本方案提供了生成三维工程化心肌和骨骼肌组织的方法，并描述了其在临床前药物筛选中的应用。所述方法利用磁感应系统，可同时平行评估24个组织。
本文内容
摘要
摘要
准确模拟健康与疾病状态 体外 对于开发新的治疗策略和治疗方法至关重要。对于心脏和骨骼肌疾病而言，收缩力和动力学是评估肌肉功能的关键指标。近年来，利用诱导性多能干细胞构建工程化肌肉组织（EMTs）的新方法和改进方法已取得进展 体外 疾病模型在收缩性组织研究中更为可靠；然而，从悬浮细胞培养物中可重复地构建组织并测量其收缩力仍具挑战性。此类技术常伴随较高的失败率，且需要复杂的仪器设备和定制的数据分析流程。一种新型平台及装置结合了三维工程化微组织（3D EMTs）与一种无标记、高通量且易于自动化的收缩力检测方法，克服了上述诸多障碍。该平台可便捷、可重复地利用几乎任何细胞来源制备3D EMTs，随后对组织收缩力进行测量 通过 一种可同时测量24个组织样本且无需复杂软件分析流程的仪器。该仪器能够可靠地检测微牛顿级别的力变化，适用于药物或治疗手段对收缩功能影响的剂量依赖性化合物筛选。利用该设备构建的工程化组织具有完全功能，经电刺激后可产生单次收缩和强直性收缩，并可在培养条件下进行数周乃至数月的纵向分析。本文展示了心脏肌肉工程化微组织（EMTs）在急性和慢性暴露于已知毒性物质下的实验数据，其中包括一种因患者死亡而被撤出临床试验的药物（BMS-986094），其致死原因在于未预料到的心脏毒性。同时展示了骨骼肌工程化组织在肌球蛋白抑制剂处理后功能发生改变的结果。该平台使研究人员能够将复杂且信息丰富的生物工程模型系统整合至药物发现工作流程中，且无需额外的复杂培训或专业技术。
引言
诱导性多能干细胞（iPSC）模型在治疗药物发现与开发的临床前研究流程中，以及基础生物学研究和疾病建模中正日益发挥关键作用1,2,3,4,5。由iPSC衍生的心肌和骨骼肌等收缩性组织具有巨大潜力，可提高人类体外（in vitro）研究的预测能力，因为对肌肉收缩力和动力学的直接评估是研究整体组织功能的定量指标4,6,7,8。通常，收缩力的测量可通过光学追踪基底弯曲间接获得9,10，或通过将细胞/组织连接至力传感器直接测量4,11,12。尽管这些方法准确，但本质上通量较低，且通常需要经验丰富的操作人员进行数据采集与分析。
先前的研究表明，磁场感知能够绕过这些障碍，为同时评估多个组织构建物中工程化肌肉功能提供了一种替代方法13Mantarray（工程化组织阵列磁测量分析仪）3D收缩力平台基于该技术，采用一种能够以高通量筛选方式检测工程化肌肉组织收缩力的装置，结合了3D细胞模型的复杂性优势14该平台能够在标准细胞培养孵育箱内或外实现无标记、定量、实时监测心肌和骨骼肌组织的收缩功能，无需依赖基于光学的收缩成像与分析。该技术有助于直接比较健康与病变细胞系，并可测量药物对收缩性组织的作用，从而建立可量化的 体外新药及现有治疗性化合物的安全性和有效性数据。
利用Mantarray耗材24孔浇铸板，可在两个支点之间以高度可重复的方式制备工程化3D肌肉组织（图1）。其中一个支点为刚性支点，另一个支点为柔性支点，内含一个小磁铁。当组织构建物收缩时，会带动柔性支点及其嵌入的磁铁发生位移。将EMT板置于仪器中，通过位于板托下方电路板上的一组磁传感器，经由磁感应方式测量支点的位移。测得的磁场变化通过数学算法转换为绝对收缩力。该仪器采用快速数据采样率，能够获取被检测细胞类型功能能力和成熟度的详细信息，包括收缩频率、速度和衰减时间。这些功能测量可通过磁感应平台同时在全部24个孔中进行，也可使用传统的光学方法逐孔依次单独完成。
本研究描述了一种在基于纤维蛋白的水凝胶中构建三维骨骼肌和心肌微组织的高度可重复的方法。在短暂的80分钟反应过程中，凝血酶催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而为肌肉细胞在悬浮培养中发育提供支架15。基质中的间质细胞有助于重塑细胞外基质，随着肌肉细胞在水凝胶内形成合胞体，组织逐渐具备收缩能力。通过磁感应方法在化合物处理前后分析了这些组织的收缩性，验证了该技术在剂量-反应药物研究中的适用性。实验所用来自健康供体活检的原代人成肌细胞通过商业途径获得，并按照供应商提供的方案进行二维培养。使用骨骼肌生长培养基将细胞扩增三代，以获得足够数量的细胞用于构建三维组织。间质细胞和由人诱导多能干细胞（hiPSC）分化而来的心肌细胞按照供应商方案培养3天，以从冻存状态中恢复，随后将其接种形成组织。文中提供了代表性结果，展示了利用磁感应平台可获取的数据类型。同时，也讨论了采用这些方法构建工程化组织过程中常见的潜在问题。
方案
1. 细胞培养方案
- 原代人成肌细胞培养
- 在冰上，用8 mL DMEM/F12培养基将细胞外基质（ECM）按1:100比例稀释。
- 向一个T175培养瓶中加入8 mL ECM溶液，在接种细胞前于37 °C孵育至少1小时，但不超过24小时。确保ECM溶液完全覆盖瓶底。
- 将5 mL骨骼肌生长培养基分装至一个15 mL锥形管中。
- 将一管冷冻细胞（5.0 × 105个成肌细胞）在37 °C水浴中解冻2分钟，或直至冰晶刚好融化。用70%乙醇喷洒管壁，并转移至生物安全柜（BSC）中。
- 使用P1000移液器将细胞转移至预分装的培养基中。不要吹打混匀。以300 × g离心3分钟。
- 吸除上清液，使用P1000移液器加入1 mL生长培养基重悬细胞，获得单细胞悬液。
- 用15 mL DPBS洗涤ECM包被的培养瓶，吸除DPBS后，向瓶中加入30 mL生长培养基。
- 向细胞中加入4 mL生长培养基，混匀后将细胞悬液接种至T-175培养瓶中。确保总体积为35 mL。轻轻左右滑动培养瓶5–6次，再前后滑动5–6次，以确保细胞在瓶表面均匀分布。
- 将T-175培养瓶置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养3天，或直至细胞融合度不超过70%，然后进行传代。
- 原代人成肌细胞传代
- 在冰上，用30 mL DMEM/F12培养基将ECM按1:100比例稀释。
- 向三个T225培养瓶中各加入10 mL ECM溶液，在接种细胞前于37 °C孵育至少1小时，但不超过24小时。确保ECM溶液完全覆盖瓶底。
- 用15 mL DPBS洗涤细胞，吸除DPBS后，根据供应商说明书加入消化试剂。
- 待细胞脱落后，根据供应商说明书终止反应，并将细胞收集至锥形管中。以300 × g离心3分钟。
- 吸除上清液，使用P1000移液器加入1 mL生长培养基重悬细胞，获得单细胞悬液。
- 用15 mL DPBS洗涤ECM包被的培养瓶，吸除DPBS后，向每个T225培养瓶中加入40 mL生长培养基。
- 向细胞悬液中加入14 mL生长培养基，混匀后将5 mL细胞悬液接种至每个T225培养瓶中。确保每瓶总体积为45 mL。轻轻左右滑动培养瓶5–6次，再前后滑动5–6次，以确保细胞均匀分布。
- 将培养瓶置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。
- 培养2–3天，或直至细胞融合度不超过70%，然后进行传代。每次传代按1:3或1:4比例传代，接种密度为3 × 103至1 × 104个细胞/cm2。
- hiPSC来源的心肌细胞培养
- 在冰上，用12 mL DMEM/F12培养基将ECM按1:60比例稀释。
- 向两个6孔板的每孔中加入1 mL ECM溶液，在接种细胞前于37 °C孵育至少1小时，但不超过24小时。
- 将一管冷冻心肌细胞在37 °C水浴中解冻2分钟，或直至冰晶刚好融化。
- 用70%乙醇喷洒管壁，并转移至生物安全柜（BSC）中。
- 使用P1000移液器将解冻后的细胞转移至一个50 mL锥形管中。
- 用1 mL室温（RT）铺板培养基冲洗空的冻存管，以回收残留细胞。
- 在90秒内，使用移液器将1 mL冲洗液缓慢逐滴加入（每5秒一滴）至含细胞的锥形管中。在此过程中持续轻柔旋转管子，以混合细胞。
- 使用10 mL移液管缓慢向50 mL锥形管中加入8 mL铺板培养基。
- 加完所有培养基后，轻柔吹打3次以充分混匀细胞。使用血细胞计数板和台盼蓝进行细胞计数。
- 将细胞在50 mL锥形管中以300 × g离心3分钟。
- 细胞沉淀形成后，吸除上清液。
- 使用P1000移液器向管中加入1 mL铺板培养基，通过缓慢吹打3–5次轻轻打散细胞沉淀。再用额外的铺板培养基重悬细胞。
- 在2 mL铺板培养基中，每孔接种2–4 × 106个细胞至6孔板。
- 用DPBS（2 mL/孔）洗涤ECM包被的6孔板。
- 每孔加入2 mL细胞悬液。轻轻左右移动培养板5–6次，再前后移动5–6次，以确保细胞在孔表面均匀分布。
- 将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。
- 对所有待解冻的细胞管重复步骤1.3.3–1.3.16。
- 铺板后次日更换为3–5 mL维持培养基（根据细胞系和密度调整），之后每隔一天换液一次。培养3–4天后用于构建三维组织。
- 基质细胞培养
- 向一个T175培养瓶中加入30 mL ECM溶液，在接种细胞前于37 °C孵育至少1小时，但不超过24小时。
- 将5 mL基质细胞培养基分装至一个15 mL锥形管中。
- 将一管冷冻基质细胞在37 °C水浴中解冻2分钟，或直至冰晶刚好融化。
- 用70%乙醇喷洒管壁，并转移至生物安全柜（BSC）中。
- 使用P1000移液器缓慢向冻存管中的解冻细胞加入1 mL基质细胞培养基。
- 将细胞悬液从冻存管转移至锥形管中剩余的解冻培养基中。使用5 mL移液管混匀细胞，吹打3次。
- 使用血细胞计数板和台盼蓝进行细胞计数。无需离心细胞。
- 用15 mL DPBS洗涤ECM包被的T175培养瓶。
- 以3–4 × 103个细胞/cm2的密度将基质细胞接种至培养瓶中。轻轻左右滑动培养瓶5–6次，再前后滑动5–6次，以确保细胞在瓶表面均匀分布。
- 次日更换为45 mL预温的基质细胞培养基。培养3–4天后用于构建三维组织。
2. 材料准备
- 纤维蛋白原
注意：在重悬纤维蛋白原时，应尽量增大纤维蛋白原粉末铺展的表面积。本方案中，稀释液体积已根据所用容器的尺寸进行了优化，即仅使用足以覆盖培养皿底部的稀释液。例如，将0.5 g纤维蛋白原粉末铺展于100 mm培养皿中的10 mL PBS上，而不是使用50 mL离心管。增大稀释液的表面积可缩短纤维蛋白原重悬所需时间，并减少蛋白质结块的可能性。- 重悬
- 将10 mL PBS转移至100 mm细胞培养皿中，并在细胞培养孵育箱中预热至37 °C。
- 将0.5 g纤维蛋白原粉末均匀铺展于温热的PBS整个液面上，保持37 °C直至纤维蛋白原完全溶解。此过程不应超过2小时。可轻轻晃动培养皿以促进溶解，但切勿剧烈震荡。
- 无菌过滤
- 待粉末完全溶解后，将溶液通过100 µm滤膜过滤，并收集至50 mL锥形离心管中，以去除任何凝胶状纤维蛋白原团块。
- 将过滤后的溶液倒入装有0.2 µm滤膜的10 mL注射器中，推动溶液通过滤膜，并收集至新的50 mL锥形离心管中。为完全灭菌10 mL溶液，可能需要更换滤膜多次。
- 将无菌纤维蛋白原按300 mL/份分装至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存。根据需要在冰上或4 °C解冻。避免反复冻融。
- 重悬
- 凝血酶
- 将6 mL PBS和4 mL diH2O直接加入一支凝血酶（1 KU）冻干粉瓶中，配制成100 U/mL的凝血酶储备液。
- 使用0.2 µm滤膜进行无菌过滤，分装后于-20 °C保存于1.5 mL塑料微量离心管中（因凝血酶易吸附于玻璃表面）。避免反复冻融。
- 聚乙烯亚胺溶液（PEI）
警告：PEI具有毒性。请按照制造商规定使用适当的个人防护装备。
注意：PEI以50% w/v溶液形式提供，黏度高，难以移液。建议使用10%储备液配制0.1%工作液，而非直接从50% w/v原液稀释。- 在50 mL锥形离心管中量取5 mL 50% w/v PEI溶液。
- 加入20 mL diH2O并混匀，得到10%储备液。该高浓度储备液不可进行无菌过滤。
- 为配制用于细胞培养的0.1%溶液，取5 mL 10%储备液加入495 mL diH2O中。使用500 mL滤器瓶进行无菌过滤，室温保存不超过1周。
- 戊二醛
警告：戊二醛具有毒性。请按照制造商规定使用适当的个人防护装备。- 戊二醛以25%溶液形式提供。配制0.01%溶液时，将40 µL戊二醛加入99.6 mL diH2O中。无菌过滤后于4 °C保存，保存时间不超过1周。
- 支架制备
- 将一次性组织铸造套件置于无菌超净台内。该套件包含一个盖子、一个可容纳24对支柱的支架（每对支柱对应24孔板的一个孔），以及一个特制的24孔板底座，其内含24个铸造孔。每个铸造孔底部设有凹槽，用于容纳细胞/水凝胶组分，并在水凝胶聚合过程中将其塑造成管状组织（图1B）。
- 在24孔板各孔中加入1.5 mL/孔的0.1% PEI溶液，将支柱放入孔中，使每对支柱的尖端浸没于溶液中。静置10分钟。PEI将在支柱表面沉积正电荷，使水凝胶中的蛋白质在组织铸造过程中牢固附着于支柱上。
- 在第二个24孔板各孔中加入2 mL/孔的无菌diH2O，将支柱转移至该板中。静置1分钟。
- 在第三个24孔板各孔中加入1.5 mL/孔的0.01%戊二醛（GA）溶液，再次转移支柱。静置30分钟。GA将固定PEI在支柱表面的正电荷。
- 当支柱在戊二醛中静置时，吸除diH2O孔中的液体，用2 mL/孔的无菌diH2O洗涤，吸除后重新加入2 mL/孔的无菌diH2O。也可使用新的24孔板代替清洗步骤。
- 30分钟后，将支柱转移至含2 mL/孔无菌diH2O的孔中。静置1分钟。
- 吸除diH2O，每孔再加入2 mL无菌diH2O。静置5分钟。
- 将支柱转移至另一24孔板中干燥（约15分钟）。
- 干燥后，重新组装铸造套件。用Parafilm密封盖子与板边缘，然后于4 °C保存，最长可保存72小时，之后进行细胞接种。更长时间的保存可能可行，但尚未经过测试。
3. 组织灌注造影方案
- 铸造板制备
- 将组织包埋盒在 4 °C 预冷。
- 将一桶冰转移至生物安全柜中。在冰上为每个待包被的孔配制50 µL凝血酶溶液（3 µL凝血酶母液 + 47 µL EMT培养基）。
注意：有关EMT培养基的详细信息，请参见步骤3.2.1。 - 从冰箱中取出预冷的制胶试剂盒，放入细胞培养操作台内的冰块或冷板上。将制胶板平放在冰上，然后将制胶板上的凝胶梳移至新的无菌24孔板中。
- 将50 µL凝血酶溶液加入预制冷的包被板的每个孔中。
- 重新组装试剂盒，并放回冰箱中冷藏，直至进行组织灌注时取出使用。在向孔中加入凝血酶后的3小时内完成组织灌注。
- 细胞制备
- 制备EMT基础培养基，经无菌过滤后置于冰上。
注意：如果细胞特异性包埋介质含有胎牛血清（FBS），请使用热灭活的FBS，因其可能与纤维蛋白原相互作用并导致过早聚合。- 制备心脏EMT培养基：加入500 mL RPMI培养基、10 mL B27和2.5 g氨基己酸。（可选）加入10 mM ROCK抑制剂（仅添加至用于组织包埋的EMT培养基中，而非全部500 mL培养基）。
- 制备骨骼 EMT 培养基：加入 50 mL F10 培养基，以及用于原代 EMT 的 0.25 g 氨基己酸（ACA）或用于 iPSC 来源 EMT 的 0.1 g ACA。
- 将细胞培养级解离试剂预热至 37 °C。同时将等体积的 EMT 培养基预热，用于稀释解离试剂。
注意：所使用的蛋白酶必须完全失活。有活性的蛋白酶将干扰三维组织的形成及贴壁后的过程。 - 洗涤细胞（图1A用 PBS 冲洗。6 孔板每孔使用 2 mL；100 mm 培养皿、T175 培养瓶和 T225 培养瓶分别使用 6 mL、15 mL 和 15 mL。
- 将预热的细胞培养级解离试剂加入培养容器中以消化细胞，于37 °C孵育5分钟，或直至细胞完全脱落。对于心肌细胞培养，使用10倍浓度的解离试剂；对于基质细胞和骨骼肌成肌细胞，使用1倍浓度的解离试剂。试剂用量如下：6孔板每孔1 mL，100 mm培养皿3 mL，T175培养瓶8 mL，T225培养瓶10 mL。
- 每隔 2-3 分钟通过轻敲培养板侧面检查培养情况。
- 待细胞脱落后，将其转移至50 mL锥形管中，并使用P1000移液器吹打，以确保获得单细胞悬液。
- 用额外的EMT培养基冲洗培养板或培养瓶，以收集残留的细胞，并将其加入锥形管中。对于6孔板，每孔使用1 mL EMT培养基；100 mm培养皿使用2 mL；T175培养瓶使用5 mL；T225培养瓶使用5 mL。
- 轻柔吹打细胞，以确保形成单细胞悬液。
- 加入EMT培养基以终止消化过程，然后取细胞悬液样品进行细胞计数。6孔板每孔使用1 mL，100 mm培养皿使用3 mL，T175培养瓶使用8 mL，T225培养瓶使用10 mL。
- 以 200 x g 离心悬浮液的同时，使用血细胞计数板和台盼蓝进行细胞计数，持续4分钟。
- 吸去上清液，用5 mL EMT基础培养基重悬细胞，以去除残留的解离试剂。
- 以 200 x g 离心细胞 g 孵育4分钟。吸除上清液，并将细胞悬液调整至适当密度。
- 通过在EMT培养基中添加10%–20%的ECM蛋白，提高三维骨骼肌EMT的存活时间与功能 关键词：三维骨骼肌EMT，ECM蛋白，培养基，存活时间，功能增强14,16.
- 源自种子干细胞的心肌细胞及其间质细胞，数量为 5 x 105 细胞和 7.5 x 104 每组织构建物的细胞数。分别以 7.5 × 10⁵ 个细胞接种骨骼肌成肌细胞。5 每组织构建物的细胞数
- 心脏组织
- 吸弃上清液，并将基质细胞重悬于密度为 2.5 x 106 每毫升 EMT 培养基中加入细胞悬液，并置于冰上。每次 EMT 反应使用 30 µL 该细胞悬液。
- 吸弃上清液，并将CMs重悬于密度为8.3 × 106 每毫升 EMT 培养基中加入细胞悬液，并置于冰上。每次 EMT 反应使用 60 µL 该细胞悬液。
- 骨骼肌组织
- 吸弃上清液，并将骨骼肌细胞重悬于密度为8.3 × 106 每毫升 EMT 培养基中加入细胞并置于冰上。每次 EMT 使用 90 µL 该悬液。
- 计算制备所需数量的组织所需的每种细胞悬液体积（例如，每个EMT需要60 µL制备好的CMs和30 µL制备好的基质细胞，或90 µL骨骼肌细胞）。
- 将计算好的细胞体积用移液器加入15 mL锥形管中。
- 向每份EMT细胞悬液中加入10 µL纤维蛋白原，并置于冰上保存。
- 每次EMT所需的总试剂和细胞体积：确保每个EMT含有90 µL细胞、10 µL纤维蛋白原和50 µL凝血酶溶液。
- 制备EMT基础培养基，经无菌过滤后置于冰上。
- 组织灌注铸型
- 将组织铸造试剂盒转移至细胞培养超净台中，打开盖子（含柔性与刚性微柱的后格栅应保留在铸造板上）； 图1B将带有柱状阵列的浇铸板平放在冰上。
- 将细胞/纤维蛋白原混合物混匀，并用P200移液器吸取100 µL。
- 向已加入50 µL凝血酶溶液的孔中加入100 µL混合液，上下吹打5次以充分混匀。移液时不要将移液器按至第二档，吹打完成后立即移除吸头，避免产生气泡。
- 在此阶段，直至柱状支架准备从铸造板上提起（步骤 3.3.10）之前，支架的任何移动都可能影响组织与支柱之间的长期附着。使用一只手的食指和拇指同时固定支架和铸造孔板，以避免支架发生任何移动。
- 使用新的P200枪头逐个组织重复操作，直至所有组织均完成包埋。每次包埋前，在15 mL锥形管中重新混匀细胞悬液，因为细胞沉降迅速。
- 小心地将接种好的试剂盒转移至培养箱中，确保不移动晶格。接种后若移动晶格，可能导致从包埋孔中转移组织的成功率降低。无论细胞类型如何，均在37 °C下孵育80分钟。此步骤将启动水凝胶的聚合，并使蛋白质附着于支柱上。
- 同时，准备一个新的24孔板，每孔加入2 mL用于心肌组织的EMT培养基。可根据需要在EMT培养基中添加10 mM ROCK抑制剂。将培养板置于37 °C孵育，以预热培养基。
- 为原代骨骼肌组织准备每孔2 mL含5 g/L氨基己酸（经0.2 mm滤膜无菌过滤）的生长培养基，或为iPSC来源的EMT准备每孔2 mL含2 g/L ACA的生长培养基。将培养板置于37 °C孵育以预热培养基。
- 孵育后，无论细胞类型如何，均需在制备孔边缘轻柔加入1 mL EMT培养基，并在37 °C下继续孵育10分钟。此步骤可使水凝胶脱离制备孔边缘，便于后续组织的转移。
- 10分钟后，小心抬起支柱网格，将组织从制备板转移至含有培养基的预置24孔板中（图1C将带有组织的培养板放回37 °C的细胞培养箱中。
- 维护
- 24小时后，将成形的组织转移至新的24孔板中，每孔加入2 mL EMT培养基（如之前含有ROCK抑制剂，则此时去除），于37 °C孵育。对于骨骼肌细胞，将生长培养基更换为分化培养基，以促进成肌细胞融合。
- 每2-3天将心脏组织转移至含有2 mL/孔EMT培养基的新孔中。
- 每隔2-3天，将骨骼肌组织转移至含有2 mL/孔分化培养基的新孔中，培养基中添加5 g/L氨基己酸（经0.2 mm滤膜无菌过滤）；对于iPSC来源的组织，使用2 g/L ACA。
- 为便于更换培养基，将含组织的支架转移至新的24孔板中，而非在原孔板内直接换液，以避免损伤三维组织。另准备一个含有EMT培养基的24孔板，将组织转移至新鲜培养基中。将装有旧培养基的孔板与正在培养的孔板一同保留，用于下一次换液时使用。在整个培养期间，将含组织的支架在两个孔板之间交替转移。或者，每次换液时均使用新的孔板。
- 测量EMT收缩程度 通过 偏转后光学追踪图1D）或磁感应硬件13,14心脏组织在培养3-4天后开始自发搏动。骨骼肌组织在培养7天后通常可在电场刺激下产生收缩。
结果
细胞被接种至双柱耗材板中的工程化肌肉组织中（图1成功的EMT将呈现均匀状态，且基质将在各支柱之间均匀分布（图 2A）。基质还应包裹住两根支柱，为组织提供等效的锚定点。采用该方法制备时，包埋失败的情况较为罕见，通常可通过肉眼检查明显识别。EMT 制备不成功的情况可能包括严重的失败，例如组织从支柱上脱落（图2B）到更细微的结构缺陷，例如气泡和与支柱连接不牢固（图2C,D）。存在轻微缺陷的组织可能仍然具有活性，但这些组织的数据应仔细检查，以确保其与未受损的工程化心肌组织（EMT）具有可比性。例如，EMT 内的气泡可能随着组织随时间压缩而被挤出，从而形成无收缩功能缺陷的完全功能性构建体。然而，这些组织必须进行个案评估，因为气泡的位置可能影响功能恢复。例如，在支柱处产生的气泡可能影响组织附着，进而阻碍组织长期固定于支柱上。
在培养的前24小时内，随着细胞重塑水凝胶内的基质，组织开始发生收缩（图3）。组织收缩是一个渐进的过程，通常在培养的前2至4周内持续进行。在技术重复和生物学重复之间，组织收缩的程度总体上具有一致性（图4）。随着组织在培养过程中逐渐成熟，不同细胞系对基质的收缩程度存在差异是正常现象。构建体中成肌细胞所占百分比会影响上皮-间质转化（EMT）收缩的速度和最终程度。无论是心肌还是骨骼肌细胞系，其总成肌细胞含量均应超过80%，以尽量减少不同工程化组织之间的差异。这一点在比较不同细胞系之间的收缩力和收缩动力学时尤为重要。
在浇铸后的最初几天内，心肌细胞开始在培养中自发搏动，每次肌肉收缩都会使柔性的支柱发生节律性弯曲。从成肌分化开始第7天起，骨骼肌构建体在电刺激下发生收缩。对骨骼肌组织施加了场刺激。 通过 连接至定制的24孔电极盖的外部刺激器。该电极盖为每个孔配备一对碳电极，置于组织24孔板上方，可同时刺激每块骨骼肌工程组织（EMT），诱导肌肉收缩。在功能检测期间，采用10 V电压、10 ms脉冲时长、1 Hz频率进行起搏刺激。具有收缩功能的组织表明成肌细胞已融合形成肌管，且具备功能性肌节及收缩装置。骨骼肌EMT在横截面免疫组织化学分析中对肌球蛋白重链（MyHC）染色呈阳性，且肌营养不良蛋白（dystrophin）定位于肌管膜，呈现典型的环状结构。图5）。一旦工程化肌肉组织（EMTs）具备功能，即可使用磁感应仪器每日测量其收缩力，持续追踪构建物在发育和成熟过程中的力学变化及动力学特征。在三维培养条件下，心肌和骨骼肌组织均可维持数周至数月的收缩活性。图6），可用于多种收缩力研究。
磁检测方法可用于同时测量结构型心脏毒性物质（如阿霉素（图7）和BMS-986094（图8））以及其他影响肌肉收缩力的药物所引起的急性和慢性效应。也可采用光学追踪方法检测收缩，但在研究药物的急性效应时需格外谨慎，因为测量必须按顺序进行。心肌和骨骼肌工程微组织（EMT）在三维培养中具有较长的存活性，使得在这些组织中开展长期药物研究成为可能。这使研究人员能够探究重复给药以及化合物持续长期暴露的影响，后者可能随着时间推移表现出心脏毒性效应，正如阿霉素的情况所示。阿霉素（dox）是一种抗癌化疗药物17。给予患者的药物剂量因癌症类型、患者年龄、身高、体重以及其他因素而异。因此，在广泛的不同浓度和给药方案下测试dox的效应至关重要。在此项研究中，心肌EMT在27天内分别接受三种不同浓度（0.1 µM、1 µM和10 µM）的dox处理（图7）。各组进一步根据给药方式分为单次推注给药或每72小时换液的连续给药组。接受单次推注给药的孔板在三个不同时间点暴露于药物，两次给药之间允许组织恢复。在最高两个剂量下，无论是单次推注还是连续暴露，均导致在整个研究期间收缩力生成立即且持续地中止。中等和最低浓度对组织的影响因给药方式不同而有所差异。在最低药物浓度下，单次推注组与对照组无显著差异；然而，在连续暴露两周后，收缩力出现下降。中等浓度的药物处理产生了有趣的结果：连续给药导致治疗最初几天内收缩力下降，并在整个实验过程中持续降低；而在单次推注组中，药物在3天后被洗脱，收缩力恢复至对照组水平。然而，第二次给予相同浓度的药物后，收缩力完全中止且未见恢复（图7），表明在临床使用该药物的患者中，以该浓度重复给药可能产生心脏毒性效应。本研究在时间跨度和实验条件范围上的广泛性凸显了三维工程化组织在毒性筛选中的实用性——这些组织在长期化学暴露下仍保持收缩能力并具有响应性，从而可在同一组肌肉组织中开展长期药物研究。这不仅有助于识别在慢性暴露下可能具有心脏毒性作用的化合物，还可检测潜在的心脏毒性给药时机。
体外 在工程化的人体肌肉组织中进行毒性测试是保障临床试验受试者安全的方法之一。BMS-986094 是一种核苷酸聚合酶（NS5B）抑制剂，用于治疗丙型肝炎。该药物在进入 II 期临床试验后，由于百时美施贵宝公司（Bristol-Myers Squibb）报告了多例患者出现意外的心力衰竭，因而终止了其后续开发。18,19在此，将BMS-986094施用于心脏工程化肌肉组织（EMTs），以检测该药物是否会引起三维工程化肌肉组织产生心脏毒性反应。图8）。应用了三种不同浓度的药物，组织监测持续13天。随着药物的加入，收缩力呈剂量依赖性下降（图8A）。随着持续暴露于心脏毒性化合物，搏动频率如预期般减慢并最终停止，抽搐频率也受到显著影响（p < 0.05, 图 8B这些结果表明，三维工程化的人体肌肉组织可用于推动新药上市，并识别因心脏毒性而最终失败的化合物。此外，该技术有望在临床试验阶段前揭示危险药物，从而挽救生命。
测量急性或慢性给药对人类收缩组织作用的能力，是在评估治疗药物的安全性和有效性时至关重要的第一步。然而，必须明确所用药物浓度在生理上具有相关性，并适用于体外（in vitro）测试。本研究利用骨骼肌组织建立2,3-丁二酮单肟（BDM）的完整剂量-反应曲线，以确定其半数抑制浓度（IC50）。该药物是一种特征明确的骨骼肌肌球蛋白-II ATP酶抑制剂20。BDM通过阻止肌球蛋白横桥与肌节中肌动蛋白丝的结合，从而抑制肌肉收缩21。本研究结果显示，给药后绝对收缩力呈剂量依赖性下降，洗脱药物后收缩力完全恢复，表明其作用是暂时性抑制肌肉收缩，而非直接导致组织内细胞死亡（图9A）。此外，在检测的七个浓度下测得完整的剂量-反应曲线，确定该人源微组织中BDM的IC50为3.2 mM（图9B）。
图 1：在2柱Mantarray一次性24孔板中进行EMT铸造。（A）在组织铸造前，将肌源性细胞和基质细胞在二维表面进行培养。（B）将细胞从二维表面剥离，并与细胞外基质蛋白混合，在图中插图所示的各个板铸造孔中形成水凝胶。（C）每孔均含有工程化组织的24孔板。（D）代表性组织显示松弛和收缩状态的工程化肌肉，比较磁性柱（绿色条）的位移情况。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：成功与失败的工程化肌肉组织（EMT）铸造示例。 （A）理想的工程化肌肉组织在铸造后24小时，均匀地围绕支柱收缩，组织内细胞/基质组成均一。（B）失败的EMT，显示水凝胶从柔性支柱上脱离。（C）组织中存在贯穿性气泡的EMT。（D）两侧支柱周围组织沉积不均，一侧的组织仅松散地锚定在柔性支柱上。比例尺为1 mm。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：随时间推移，工程化肌肉组织中的收缩现象。 (A) EMT 构建体在浇铸后第 1 天的形态。将组织转移至分化培养基中，开始细胞融合和水凝胶收缩的第 0 天。B-E) 第7天至第21天的同一根电刺激肌肉组织（EMT），显示随时间推移两固定点之间的总长度略有缩短，且在EMT中段测量时宽度减小。比例尺为1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：EMT直径随时间的变化。 对4个培养皿中的组织进行了为期21天的追踪，比较其在收缩过程中的EMT直径。每周使用光学显微镜测量每个组织的中截面直径。各时间点显示不同培养皿之间的EMT尺寸具有一致性。第21天达到最大收缩程度，此时基质重塑趋于稳定。表格列出了每个组织培养皿内收缩程度的标准差（占总体的百分比）以及所有培养皿的平均偏差。彩色柱代表各个培养皿。误差线表示各培养皿内EMT的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：工程化骨骼肌组织的免疫组织化学染色。 工程化肌肉组织（EMTs）在培养第10天固定后包埋于石蜡中。薄横切片（7 μm）在成像前用抗肌球蛋白重链（MyHC）和抗dystrophin抗体染色。绿色 = MyHC，红色 = Dystrophin，蓝色 = DAPI。物镜放大倍数为40X；比例尺为50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图6：工程化肌肉组织随时间变化的收缩力。（A）培养第7天至第63天期间，从心肌工程化肌肉组织测得的平均绝对单收缩力；每组 n = 3。（B）培养第7天至第53天期间，源自原代细胞系的骨骼肌工程化肌肉组织的平均绝对单收缩力；n = 3。两幅图中的误差线均表示标准差。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：工程化肌肉组织中阿霉素的急性和慢性处理。 三种不同浓度的阿霉素（0.1 µM、1 µM 和 10 µM）以单次推注或连续给药方式施加于工程化肌肉组织，持续 27 天。单次推注给药在第 0、12 和 24 天换液时进行，X 轴上的绿色箭头表示这些时间点。连续给药则在每次换液时均加入药物，X 轴上的黑色和绿色箭头表示这些时间点。Y 轴表示与基线值（用药前）相比的力量百分比变化，X 轴表示处理时间（天）。浅橙色 = DMSO 连续对照，深橙色 = DMSO 推注对照，浅绿色 = 0.1 µM 阿霉素连续给药，深绿色 = 0.1 µM 阿霉素推注给药，浅蓝色 = 1 µM 阿霉素连续给药，深蓝色 = 1 µM 阿霉素推注给药，浅黄色 = 10 µM 阿霉素连续给药，深黄色 = 10 µM 阿霉素推注给药。误差线表示标准差；每组 n = 3。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：BMS-986094在工程化肌肉组织中的长期处理效果。 工程化肌肉组织（EMT）在13天内接受0.4 µM（绿色）、2 µM（深蓝色）和10 µM（浅蓝色）浓度的BMS-986094处理。（A）在所有药物浓度下，收缩性抽搐力（Y轴）在前两天内下降，而DMSO中的对照组织随着时间推移（X轴）持续增强。（B）心肌搏动频率（即抽搐频率）与图A中所示的收缩力停止呈剂量依赖性同步终止。DMSO中的对照组织（灰色）在整个实验过程中保持规律的搏动频率。误差线表示标准差（SD）；每组n = 3。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：工程化骨骼肌组织对BDM的剂量-反应关系。（A）在三维培养第16天，将来源于原代细胞的工程化肌肉组织（EMT）暴露于2,3-丁二酮单肟（BDM）后，其绝对抽搐力呈剂量依赖性下降。当药物被洗脱后，绝对抽搐力恢复至接近基线水平。（B）将绝对抽搐力归一化至基线值后，显示在BDM作用下呈剂量依赖性下降，获得完整的剂量-反应曲线及IC50值；每剂量组n = 4。误差条表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究描述了在24孔耗材铸造试剂盒中生成三维工程化心肌和骨骼肌组织的方法。通过遵循这些方法，可稳定获得完整的24个组织阵列，无任何铸造失败，适用于后续药物筛选。实现该结果的关键因素包括：在铸造过程中所有操作均需在冰上进行，以防止水凝胶过早聚合；在组织铸造前彻底去除细胞解离试剂；对每个组织的细胞与水凝胶悬浮液进行充分混匀；在不同组织之间更换移液器吸头；以及使用热灭活的胎牛血清（FBS）（如使用）。此外，必须确保一旦开始铸造，支柱阵列不得移动，并在水凝胶形成后轻柔转移。
主要改进包括使用不同类型的细胞以实现心脏与骨骼相关的上皮-间质转化，以及在水凝胶中掺入不同浓度的基底膜蛋白，以促进细胞成熟和组织稳定性。此类掺杂的有益效果需逐案测试，但在某些情况下已被证明可改善功能结果和组织存续时间14,16,22值得注意的是，所列出的细胞密度仅为参考值，可能需要针对不同的细胞系进行优化。也可考虑采用其他水凝胶成分，以调节所获得的工程化微组织（EMTs）的结构和功能特性。23,24,25天然肌肉微环境还包含支持性细胞类型，可促进血管化、神经支配和基质沉积，从而在结构和功能上支持肌细胞26,27尽管目前所述系统将成纤维细胞整合到三维心脏组织中，引入其他细胞类型可能构建出更具生理相关性的模型，用于研究治疗性化合物的安全性和有效性 体外此前，多种支持细胞类型已成功整合到三维工程化组织中，为未来利用磁感应收缩力平台开展研究提供了令人期待的模板28,29,30.
该实验方案的故障排除主要集中在浇铸过程中形成不可靠或不一致的组织。在浇铸水凝胶时，必须注意避免产生气泡，同时确保细胞在混合过程中均匀分布。对于每一种新细胞类型，可能都需要进行优化实验，以确定理想的细胞密度、细胞比例以及基质组成。
该技术的一个主要局限在于建立一个包含24个工程化心肌组织（EMT）的完整培养板所需的细胞数量相当庞大。本研究中展示的数据每块板分别使用了1500万个心肌细胞和1800万个骨骼肌成肌细胞。部分研究人员可能无法获得如此大量的细胞材料，这可能会限制他们充分使用该平台的能力。如果终端用户无法获得磁感应硬件，则必须通过光学方法测量悬臂梁的偏转，这将显著降低通量，并阻碍对多个孔中肌肉收缩的同步记录。然而，Mantarray硬件克服了这些局限，提供了首个能够对多个构建体中的EMT收缩进行连续、非侵入式同步分析的商业化系统。
通过24孔进行磁感应检测，可实现对EMT功能发育的长期实时研究，并能够准确测量对化学、环境或遗传操作的急性反应。尽管磁感应检测具有多项优势，例如可同时对多个组织进行测量，且无需复杂的数据分析，但光学检测方法确实能够同时测量钙流或电压图谱等生理指标。然而，结果部分所示的数据集展示了该技术在药物研发领域的广泛应用前景。鉴于目前市场上很少有检测方法能够直接评估工程化肌肉的收缩输出，这些方法有望彻底改变临床前研发流程。
披露
所有作者均为Curi Bio公司员工并持有该公司股份，该公司负责商业化推广Mantarray硬件及相关软件。
致谢
本工作部分得到了美国食品药品监督管理局（授予健康与环境科学研究所的U01 FD006676-01项目）以及美国国立卫生研究院（HL151094，授予Geisse博士）的资助。我们感谢Alec S. T. Smith博士在本文手稿准备过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 µm细胞滤筛 | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm 细胞培养皿 | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip 滤器 | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL 抽滤瓶 | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-氨基己酸 | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight 维持培养基 | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight 铺板培养基 | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM 刺激器 | IonOptix | 电子显微镜 | |
| Curi Bio 肌肉分化培养基试剂盒 | 初级 - DIFF | ||
| Curi Bio 肌肉维持培养基试剂盒 | Curi Bio | 初级 - 维持 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM，高糖，GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| 抗肌萎缩蛋白抗体 | Abcam | ab154168 | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技 | 10082147 | 必须进行热灭活 |
| 纤维蛋白原（牛） | Sigma | E8630 | |
| 戊二醛 | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| 血细胞计数板 | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A 成纤维细胞 | ATCC | CRL-2496 | |
| 人骨骼肌成肌细胞 | Lonza | CC-2580 | |
| 鲁尔锁 0.2 µm 注射器滤器 | 康宁 | 431219 | |
| 鲁尔锁扣式10 mL注射器 | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray 仪器 | Curi Bio | MANTA-24-B1 | 系统 |
| Mantarray 微孔板试剂盒 | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | 5套试剂盒装 |
| Mantarray 刺激盖 | Curi Bio | 电子显微镜 | |
| 基质胶（ECM） | 康宁 | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S，心肌细胞 | NEXEL | C-002 | |
| 光学显微镜 | 尼康 Ti2E | MEA54000 | |
| 泛肌球蛋白重链抗体 | DSHB | MF-20 | |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma | P3143 | |
| ROCK抑制剂 | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| 骨骼肌生长培养基（SkGM-2） | Lonza | CC-3245 | |
| 标准24孔板 | Greiner | M8812 | 其他厂商的板不适用 |
| 标准6孔板 | 赛默飞世尔科技 | 140675 | |
| 基质细胞培养基（DMEM + 20% FBS） | |||
| T175 滤瓶 | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 滤瓶 | 赛默飞世尔科技 | 159934 | |
| 凝血酶 | Sigma | T4648 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | 赛默飞世尔科技 | 15250061 | |
| TrypLE Select 酶（10x） | 赛默飞世尔科技 | A1217702 | |
| TrypLE Select 酶（1x） | 赛默飞世尔科技 | 12563011 |
参考文献
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