腺相关病毒肽展示文库的构建，以及通过条形码标记具有新特性的候选病毒，用于下一代腺相关病毒的创制与后续验证。
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本文内容
摘要
摘要
源自腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）的基因递送载体是治疗遗传性疾病最有前景的工具之一，已有多个AAV基因疗法获得批准，并展现出令人鼓舞的临床数据。AAV载体取得成功的主要原因有两个：（i）先前已分离出多种具有不同特性的天然病毒血清型；（ii）随后建立了高效的分子工程技术，可用于高通量地对这些载体进行改造和再利用。近年来，通过在DNA和RNA水平对选定的AAV衣壳进行条形码标记的新策略进一步提升了这些技术的潜力，使得在单个动物体内即可对所有主要器官和细胞类型中的衣壳进行全面且并行的体内分层分析。本文介绍了一套涵盖这些互补途径的基本流程，以AAV肽展示技术为代表，体现当前可用的多种衣壳工程化技术。首先，我们描述了构建AAV肽展示文库的关键步骤，用于体内筛选具有理想特性的候选衣壳；随后演示如何对最具潜力的衣壳变体进行条形码标记，以便开展二次体内筛选。接下来，我们举例说明构建用于下一代测序（NGS）文库的方法，包括条形码扩增和接头连接；最后概述NGS数据分析过程中最关键的步骤。由于本文所报告的实验方案具有良好的通用性和可适配性，研究人员可便捷地利用这些方法，在其偏好的疾病模型中富集最优的AAV衣壳变体，用于基因治疗应用。
引言
基因转导治疗是指将遗传物质导入细胞，以修复、替换或改变细胞内的遗传物质，从而预防、治疗、治愈或改善疾病。基因转导包括体内（in vivo）和体外（ex vivo）两种方式，依赖于不同的递送系统，包括非病毒性和病毒性系统。病毒在自然界中已进化出高效转导靶细胞的能力，因此可被用作递送载体。在基因治疗所采用的多种病毒载体中，腺相关病毒（adeno-associated viruses）因其无致病性、安全性高、免疫原性低，以及最重要的是能够实现长期、非整合性的基因表达，近年来应用日益广泛1,2,3。过去十年中，AAV基因治疗已取得显著进展；已有三种疗法获得欧洲药品管理局和美国食品药品监督管理局批准用于人类3,4。目前还有多项临床试验正在进行中，旨在治疗血友病、肌肉疾病、心脏疾病和神经系统疾病等多种疾病，相关综述已有报道3。尽管该领域已发展数十年，但近年来基因治疗仍遭遇一系列挫折4，其中最严重的是临床试验中出现的死亡病例5，由于剂量限制性毒性问题，部分试验已被暂停....
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方案
1. AAV2 随机 7 肽展示文库的制备
注意：制备 AAV2 随机肽展示文库时，需合成简并寡核苷酸作为单链 DNA，将其转化为双链 DNA，进行酶切消化，连接至受体质粒，然后电转化。
- 简并寡核苷酸的设计
- 订购简并寡核苷酸，并避免密码子偏好性。在寡核苷酸序列 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3' 中，X01 对应 20 个密码子，每个密码子编码 20 种氨基酸中的一种。W 可以是 A 或 T，产生 AGA 或 AGT 密码子，分别编码精氨酸（R）或丝氨酸（S）。
- 订购扩增引物：5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3'（详见 图 1）。该引物将产生如下蛋白插入序列：R/S G X7。理论多样性计算如下：1 × 2 × 207 = 2.56 × 109 个独特变体。
注意：应注意该多样性可能受限于转化效率。
- 第二链合成
- 用 TE 缓冲液将两条寡核苷酸（简并寡核苷酸和扩增引物）重悬至终浓度为 100 µM。
- 进行 PCR 反应时，配制 50 µL 反应....
- 用 TE 缓冲液将两条寡核苷酸（简并寡核苷酸和扩增引物）重悬至终浓度为 100 µM。
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结果
AAV2 肽展示文库的构建。作为筛选工程化 AAV 的第一步，本文描述了质粒文库的构建过程。肽插入片段通过使用简并引物进行扩增获得。将密码子组合从 64 种减少至 20 种，其优势在于可消除终止密码子，并通过降低 DNA 水平的文库多样性（而非蛋白质水平）来简化下一代测序（NGS）分析。寡核苷酸插入片段以单链 DNA 形式购买（图 1），随后通过 PCR 反应转化为双链 DNA。该反应的质量通过生物分析仪进行检测。如 图 2 所示，与 10 或 30 个循环相比，3 个循环产生的条带更强。随后使用 BglI 酶切插入片段，产生三核苷酸突出末端。双链插入片段突出序列旁的核苷酸可以是 A 或 T（W 为 A 或 T 的简并碱基代码），该核苷酸位于编码精氨酸（R）或丝氨酸（S）的密码子第三位。载体（pRep2Cap2_PIS）在肽插入位点含有移码突变，导致插入片段缺失时在插入位点下游不远处形成终止密码子，从而阻止衣壳蛋白的表达。对该质粒进行 SfiI 酶切，可产生与肽编码寡核苷酸插入片段相匹.......
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讨论
本方案概述了用于肽段展示型AAV衣壳工程、条形码标记的AAV文库筛选，以及文库组成和衣壳性能生物信息学分析所需的各个步骤。本方案重点介绍有助于此类文库生物信息学分析的步骤，因为大多数病毒学实验室在编程技能方面落后于其分子生物学技术的熟练程度。这两类文库在文献中已有广泛描述，如引言部分所述，均可相对容易地重现。
首先，概述在 AAV2 可变区 VIII 的第 588 位设计肽段展示文库的方案。该设计（在先前发表的研究中称为 AAV2_Peptide(ii)26）以及所述的克隆方法，可根据近期发表文献中提供的信息26，轻松适配于其他血清型。克隆流程中的一个关键步骤是连接/转化效率（以约 1 × 108 个菌落为阈值）。建议增加一个仅含载体的连接反应作为对照，以帮助确定含有插入片段的细菌菌落比例，该比例应高于 80%。若效率低于预期，即含有插入片段的细菌菌落数量（按插入片段百分比计算）低于寡核苷酸插入片段的理论多样性，则会对低丰度变异体产生不利影响。多种优化措施包括延长消.......
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披露
D.G. 是 AaviGen GmbH 的联合创始人。D.G. 和 K.R. 是一项关于生成免疫逃逸型 AAV 衣壳变体的待审专利申请的发明人。其余作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
D.G. 深度感谢德国研究基金会（DFG）通过 DFG 协同研究中心 SFB1129（项目编号 240245660）和 TRR179（项目编号 272983813）提供的支持，以及德国感染研究中心（DZIF, BMBF；TTU-HIV 04.819）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 扩增引物 | ELLA Biotech (德国慕尼黑) | - | 寡核苷酸插入片段的第二链合成 |
| Agilent DNA 1000 试剂 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | 5067-1504 | DNA片段验证 |
| Agilent 2100 生物分析系统 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | G2938C | DNA片段验证 |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (荷兰芬洛) | 80204 | DNA/RNA提取 |
| Agilent DNA 1000 试剂 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | 5067-1504 | NGS文库制备 |
| Agilent 2100 生物分析系统 | Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉) | G2938C | NGS文库制备 |
| BC-seq fw: | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS文库制备 |
| BC-seq rv: | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS文库制备 |
| β-巯基乙醇 | Millipore Sigma (美国马萨诸塞州伯灵顿) | 44-420-3250ML | DNA/RNA提取 |
| BglI | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | R0143 | 双链插入片段的消化 |
| C1000 Touch 热循环仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1851196 | dd-PCR热循环仪 |
| dNTPS | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | N0447S | NGS文库制备 |
| 探针用ddPCR预混液（不含dUTP） | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863024 | dd-PCR预混液 |
| 探针用液滴生成油 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863005 | dd-PCR液滴生成油 |
| QX100 / QX200 液滴生成仪用DG8卡盒 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1864008 | dd-PCR液滴生成卡盒 |
| DG8卡盒支架 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863051 | dd-PCR卡盒支架 |
| 液滴生成仪DG8密封垫 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1863009 | dd-PCR卡盒盖 |
| ddPCR 96孔半裙边板 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 12001925 | dd-PCR 96孔板 |
| E.cloni 10G SUPREME 电转感受态细胞 | Lucigen (美国威斯康星州米德尔顿) | 60081-1 | 电转感受态细胞 |
| 电穿孔比色皿，1mm | Biozym Scientific (德国奥尔登多夫) | 748050 | 电穿孔 |
| GAPDH引物/探针混合物 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR引物 |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1652660 | 电穿孔 |
| 高容量cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | 4368814 | cDNA反转录 |
| ITR_fw | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR引物 |
| ITR_rv | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR引物 |
| ITR_probe | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR探针 |
| Illumina NextSeq 500 系统 | Illumina Inc (美国加利福尼亚州圣地亚哥) | SY-415-1001 | NGS文库测序 |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (瑞士巴塞尔) | KK2600 07958919001 | NGS样本制备 |
| MagnaBot 96 磁性分离装置 | Promega GmbH (美国威斯康星州麦迪逊) | V8151 | NGS文库样本制备 |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | ND-2000 | 双链插入片段的消化 |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (美国马萨诸塞州伯灵顿) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS引物 |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (美国马萨诸塞州伯灵顿) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS引物 |
| NextSeq 500/550 高输出试剂盒（75个循环） | Illumina Inc (美国加利福尼亚州圣地亚哥) | FC-404-2005 | NGS文库测序 |
| Ovation 低复杂度样本文库系统试剂盒 | NuGEN Technologies, Inc. (美国加利福尼亚州圣卡洛斯) | 9092-256 | NGS文库制备 |
| PX1 板封仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1814000 | dd-PCR板封仪 |
| 可穿刺铝箔热封膜 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1814040 | dd-PCR封口箔 |
| Phusion 高保真DNA聚合酶 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | F530S | 寡核苷酸插入片段的第二链合成 |
| PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量40,000） | Polysciences, Inc. (美国宾夕法尼亚州沃灵顿) | 24765-1G | AAV文库制备 |
| ProNex 尺寸选择性纯化系统 | Promega GmbH (美国威斯康星州麦迪逊) | NG2002 | NGS文库样本制备 |
| Phusion Hot Start II 聚合酶 | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | F549L | NGS文库制备 |
| 蛋白酶K | Roche AG (瑞士巴塞尔) | 5963117103 | DNA/RNA提取 |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR载体。Cap2开放阅读框内的肽插入位点，由实验室制备/生产 | ||
| QX200 液滴生成仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1864002 | dd-PCR液滴生成仪 |
| QX200 液滴读取仪 | Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士) | 1864003 | dd-PCR液滴分析 |
| QIAquick 核苷酸去除试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 28306 | 寡核苷酸插入片段第二链合成后的纯化 |
| QIAquick 凝胶提取试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 28704 | 质粒载体纯化 |
| QIAGEN 质粒大提试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 12162 | 质粒文库DNA制备 |
| Qiaquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen (荷兰芬洛) | 28104 | NGS文库样本制备 |
| Qubit 荧光计 | Invitrogen (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | Q32857 | NGS文库制备 |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | Q32851 | NGS文库制备 |
| QuantiFast PCR 主混合液 | Qiagen (荷兰芬洛) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR引物 |
| rep_rv | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR引物 |
| rep_probe | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR探针 |
| 无RNase的DNase | Qiagen (荷兰芬洛) | 79254 | DNA/RNA提取 |
| SfiI | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | R0123 | 载体消化 |
| 5 mm钢珠 | Qiagen (荷兰芬洛) | 69989 | DNA/RNA提取 |
| TRIMER-寡核苷酸 | ELLA Biotech (德国慕尼黑) | - | 简并寡核苷酸 |
| T4连接酶 | New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇) | M0202L | 质粒文库连接 |
| TissueLyserLT | Qiagen (荷兰芬洛) | 85600 | DNA/RNA提取 |
| YFP_fw | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR引物 |
| YFP_rv | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR引物 |
| YFP_probe | IDT (美国加利福尼亚州圣何塞) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR探针 |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (美国加利福尼亚州尔湾) | D4013 | 载体和连接产物纯化 |
参考文献
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene ....
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