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方法文章

一种基于流式细胞术的整合素抑制药物高通量筛选技术

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DOI：

10.3791/64401

⸱

2024年2月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定可抑制人中性粒细胞上β2整合素活化的小分子药物。

摘要

本方案旨在建立一种利用构象变化报告抗体和高通量流式细胞术鉴定β2整合素活化小分子拮抗剂的方法。该方法也可作为其他基于抗体的高通量筛选方法的参考。β2整合素是白细胞特异性的黏附分子，在免疫应答中起关键作用。中性粒细胞依赖整合素活化从血液循环中迁移出来，不仅参与抗感染，也参与多种炎症性疾病。调控β2整合素的活化为治疗中性粒细胞相关炎症性疾病提供了可行策略。在本方案中，采用一种单克隆抗体mAb24，该抗体特异性结合β2整合素的高亲和力头部结构域，用于定量检测分离的原代人中性粒细胞表面β2整合素的活化水平。以N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）作为刺激剂激活中性粒细胞的β2整合素。本研究使用可自动检测384孔板样品的高通量流式细胞仪，在3小时内评估320种化合物对β2整合素活化的抑制作用。通过该方法可鉴定直接靶向β2整合素或靶向G蛋白偶联受体启动的整合素“由内而外”活化信号通路中相关分子的化合物。

引言

许多炎症性疾病的特点是在肿胀或损伤部位出现中性粒细胞的浸润1。为了浸润这些组织，中性粒细胞必须完成中性粒细胞募集级联反应，该过程包括在内皮上停滞、穿过血管壁的外渗以及向组织内的募集2。循环中的中性粒细胞需要β2整合素的活化才能完成这一级联反应，尤其是在停滞阶段。因此，抑制整合素功能、减少中性粒细胞黏附、外渗和募集的药物可能有效治疗炎症性疾病3,4。

β2整合素此前已被作为炎症性疾病的治疗靶点。一种直接靶向整合素αLβ2的单克隆抗体——依法珠单抗（Efalizumab）——曾被开发用于银屑病的治疗5。然而，由于其严重的副作用——由JC病毒再激活引起的进行性多灶性白质脑病——该药物已被撤市6,7。新型抗炎性整合素靶向疗法应考虑保留白细胞的抗感染功能，以最大限度地减少不良反应。依法珠单抗的副作用可能与其单克隆抗体在血液中长时间循环有关，这可能导致免疫功能的长期抑制8。最近一项研究表明，依法珠单抗可介导αLβ2的交联以及α4整合素的非预期内化，为该药物的副作用提供了另一种解释9。因此，半衰期较短的小分子拮抗剂可能有助于避免此类问题。

本文介绍了一种利用人中性粒细胞高通量筛选小分子β2整合素拮抗剂的方法。β2整合素的活化需要其胞外域发生构象变化，从而暴露并增强与其配体的结合亲和力。在经典的“开关刀”模型中，弯曲-闭合状态的整合素胞外域首先伸展为伸展-闭合构象，随后其头部结构域打开，形成完全活化的伸展-开放构象10,11,12,13。此外还存在另一种替代通路，即从弯曲-闭合状态经由弯曲-开放状态最终转变为伸展-开放构象14,15,16,17,18,19。构象特异性抗体mAb24可结合于人β2-I样结构域中的一个表位，该表位仅在胞外域头部结构打开时方可被识别20,21,22,23。

此处使用 mAb24-APC 检测 β2 整合素是否被激活。为激活中性粒细胞及整合素，采用细菌来源的短效趋化肽 N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP），该肽可激活中性粒细胞 β2 整合素24，本方案中用作刺激物。当fMLP与中性粒细胞上的Fpr1结合后，会激活涉及G蛋白、磷脂酶Cβ和磷脂酰肌醇3-激酶γ的下游信号级联反应。这些信号事件最终导致整合素活化 通过 内向外信号通路18,25除了直接与β2整合素结合并阻止整合素活化构象变化的小分子拮抗剂外26, 能够抑制β2整合素内向-外向激活信号通路中组分的化合物也可通过该方法检测。自动化流式细胞仪可实现高通量筛选。发现新的拮抗剂不仅有助于深入理解整合素的生理功能，还可为基于整合素的抗炎治疗提供转化医学见解。

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方案

在获得知情同意后，从匿名的健康人类供体采集肝素抗凝全血样本，该研究方案已获康涅狄格大学健康中心机构审查委员会批准，遵循《赫尔辛基宣言》的原则。所有供体均签署了知情同意书。本研究的纳入/排除标准经过审慎制定，以确保参与者的适宜性并尽量降低潜在风险。符合条件的参与者年龄介于18至65岁之间，不限种族，需具备英语流利能力，并能够自主提供知情同意。排除的参与者包括无法自行提供知情同意者（例如需要法定授权代表者）、年龄小于18岁或大于65岁者、被监禁者以及孕妇。此外，参与者必须未使用抗炎药物且无炎症性疾病。当前存在感染或正在经历慢性或急性炎症状态者亦被排除。最后，有当前或近期新型冠状病毒感染史的个体不符合本研究的入组资格。这些标准的制定旨在保障参与者的安全与适宜性，同时尽量减少可能影响研究结果的混杂因素。

1. 试剂的准备

  1. 中性粒细胞培养基：通过向不含酚红的 RPMI-1640 中添加 2% 人血清白蛋白来制备中性粒细胞培养基（参见 材料表).
  2. fMLP 溶液：将 10 mM fMLP 二甲基亚砜（DMSO）储存液稀释 100 倍，配制 fMLP 溶液（参见 材料表用不含酚红的RPMI 1640培养基溶解，配制成100 µM的fMLP溶液。
  3. 抗体溶液：将120 µL藻红蛋白别藻蓝素（APC）标记的单克隆抗体mAb24（mAb24-APC）稀释（参见 材料表），报告β2整合素的高亲和力构象，在10 mL中性粒细胞培养基中配制，制成1.2 µg/mL的mAb24-APC溶液。
  4. 化合物文库：将初始浓度为10 mM的化合物文库用溶剂稀释至1 mM，即加入5 µL的10 mM文库溶液（参见 材料表将1 mM化合物文库使用液体处理仪以每孔5 µL的体积转移至空的384孔板中。随后，使用液体处理仪将45 µL DMSO加入384孔板中。
  5. 如图所示 图1，四个孔（1、2、23、24）仅含有DMSO而不含化合物，作为筛选中的阳性和阴性对照。每个孔中加入45 µL不含酚红的RPMI-1640培养基进行进一步稀释，使所有化合物的终浓度为100 µM。

2. 从人血液中分离中性粒细胞

  1. 使用血清移液管，将 4 mL 血液小心地叠加到 15 mL 离心管中 8 mL 商业密度梯度介质上（参见材料表）（图 2A）。
  2. 在 20 °C 条件下，以 550 × g 离心 30–50 分钟。转子减速过程应缓慢进行（减速因子为 1）。
    注意：中性粒细胞（图 2B 中的条带 2）与红细胞的分离效果可能因供体而异。对于大多数供体，30 分钟离心已足够。然而，若分离不完全，则某些供体可能需要额外延长 10–30 分钟离心时间（图 2C）。
  3. 使用 1 mL 移液器小心吸除血浆（顶部黄色液体）和单个核细胞（上层浑浊条带；即 图 2B 中的 PBMC 条带）。
  4. 从下层浑浊条带（图 2B 中的中性粒细胞条带）及其下方约 3–4 mL 处收集中性粒细胞，转移至含有 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）的 15 mL 离心管中。通过轻轻倒置混匀 2–3 次，使中性粒细胞悬液均匀。
  5. 在 20 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟，随后小心倾倒去除上清液。
  6. 用 5 mL PBS 轻柔重悬沉淀物，并在 20 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。
  7. 通过倾倒法去除上清液，并使用真空抽吸仔细清除管口周围及管壁上的任何残留上清液。将沉淀物重悬于 1 mL 中性粒细胞培养基中。
  8. 使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。通常，从 8 mL 人血中可获得 1 至 4 × 107 个中性粒细胞。
    注意：中性粒细胞悬液中可能存在红细胞污染。红细胞通常不会显著影响大多数检测，且有助于防止中性粒细胞活化/预激活27。但在计数前需裂解红细胞以获得准确的中性粒细胞浓度。将 10 µL 细胞悬液加入 891 µL 去离子水中，孵育 10–30 秒以裂解红细胞，随后加入 99 µL 10× PBS 以平衡渗透压，防止中性粒细胞发生裂解。
  9. 通过添加中性粒细胞培养基，将细胞密度调整至 6.25 × 105 个细胞/mL。

3. 384孔板的制备

  1. 在1.5 mL离心管中，将1 mL抗体溶液（1.2 µg/mL mAb24-APC）与0.2 mL中性粒细胞培养基混合，配制为1 µg/mL的mAb24-APC溶液。然后，取25 µL该混合液加入384孔板的阴性对照孔中（即图1中的蓝色孔）。
  2. 在15 mL离心管中，将9 mL抗体溶液与21.6 µL fMLP溶液（100 µM）以及1.7784 mL中性粒细胞培养基混合，配制为含1 µg/mL mAb24-APC和200 nM fMLP的混合溶液。随后，取25 µL该混合液加入384孔板的阳性对照孔和检测孔中（即图1中的红色孔和蓝色孔）。
  3. 使用多通道移液器，将化合物文库板中100 µM的化合物溶液各5 µL转移至384孔板中。
  4. 在室温下，以500 × g 离心1分钟。
    ​注意：离心板时需使用摆动吊篮转子及配套的板用吊篮。

4. 细胞处理

  1. 使用16通道移液器（5-50 µL量程，对应384孔板的每一列）向每个孔中加入20 µL中性粒细胞悬液。用移液器轻柔吹打混匀5-10次，每次吹打之间保持一致的时间间隔。
    注意：各孔中的终浓度如下：中性粒细胞 2.5 × 105 cells/mL（所有孔）；mAb24-APC 0.5 µg/mL（所有孔）；fMLP 100 nM（阳性对照孔和检测孔）；化合物 10 µM（检测孔）。
  2. 将板置于摇床上，300 rpm，室温（RT）孵育10分钟。
  3. 使用16通道移液器向每孔加入3 µL 16%多聚甲醛（PFA）以固定细胞（终浓度约为0.91%）。然后将板置于冰上孵育10分钟。
    ​注意：建议在加入中性粒细胞和PFA时，不同列之间保持一致的时间间隔。这可确保每个孔中的中性粒细胞与fMLP和mAb24-APC的孵育时间相同。

5. 流式细胞术

  1. 打开流式细胞仪（参见材料表），并确保连接仪器的计算机也已开启。
  2. 确保鞘液容器已加满，废液容器为空且正确连接至仪器。
  3. 将384孔板装载到流式细胞仪的样品加载器上。确保板的A1孔与加载器上的A1标记对齐。
  4. 打开软件并创建新实验。选择384孔板，并选择所需的荧光染料。接着点击板设置，拖动选择所有孔，然后点击样品。打开"高通量"开关，并在速率面板中选择高。
    1. 在体积框中输入50。选择奇数列中的样品，然后激活"振荡"开关。最后，在右侧面板中为样品命名。
  5. 点击绘图与设门。然后点击应用按钮（绿色圆圈上的两个箭头），随后点击运行按钮（三角形）。等待数秒以观察来自第一孔的一些细胞，然后点击暂停按钮。
    1. 调节FSC和SSC电压，以确保细胞在图中清晰可见。点击采集，然后点击运行按钮（三角形）以开始检测。
  6. 流式细胞仪将从每个孔中依次采集约50 µL、含1000–3000个中性粒细胞的样本。完成整个384孔板大约需要3小时。
  7. 所有样品检测完成后，导出.fcs文件以用于下一步分析。

6. 数据分析

  1. 打开流式细胞术数据分析软件（参见材料表）。选择包含所有 .fcs 文件的文件夹，并将其拖拽至软件窗口中，然后释放以将数据导入软件。
  2. 双击一个样本，在弹出的窗口中根据 FSC 和 SSC28,29,30 对中性粒细胞进行单细胞设门，如图3所示。选择已设门的行，并将其拖拽至文件夹，然后释放，以将该设门策略应用于该文件夹中的所有样本。
  3. 使用软件的表格编辑器功能，计算并导出每个孔中中性粒细胞的 APC 中位荧光强度（MFI）。点击编辑选项卡下的添加列。在统计选项卡中选择中位数，选择已设门的细胞群体中性粒细胞，并选择APC作为参数。点击确定按钮。
  4. 返回到"表格编辑器"选项卡，在"分组"选项卡中选择所有样本，然后点击创建表格按钮。将弹出一个新窗口显示所生成的表格。将其保存为文本、CSV 或 Excel 文件。
  5. 打开导出的表格，计算阳性对照和阴性对照样本的 APC MFI 的平均值和标准差（图4）。
  6. 使用以下公式计算该板的 Z' 因子（Z'）：
    Z' = 1 - 3(σp + σn)/(µp - µn)，
    其中 σp 和 σn 分别为阳性对照和阴性对照的标准差，µp 和 µn 分别为阳性对照和阴性对照的均值31。
    注：Z' 因子反映阳性与阴性对照分布之间的分离程度。Z' = 0 表示无分离，Z' = 0.5 表示中等分离。如先前研究所述31，Z' > 0.5 表明该检测适用于化合物筛选。Z' 在 0.5 至 0 范围内可接受，但可能仅能识别出强效阳性结果，这些结果需在二次检测中进一步验证。
  7. 当化合物处理的中性粒细胞的 APC MFI 低于阳性对照 MFI 减去其三倍标准差时（P = 0.0013，由图4中的虚线表示），可将该化合物视为筛选中的"阳性结果"。

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结果

代表性384孔板筛选结果（图4）显示，阴性对照的mAb24-APC平均荧光强度（MFI）为3236 ± 110，而阳性对照的mAb24-APC MFI为7588 ± 858。该孔板的Z'因子约为0.33，处于可接受范围内31。然而，Z'值还需通过二次检测进一步验证。

为标准化数据，将所有数值进行缩放，使阳性均值的最大值为1，阴性均值的最小值为0。Z'因子将在二次检测中进行更严格的验证。本板的阈值设定为0.41，即相对MFI低于0.41的样本将被视为抑制fMLP诱导的人中性粒细胞β2整合素活化的阳性结果。本板未发现任何阳性结果。

为验证该方案的有效性，使用了Nexinhib20（通过拮抗Rac-1功能抑制β2整合素活化）和lifitegrast（直接拮抗整合素αLβ2）32,33。然而，Nexinhib20...

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讨论

中性粒细胞刺激和染色的启动与终止由中性粒细胞和固定剂PFA的加入决定。因此，确保向每列加入中性粒细胞或PFA的时间间隔相同至关重要，以保证每个孔中中性粒细胞的刺激和染色时间保持一致。由于中性粒细胞寿命较短，整个实验必须在同一天内完成，从供者采血到流式细胞术检测结束均需如此。中性粒细胞对温度变化极为敏感，当暴露于快速升温环境时（例如从4 °C升至室温，或从室温升至37 °C）可能发生激活。此外，根据我们以往的经验，当中性粒细胞保存在冰上或4 °C时，fMLP诱导的β2整合素激活不会发生（数据未显示）。因此，在固定前，全血和中性粒细胞应始终保持在室温或20 °C（包括分离过程中的离心步骤）。切勿将全血和中性粒细胞置于冰上。

在阴性对照中，mAb24 的染色结果应非常低。如果在实验中观察到较高的 mAb24 染色水平，请检查以下几点：（1）固定前实验过程中温度是否发生显著变化；（2）中性粒细胞培养基中是否存在 fMLP 或内毒素污染；（3）样品处理是否过于剧烈，例如在移液和混匀过程中产生气泡。

本实验方案采用 mAb24 报告 β2...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢康涅狄格大学健康中心流式细胞术核心实验室的Evan Jellison博士和Li Zhu女士在流式细胞术方面的协助，感谢康涅狄格大学健康中心免疫学系的Lynn Puddington博士对仪器设备的支持，感谢康涅狄格大学健康中心临床研究核心实验室的Slawa Gajewska女士和Paul Appleton博士在获取血液样本方面的帮助。我们感谢康涅狄格大学医学院的Christopher "Kit" Bonin博士和Geneva Hargis博士在本手稿的科学写作与编辑方面提供的帮助。本研究获得了美国国立卫生研究院、国家心肺血液研究所（R01HL145454）、国家普通医学科学研究所（P20GM121176）、美国心脏协会职业发展奖（18CDA34110426）以及康涅狄格大学健康中心启动基金的资助。图1使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16通道移液器Thermo4661090N仪器
384孔板Greiner784201材料
APC抗人CD11a/CD18（LFA-1）抗体 克隆：m24BioLegend363410试剂
Bravo 自动化液体处理平台 Agilent16050-102384多通道液体处理仪
离心机EppendorfModel 5810R仪器
FlowJoBecton, Dickinson & CompanyNA软件
人血清白蛋白溶液（25%）GeminiBio800-120试剂
LifitegrastThermofisher 50-208-2121试剂
Nexinhib20Tocris6089试剂
N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）SigmaF3506试剂
16%多聚甲醛溶液Electron Microscopy Sciences15710试剂
板用转子桶EppendorfUL155配件
板式振荡器 Fisher88-861-023仪器
PolymorphPrepPROGEN1895 (之前为 1114683)试剂
Prestwick化学文库化合物板（10 mM）Prestwick Chemical LibrariesVer19_3841520个小分子，98%为已上市批准药物（经FDA、EMA、JAN及其他机构批准）
RPMI 1640培养基，无酚红Gibco11-835-030试剂
摆动转子头 EppendorfA-4-62转子
ZE5细胞分析仪Bio-Rad LaboratoriesModel ZE5仪器

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