为了合理设计高效的佐剂，我们开发了聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE）。该PNPE具有独特的柔软性和疏水界面，可实现强烈的细胞接触，同时提供高含量的抗原负载，从而增强递送系统对抗原呈递细胞的亲和力，并促进抗原的有效内化。
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本文内容
摘要
摘要
微/纳米颗粒的细胞亲和力是细胞识别、细胞摄取和激活的前提条件，这些过程对于药物递送和免疫应答至关重要。本研究源于一个观察：尽管固体颗粒的电荷、尺寸和形状对细胞亲和力的影响通常被广泛考虑，但我们却很少意识到柔软性、动态重构现象以及复杂界面相互作用在细胞亲和力中的关键作用。在此，我们开发了由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE），克服了刚性结构的局限性，并模拟了病原体的柔韧性和流动性。我们建立了一种方法，用于检测PNPE与细胞表面的亲和力，并阐明免疫细胞对其后续的内化过程。采用石英晶体微天平结合耗散监测技术（QCM-D）测定了PNPE与生物模拟的细胞外囊泡（bEVs，作为骨髓来源树突状细胞BMDCs的替代物）之间的亲和力，该技术可实时监测细胞与乳液之间的黏附过程。随后，利用PNPE递送抗原（卵清蛋白OVA），并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察BMDCs对抗原的摄取情况。代表性结果表明，当PNPE接触bEVs时，频率立即下降（ΔF），提示PNPE与BMDCs之间发生快速黏附并具有高亲和力。与PLGA微粒（PMPs）及AddaVax佐剂（记为表面活性剂稳定的纳米乳液[SSE]）相比，PNPE与细胞膜的结合能力显著更强。此外，由于通过动态曲率变化和侧向扩散增强了免疫细胞的细胞亲和力，PNPE在抗原摄取方面也显著优于PMPs和SSE。该实验方案为设计具有高细胞亲和力和高效抗原内化的新型制剂提供了理论依据，为高效疫苗的开发提供了一个可行平台。
引言
为了应对流行性、慢性及传染性疾病，开发用于预防性和治疗性疫苗的有效佐剂至关重要1,2。理想的佐剂应具备优良的安全性和免疫激活能力3,4,5。抗原呈递细胞（APCs）对抗原的有效摄取和加工被认为是下游信号级联反应及免疫应答启动的关键阶段6,7,8。因此，深入理解免疫细胞与抗原相互作用的机制，并设计可增强抗原内化的佐剂，是提高疫苗效力的有效策略。
具有独特性质的微米/纳米颗粒此前已被研究作为抗原递送系统，用于介导抗原的细胞摄取以及细胞与病原体相关分子模式的相互作用9,10。当递送系统与细胞接触时，会开始与细胞外基质和细胞膜相互作用，从而引发内化及后续的细胞反应11,12
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方案
本方案中描述的所有方法均已获得中国科学院过程工程研究所的批准。所有动物实验均严格遵循《实验动物管理和使用条例》以及《动物伦理审查指南》（中国，GB/T35892-2018）。
1. PLGA 纳米颗粒的制备与表征
- PLGA 纳米颗粒（PNPs）的制备
- 将 0.5 g 聚乙烯醇（PVA）加入 120 mL 去离子水中，在 90 °C 下搅拌至完全溶解，以制备 PVA 溶液。冷却至室温后，将溶液储存于冰箱（4 °C）中。
- 将 100 mg PLGA 加入 10 mL 丙酮与乙醇混合溶剂（比例为 4:1）中，作为油相。
- 将 20 mL PVA 水溶液置于通风橱内，以 400 rpm/min 的速度磁力搅拌。使用注射泵将 5 mL 油相逐滴加入 PVA 溶液中。然后在通风橱中持续搅拌，直至有机溶剂完全挥发。
注意：随着油相中颗粒浓度的增加，水相溶液逐渐变为澄清透明的淡蓝白色或乳白色。 - 待有机溶剂挥发完全（2–3 h）后，在 15,000 x g 条件下离心混合物。洗涤三次或更多次，直至最后一次洗涤液清澈透明。
注意：此步骤的主要目的是洗去颗粒表面残留的 PVA，以防止其影响后续 Pickering 乳液的制备。 - 将洗涤后的 PNPs 重新悬浮于 2 mL 去离子水中，在 -8....
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结果
采用简单的一步超声处理法制备PNPE。首先，我们制备了均匀的PNPs，用作固体稳定剂（图1A）。通过SEM观察PNPs的形态，显示其大多均匀且呈球形（图1B）。采用动态光散射法测定各制剂的流体动力学粒径和Zeta电位 通过 DLS结果显示，PNPs的直径为187.7 ± 3.5 nm，zeta电位为-16.4 ± 0.4 mV（图1C 和 补充表1）。制备PNPE时，将PNP溶液（0.4%，w/v）与角鲨烯混合物简单地在100 W功率下超声处理5分钟（图1D）。在优化连续相后，所得的 PNPE 内部含有角鲨烯，外部吸附有 PNPs（补充图1）。采用光学显微镜观察乳液液滴，使用Mastersizer粒度分析仪测定粒径分布。PNPE的颗粒数量既不会过少而无法阻止乳液聚结，也不会过多而在连续相中过量导致形成更大的聚集体。<.......
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讨论
我们开发了聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒稳定的油/水乳液，作为一种增强抗原内化的递送系统。所制备的PNPE具有致密排列的表面，可为结合位点提供支持，同时具备独特的柔软性和流动性，从而实现与免疫细胞膜的有效接触。此外，油/水界面可实现高载量抗原负载，而两亲性PLGA赋予PNPE高度稳定性，有利于抗原向免疫细胞的运输。PNPE能够快速黏附于细胞表面，表明PLGA纳米颗粒稳定的乳液对细胞膜具有强亲和力，可促进细胞摄取。此外，PNPE具有良好的安全性，因为角鲨烯和PLGA均为美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的成分30，有望推动其安全地向临床转化。
PLGA的分子量以及连续相和分散相的类型影响了PNPE的性质，包括稳定性和疏水性。在本研究中，选择分子量为17 kDa的PLGA纳米颗粒作为稳定剂，角鲨烯作为分散相，从而提高了稳定性。此外，以去离子水作为连续相简化了配方的组成。在此条件下，PNPE能够有效组装抗原并促进抗原向免疫细胞的递送。此外，采用一步超声法来制备PNPE，消除了繁琐的操作步骤并避免了污染的可能性。需要特别注意.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到以下项目资助：中国国家重点研发计划（2021YFE020527、2021YFC2302605、2021YFC2300142）；中国科学院基础前沿科学研究计划“从0到1”原始创新项目（ZDBS-LY-SLH040）；国家自然科学基金创新研究群体项目（批准号：21821005）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| 细胞筛 | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS 酯 | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI 染色液 | 碧云天 | C1005 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 16000-044 | |
| FITC 鬼笔环肽 | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 粒径分析仪 | Malvern | ||
| Micro BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23235 | |
| 膜乳化设备 | 中科森晖微球科技 | FM0201/500M | |
| 微型挤出器 | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| 聚碳酸酯膜 | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| 聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA） | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | 分子量 7,000–17,000 |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | Solarbio | P2100 | |
| 聚乙烯醇（PVA） | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense 二氧化硅传感器 | Biolin Scientific | QSX 303 | 表面粗糙度 < 1 nm RMS |
| 石英晶体微天平 | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI 1640 培养基基础液 | Gibco | C22400500BT | 含 L-谷氨酰胺，25 mM HEPES |
| 扫描电子显微镜（SEM） | JEOL | JSM-6700F | |
| 角鲨烯 | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
参考文献
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-ce....
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重印与许可
