核苷酸插入片段以单链 DNA 形式购买（图 1），随后通过 PCR 反应转化为双链 DNA。该反应的质量通过生物分析仪进行检测。如 图 2 所示，与 10 或 30 个循环相比，3 个循环产生的条带更强。随后使用 BglI 酶切插入片段，产生三核苷酸突出末端。双链插入片段突出序列旁的核苷酸可以是 A 或 T（W 为 A 或 T 的简并碱基代码），该核苷酸位于编码精氨酸（R）或丝氨酸（S）的密码子第三位。载体（pRep2Cap2_PIS）在肽插入位点含有移码突变，导致插入片段缺失时在插入位点下游不远处形成终止密码子，从而阻止衣壳蛋白的表达。对该质粒进行 SfiI 酶切，可产生与肽编码寡核苷酸插入片段相匹...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案概述了用于肽段展示型AAV衣壳工程、条形码标记的AAV文库筛选，以及文库组成和衣壳性能生物信息学分析所需的各个步骤。本方案重点介绍有助于此类文库生物信息学分析的步骤，因为大多数病毒学实验室在编程技能方面落后于其分子生物学技术的熟练程度。这两类文库在文献中已有广泛描述，如引言部分所述，均可相对容易地重现。
首先，概述在 AAV2 可变区 VIII 的第 588 位设计肽段展示文库的方案。该设计（在先前发表的研究中称为 AAV2_Peptide(ii)26）以及所述的克隆方法，可根据近期发表文献中提供的信息26，轻松适配于其他血清型。克隆流程中的一个关键步骤是连接/转化效率（以约 1 × 108 个菌落为阈值）。建议增加一个仅含载体的连接反应作为对照，以帮助确定含有插入片段的细菌菌落比例，该比例应高于 80%。若效率低于预期，即含有插入片段的细菌菌落数量（按插入片段百分比计算）低于寡核苷酸插入片段的理论多样性，则会对低丰度变异体产生不利影响。多种优化措施包括延长消...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
D.G. 是 AaviGen GmbH 的联合创始人。D.G. 和 K.R. 是一项关于生成免疫逃逸型 AAV 衣壳变体的待审专利申请的发明人。其余作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
D.G. 深度感谢德国研究基金会（DFG）通过 DFG 协同研究中心 SFB1129（项目编号 240245660）和 TRR179（项目编号 272983813）提供的支持，以及德国感染研究中心（DZIF, BMBF；TTU-HIV 04.819）的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 扩增引物 | ELLA Biotech (德国慕尼黑) | - | 寡核苷酸插入片段的第二链合成 |
| Agilent DNA 1000 试剂 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | 5067-1504 | DNA片段验证 |
| Agilent 2100 生物分析系统 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | G2938C | DNA片段验证 |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (荷兰芬洛) | 80204 | DNA/RNA提取 |
| Agilent DNA 1000 试剂 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | 5067-1504 | NGS文库制备 |
| Agilent 2100 生物分析系统 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | G2938C | NGS文库制备 |
| BC-seq fw: | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS文库制备 |
| BC-seq rv: | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS文库制备 |
| β-巯基乙醇 | Millipore Sigma (美国马萨诸塞州伯灵顿) | 44-420-3250ML | DNA/RNA提取 |
| BglI | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | R0143 | 双链插入片段的消化 |
| C1000 Touch 热循环仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1851196 | dd-PCR热循环仪 |
| dNTPS | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | N0447S | NGS文库制备 |
| 探针用ddPCR预混液（不含dUTP） | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863024 | dd-PCR预混液 |
| 探针用液滴生成油 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863005 | dd-PCR液滴生成油 |
| QX100 / QX200 液滴生成仪用DG8卡盒 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1864008 | dd-PCR液滴生成卡盒 |
| DG8卡盒支架 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863051 | dd-PCR卡盒支架 |
| 液滴生成仪DG8密封垫 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863009 | dd-PCR卡盒盖 |
| ddPCR 96孔半裙边板 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 12001925 | dd-PCR 96孔板 |
| E.cloni 10G SUPREME 电转感受态细胞 | Lucigen (美国威斯康星州米德尔顿) | 60081-1 | 电转感受态细胞 |
| 电穿孔比色皿，1mm | Biozym Scientific (德国奥尔登多夫) | 748050 | 电穿孔 |
| GAPDH引物/探针混合物 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR引物 |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1652660 | 电穿孔 |
| 高容量cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | 4368814 | cDNA反转录 |
| ITR_fw | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR引物 |
| ITR_rv | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR引物 |
| ITR_probe | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR探针 |
| Illumina NextSeq 500 系统 | Illumina Inc (美国加利福尼亚州圣地亚哥) | SY-415-1001 | NGS文库测序 |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (瑞士巴塞尔) | KK2600 07958919001 | NGS样本制备 |
| MagnaBot 96 磁性分离装置 | Promega GmbH (美国威斯康星州麦迪逊) | V8151 | NGS文库样本制备 |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | ND-2000 | 双链插入片段的消化 |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (美国马萨诸塞州伯灵顿) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS引物 |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (美国马萨诸塞州伯灵顿) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS引物 |
| NextSeq 500/550 高输出试剂盒（75个循环） | Illumina Inc (美国加利福尼亚州圣地亚哥) | FC-404-2005 | NGS文库测序 |
| Ovation 低复杂度样本文库系统试剂盒 | NuGEN Technologies, Inc. (美国加利福尼亚州圣卡洛斯) | 9092-256 | NGS文库制备 |
| PX1 板封仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1814000 | dd-PCR板封仪 |
| 可穿刺铝箔热封膜 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1814040 | dd-PCR封口箔 |
| Phusion 高保真DNA聚合酶 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | F530S | 寡核苷酸插入片段的第二链合成 |
| PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量40,000） | Polysciences, Inc. (美国宾夕法尼亚州沃灵顿) | 24765-1G | AAV文库制备 |
| ProNex 尺寸选择性纯化系统 | Promega GmbH (美国威斯康星州麦迪逊) | NG2002 | NGS文库样本制备 |
| Phusion Hot Start II 聚合酶 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | F549L | NGS文库制备 |
| 蛋白酶K | Roche AG (瑞士巴塞尔) | 5963117103 | DNA/RNA提取 |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR载体。Cap2开放阅读框内的肽插入位点，由实验室制备/生产 | ||
| QX200 液滴生成仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1864002 | dd-PCR液滴生成仪 |
| QX200 液滴读取仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1864003 | dd-PCR液滴分析 |
| QIAquick 核苷酸去除试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 28306 | 寡核苷酸插入片段第二链合成后的纯化 |
| QIAquick 凝胶提取试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 28704 | 质粒载体纯化 |
| QIAGEN 质粒大提试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 12162 | 质粒文库DNA制备 |
| Qiaquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 28104 | NGS文库样本制备 |
| Qubit 荧光计 | Invitrogen (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | Q32857 | NGS文库制备 |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | Q32851 | NGS文库制备 |
| QuantiFast PCR 主混合液 | Qiagen (荷兰芬洛) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR引物 |
| rep_rv | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR引物 |
| rep_probe | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR探针 |
| 无RNase的DNase | Qiagen (荷兰芬洛) | 79254 | DNA/RNA提取 |
| SfiI | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | R0123 | 载体消化 |
| 5 mm钢珠 | Qiagen (荷兰芬洛) | 69989 | DNA/RNA提取 |
| TRIMER-寡核苷酸 | ELLA Biotech (德国慕尼黑) | - | 简并寡核苷酸 |
| T4连接酶 | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | M0202L | 质粒文库连接 |
| TissueLyserLT | Qiagen (荷兰芬洛) | 85600 | DNA/RNA提取 |
| YFP_fw | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR引物 |
| YFP_rv | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR引物 |
| YFP_probe | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR探针 |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (美国加利福尼亚州尔湾) | D4013 | 载体和连接产物纯化 |
参考文献
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
- Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
- Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).
- Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756(2022).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
- Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
- Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075(2014).
- Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).
- Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
- Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
- Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
- Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
- Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
- Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
- Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
- Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
- Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
- Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).
- Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
- Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
- Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).
- Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
- Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).
- Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
- Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
- Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
- Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
- Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).
- Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
- Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).
- Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
- Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
- Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
