一种基于流式细胞术的整合素抑制药物高通量筛选技术

摘要

本方案描述了一种基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定可抑制人中性粒细胞上β2整合素活化的小分子药物。

摘要

本方案旨在建立一种利用构象变化报告抗体和高通量流式细胞术鉴定β2整合素活化小分子拮抗剂的方法。该方法也可作为其他基于抗体的高通量筛选方法的参考。β2整合素是白细胞特异性的黏附分子，在免疫应答中起关键作用。中性粒细胞依赖整合素活化从血液循环中迁移出来，不仅参与抗感染，也参与多种炎症性疾病。调控β2整合素的活化为治疗中性粒细胞相关炎症性疾病提供了可行策略。在本方案中，采用一种单克隆抗体mAb24，该抗体特异性结合β2整合素的高亲和力头部结构域，用于定量检测分离的原代人中性粒细胞表面β2整合素的活化水平。以N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）作为刺激剂激活中性粒细胞的β2整合素。本研究使用可自动检测384孔板样品的高通量流式细胞仪，在3小时内评估320种化合物对β2整合素活化的抑制作用。通过该方法可鉴定直接靶向β2整合素或靶向G蛋白偶联受体启动的整合素“由内而外”活化信号通路中相关分子的化合物。

引言

许多炎症性疾病的特点是在肿胀或损伤部位出现中性粒细胞的浸润¹。为了浸润这些组织，中性粒细胞必须完成中性粒细胞募集级联反应，该过程包括在内皮上停滞、穿过血管壁的外渗以及向组织内的募集²。循环中的中性粒细胞需要β2整合素的活化才能完成这一级联反应，尤其是在停滞阶段。因此，抑制整合素功能、减少中性粒细胞黏附、外渗和募集的药物可能有效治疗炎症性疾病^3,4。

β2整合素此前已被作为炎症性疾病的治疗靶点。一种直接靶向整合素αLβ2的单克隆抗体——依法珠单抗（Efalizumab）——曾被开发用于银屑病的治疗⁵。然而，由于其严重的副作用——由JC病毒再激活引起的进行性多灶性白质脑病——该药物已被撤市^6,7。新型抗炎性整合素靶向疗法应考虑保留白细胞的抗感染功能，以最大限度地减少不良反应。依法珠单抗的副作用可能与其单克隆抗体在血液中长时间循环有关，这可能导致免疫功能的长期抑制⁸。最近一项研究表明，依法珠单抗可介导αLβ2的交联以及α4整合素的非预期内化，为该药物的副作用提供....

方案

在获得知情同意后，从匿名的健康人类供体采集肝素抗凝全血样本，该研究方案已获康涅狄格大学健康中心机构审查委员会批准，遵循《赫尔辛基宣言》的原则。所有供体均签署了知情同意书。本研究的纳入/排除标准经过审慎制定，以确保参与者的适宜性并尽量降低潜在风险。符合条件的参与者年龄介于18至65岁之间，不限种族，需具备英语流利能力，并能够自主提供知情同意。排除的参与者包括无法自行提供知情同意者（例如需要法定授权代表者）、年龄小于18岁或大于65岁者、被监禁者以及孕妇。此外，参与者必须未使用抗炎药物且无炎症性疾病。当前存在感染或正在经历慢性或急性炎症状态者亦被排除。最后，有当前或近期新型冠状病毒感染史的个体不符合本研究的入组资格。这些标准的制定旨在保障参与者的安全与适宜性，同时尽量减少可能影响研究结果的混杂因素。

1. 试剂的准备

1. 中性粒细胞培养基：通过向不含酚红的 RPMI-1640 中添加 2% 人血清白蛋白来制备中性粒细胞培养基（参见 材料表).
2. fMLP 溶液：将 10 mM fMLP 二甲基亚砜（DMSO）储存液稀释 100 倍，配制 fMLP 溶液（参见 材料表用不含酚红的RPMI 1640培养基溶解，配制成100 µM的fMLP溶液。
3. 抗体溶液：将120 µL藻红蛋白别藻蓝素（APC）标记的单克隆抗体mAb24（mA....

结果

代表性384孔板筛选结果（图4）显示，阴性对照的mAb24-APC平均荧光强度（MFI）为3236 ± 110，而阳性对照的mAb24-APC MFI为7588 ± 858。该孔板的Z'因子约为0.33，处于可接受范围内³¹。然而，Z'值还需通过二次检测进一步验证。

为标准化数据，将所有数值进行缩放，使阳性均值的最大值为1，阴性均值的最小值为0。Z'因子将在二次检测中进行更严格的验证。本板的阈值设定为0.41，即相对MFI低于0.41的样本将被视为抑制fMLP诱导的人中性粒细胞β2整合素活化的阳性结果。本板未发现任何阳性结果。

为验证该方案的有效性，使用了Nexinhib20（通过拮抗Rac-1功能抑制β2整合素活化）和lifitegrast（直接拮抗整合素αLβ2）^32,33。然而，Nexinhib20.......

讨论

中性粒细胞刺激和染色的启动与终止由中性粒细胞和固定剂PFA的加入决定。因此，确保向每列加入中性粒细胞或PFA的时间间隔相同至关重要，以保证每个孔中中性粒细胞的刺激和染色时间保持一致。由于中性粒细胞寿命较短，整个实验必须在同一天内完成，从供者采血到流式细胞术检测结束均需如此。中性粒细胞对温度变化极为敏感，当暴露于快速升温环境时（例如从4 °C升至室温，或从室温升至37 °C）可能发生激活。此外，根据我们以往的经验，当中性粒细胞保存在冰上或4 °C时，fMLP诱导的β2整合素激活不会发生（数据未显示）。因此，在固定前，全血和中性粒细胞应始终保持在室温或20 °C（包括分离过程中的离心步骤）。切勿将全血和中性粒细胞置于冰上。

在阴性对照中，mAb24 的染色结果应非常低。如果在实验中观察到较高的 mAb24 染色水平，请检查以下几点：（1）固定前实验过程中温度是否发生显著变化；（2）中性粒细胞培养基中是否存在 fMLP 或内毒素污染；（3）样品处理是否过于剧烈，例如在移液和混匀过程中产生气泡。

本实验方案采用 mAb24 报告 β2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16通道移液器	Thermo	4661090N	仪器
384孔板	Greiner	784201	材料
APC抗人CD11a/CD18（LFA-1）抗体 克隆：m24	BioLegend	363410	试剂
Bravo 自动化液体处理平台	Agilent	16050-102	384多通道液体处理仪
离心机	Eppendorf	Model 5810R	仪器
FlowJo	Becton, Dickinson & Company	NA	软件
人血清白蛋白溶液（25%）	GeminiBio	800-120	试剂
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	试剂
Nexinhib20	Tocris	6089	试剂
N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）	Sigma	F3506	试剂
16%多聚甲醛溶液	Electron Microscopy Sciences	15710	试剂
板用转子桶	Eppendorf	UL155	配件
板式振荡器	Fisher	88-861-023	仪器
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (之前为 1114683)	试剂
Prestwick化学文库化合物板（10 mM）	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520个小分子，98%为已上市批准药物（经FDA、EMA、JAN及其他机构批准）
RPMI 1640培养基，无酚红	Gibco	11-835-030	试剂
摆动转子头	Eppendorf	A-4-62	转子
ZE5细胞分析仪	Bio-Rad Laboratories	Model ZE5	仪器