颗粒稳定乳液的细胞亲和力促进抗原内化

摘要

为了合理设计高效的佐剂，我们开发了聚乳酸-乙醇酸纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE）。PNPE具有独特的柔软性和疏水界面，可实现有效的细胞接触，并提供高含量的抗原负载，改善递送系统与抗原呈递细胞的细胞亲和力，并诱导抗原的有效内化。

摘要

微/纳米颗粒的细胞亲和力是细胞识别、细胞摄取和激活的先决条件，这对于药物递送和免疫反应至关重要。本研究源于通常考虑固体颗粒的电荷、大小和形状对细胞亲和力的影响，但我们很少意识到柔软性、动态重组现象和复杂界面相互作用在细胞亲和力中的重要作用。在这里，我们开发了聚乳酸-共乙醇酸（PLGA）纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE），克服了刚性形式的缺点，模拟了病原体的灵活性和流动性。建立了一种方法来测试PNPE对细胞表面的亲和力，并详细说明免疫细胞随后的内化。使用具有耗散监测功能的石英晶体微量天平（QCM-D）测定PNPE与仿生细胞外囊泡（bEVs）的亲和力 - 骨髓树突状细胞（BMDCs）的替代品，该天平可以实时监测细胞乳液粘附。随后，使用PNPE递送抗原（卵清蛋白，OVA），并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察BMDC对抗原的摄取。代表性结果表明，PNPE在遇到bEVs时立即降低频率（ΔF），表明PNPE对BMDC的粘附速度快且亲和力高，PNPE与细胞膜的结合明显强于PLGA微粒（PMPs）和AddaVax佐剂（表示为表面活性剂稳定的纳米乳液[SSE]）。此外，由于通过动态曲率变化和横向扩散增强了细胞对免疫细胞的亲和力，与PMP和SSE相比，抗原摄取随后得到增强。该协议为设计具有高细胞亲和力和高效抗原内化的新型制剂提供了见解，为开发高效疫苗提供了平台。

引言

为了对抗流行性、慢性和传染病，必须开发有效的佐剂用于预防和治疗性疫苗接种1^，2。理想情况下，佐剂应具有优异的安全性和免疫活化³，^4，5。抗原呈递细胞（APC）有效摄取和处理抗原被认为是下游信号级联和免疫应答启动的重要阶段⁶，^7，8。因此，清晰了解免疫细胞与抗原相互作用的机制，设计佐剂以增强内化是提高疫苗效率的有效策略。

具有独特性质的微/纳米颗粒先前已被研究为抗原递送系统，以介导抗原的细胞摄取以及与病原体相关分子模式的细胞相互作用^9，10。与细胞接触后，输送系统开始与细胞外基质和细胞膜相互作用，导致内化和随后的细胞反应^11，12。以前的研究表明，颗粒的内部化是通过细胞膜 - 颗粒粘附¹³发生的，然后是细胞膜的柔性变形和受体扩散到表面膜^14，15。在这种情况下，输送系统的性质取决于对APC的亲和力，这随后影响摄取量^16，17。

为了深入了解改善免疫反应的输送系统的设计，已经开展了广泛的工作，研究颗粒的性质与细胞摄取之间的关系。本研究源于观察结果，即具有各种电荷，大小和形状的固体微/纳米颗粒经常从这个角度进行研究，而流动性在抗原内化中的作用很少被研究^18，19。事实上，在粘附过程中，软颗粒表现出动态曲率变化和横向扩散，以增加多价相互作用的接触面积，这是固体颗粒^20，21难以复制的。此外，细胞膜在摄取部位是磷脂双层（鞘脂或胆固醇），疏水物质可以改变脂质的构象熵，减少细胞摄取所需的能量^22，23。因此，扩增流动性和促进递送系统的疏水性可能是加强抗原内化以增强免疫应答的有效策略。

皮克林乳液，由固体颗粒稳定地组装在两种不混溶液体之间的界面处，已广泛应用于生物领域^24，25。事实上，油/水界面上的聚集颗粒决定了多级结构的形成，促进了多级递送系统-细胞相互作用，并进一步诱导药物递送中的多功能理化性质。由于其变形性和横向移动性，Pickering乳液有望与免疫细胞进行多价细胞相互作用，并被膜蛋白识别²⁶。此外，由于皮克林乳液中的油性胶束芯没有完全被固体颗粒覆盖，皮克林乳液在油/水界面上的颗粒之间具有不同大小的间隙，从而导致更高的疏水性。因此，探索皮克林乳液与APC的亲和力并详细说明随后的内化以开发有效的佐剂至关重要。

基于这些考虑，我们设计了一种PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳剂（PNPE）作为流动性疫苗递送系统，这也有助于获得有关PNPE与BMDC和细胞内化的亲和力的宝贵见解。使用具有耗散监测功能的石英晶体微量天平（QCM-D）通过无标记方法 监测 仿生细胞外囊泡（bEV;BMDC的替代品）对PNPE的实时粘附进行监测。在表征PNPE对BMDC的亲和力后，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）来确定抗原摄取。结果表明，PNPE对BMDC的亲和力更高，抗原内化有效。我们预计PNPE将对APC表现出更高的亲和力，这可能更好地刺激抗原的内化以增强免疫反应。

方案

本协议中描述的所有方法均已获得中国科学院过程工程研究所的批准。所有动物实验均严格按照《实验动物护理使用条例》和《动物伦理审查指南》（GB/T35892-2018）进行。

1. PLGA纳米粒子的制备与表征

1. 聚血游病毒聚碳酸酯纳米颗粒的制备
   1. 在90°C下将0.5g聚乙烯醇（PVA）加入120mL去离子水中，搅拌至完全溶解以制备PVA溶液。冷却至室温后将溶液储存在冰箱（4°C）中。
   2. 将 100 mg PLGA 加入 10 mL 丙酮和乙醇混合物（比例为 4:1）中作为油相。
   3. 将 20 mL PVA 水溶液置于通风橱下，并以 400 rpm/min 的速度磁力搅拌。使用注射泵将 5 mL 油相逐滴添加到 PVA 溶液中。然后，在通风橱中搅拌混合物，直到有机溶剂完全蒸发。
      注意:随着油相中颗粒浓度的增加，水相溶液逐渐变成清澈透明的浅蓝白色或乳白色。
   4. 有机溶剂挥发（2-3小时）后，将混合物以15，000× g离心。洗涤三次或更多次，直到最终洗涤水清澈透明。
      注意:此步骤的目的主要是洗掉颗粒表面残留的PVA，以防止其影响皮克林乳液制备。
   5. 将洗涤的PNP重新悬浮在2mL去离子水中，并将混合物在-80°C下冷冻24小时。随后在冻干机中冷冻干燥颗粒48-72小时。准备好的PNP是白色的羊群。
2. PNP的表征
   1. 为了表征 PNP 的大小和 zeta 电位，将 10 μL PNP 加入 1 mL 去离子水中以获得稀释液并将稀释液转移到 DTS1070 细胞中。打开计算机和动态光散射分析仪（DLS），然后将DTS1070单元放入DLS系统中。
   2. 单击 Zeta尺寸软件 并创建一个新的测量文件以设置测定程序。然后， 开始 测定程序以获得粒度和 zeta 电位分布。
   3. 为了观察PNP的形态，将0.1mL PNPs溶液（稀释40倍）均匀地铺在5cm x 5cm锡箔片上，让水在通风良好的通风橱中自然蒸发过夜。
   4. 切下锡箔的一小部分，并用导电胶带将其固定在样品台上。以 10 mA 的电流喷洒黄金 120 秒。随后使用扫描电子显微镜（SEM）观察样品的表面形态。

2. PNPE的制备和表征

1. 制备PNPE时，将冷冻干燥的PNP加入浓度为4mg / mL（水相）的去离子水中，然后加入角鲨烯作为油相。 在 水浴超声仪中通过一步超声处理5分钟，在100W下制备PNPE。油水相比为1:9。
2. 制备的PNPE的表征
   1. 依次打开 Mastersizer 2000 软件和激光器。单击 "测量" 以打开预设程序并设置样品名称。单击 "开始"开始 测量样品的背景，然后使用滴管将 1 mL PNPE 添加到激光粒度分析仪的样品罐中，以平行测量乳液的粒度三次。
   2. 将 20 μL PNPE 稀释在 1 mL 去离子水中。将 20 μL 乳液滴在载玻片上。使用光学显微镜在40倍放大倍率下观察乳液的形态和均匀性并获得照片。
3. 抗原上样效率
   1. 将 200 μg 卵清蛋白 （OVA） 溶解在 500 mL 去离子水中。然后将其与500mL制备的PNPE混合，并在室温下摇动1小时。通过以5000× g 离心20分钟来除去流体抗原。
   2. 使用二辛可宁酸（BCA）测定法确定流体抗原浓度²⁷。抗原上样效率的计算公式如下:
      抗原上样效率 =
      使用相同的方法确定用作对照组的SSE的抗原上样效率。
4. PNPE的稳定性
   1. 将6mL制备的PNPE分成六个相等的部分，并分别在4°C和25°C下储存三份。在第 0、3 和 6 天将 20 μL 储存的 PNPE 稀释到 1 mL 去离子水 （1:50） 中。然后，测量保存在不同温度下的PNPE储备溶液的大小和zeta电位。
      注意:设置不同的储存温度以比较不同温度对PNPE稳定性的影响，这可以优化储存条件，以实现高稳定性和长保质期。
5. 聚碳酸聚碳酸酯微粒的制备
   1. 将500mgPLGA溶解在5mL二氯甲烷中作为油相，然后倒入含有1.5%PVA的50mL外部水相中，得到油/水混合物。使用均质器以3000rpm将混合物均质化1分钟，以获得粗乳液。
   2. 通过膜乳化保持微球（由粗乳液确定）的PLGA粒径的均匀性。在膜管中安装5.2μm膜。将压力调节至 800 kPa 并保持稳定。
   3. 打开排气阀和进料阀，将粗乳液加入样品罐后，关闭排气阀和进料阀，打开出料阀和进料阀，取膜后乳液放入200 mL烧杯中。重复该过程三次以获得预液。
   4. 搅拌预液，在室温下蒸发二氯甲烷，固化微球。使用7741 x g 去离子水洗涤微球3分钟五次。在-80°C的冰箱中预冷冻，最后冷冻干燥以获得干燥的微球。
6. PMP的表征
   1. 依次打开 Mastersizer 2000 软件和激光器。单击 "测量" 以打开预设程序并设置样品名称。单击 "开始"开始 测量样本的背景。然后，用滴管将 1 mL PMP 添加到激光粒度分析仪的样品添加罐中，并平行测量微粒的粒径三次。
7. 柔软度分析
   注意:PNPE涂覆在SiO₂ 传感器上以测量柔软度。
   1. 通过紫外臭氧处理清洁SiO 2石英传感器芯片10分钟，用5mL乙醇（75%v / v）冲洗两次，并用N₂干燥。将空的 SiO₂ 石英传感器芯片安装到流通池中。
   2. 打开计算机并激活软件右下角的温度控制，以确保设定温度比室温低约1°C。
   3. 单击工具栏中的" 采集 "按钮，然后选择 "设置测量 "以在所用通道中搜索芯片的 1、3、5、7、9 和 11 倍频程。单击工具栏中的" 采集 "按钮，然后选择 "开始测量"。
   4. 用空气校正基线，当基线平衡时，选择"停止"并将文件另存为空白。
   5. 清洁芯片并在芯片上旋转涂覆 10 μg/mL 的 PNPE。简而言之，打开旋涂机并设置操作参数。将N₂ 管连接到旋转涂布机，将气瓶的分馏调整为0.4kPa，并将干净的切屑放在旋转涂布机的吸盘上。将 100 μL PNPE 滴加到 SiO₂ 传感器的中心，并关闭旋涂机的顶盖以完成涂层。
   6. 将PNPE涂层芯片安装到流通池中。重复步骤 2.7.3-2.7.4 并将文件另存为 PNPE。打开空白和PNPE文件，然后单击"拼接"按钮以获取耗散（ΔD）的相关数据。

3. 分离和培养 BMDC ²⁸

注意:确保将所有试剂和样品放在冰上，因为这对细胞活性有积极影响。为保持无菌，请使用无菌器皿在超洁净工作台上执行所有步骤。

1. 通过CO₂吸入对C57BL / 6（雌性，6-8周龄）小鼠实施安乐死，并将它们浸泡在70%（v / v）的乙醇中以进行短暂灭菌。
2. 浸泡3-5分钟后，将小鼠转移到超级干净的工作台上。用不锈钢剪刀去除腿部肌肉，露出股骨和胫骨，然后将股骨和胫骨分开。
3. 用70%（v / v）乙醇填充培养皿，并将干净的骨头浸泡在其中5-10秒以完成外部灭菌。清洁所有骨头，并将它们放入无菌管中，周围有冰块。
4. 用剪刀修剪靠近关节的股骨和胫骨。将注射器针头插入骨中，使用预冷的RPMI培养基（1640）将骨髓冲洗到离心管中。
5. 冲洗两到三次，直到骨头完全变白。移液几次骨髓以分离所有团块。使用直径为 40 μm 的筛子将细胞过滤到 15 mL 离心管中。
6. 在4°C和500× g 下离心5分钟。弃去上清液，向沉淀物中加入2mL红细胞裂解物4分钟。
7. 洗涤两到三次后，将细胞重新悬浮在 2 mL 完全培养基（1% 青霉素-链霉素、10% 胎牛血清、20 ng/mL IL-4 和 10 ng/mL GM-CSF）中。然后，将 10 μL 细胞稀释到 1 mL PBS 中，并将手持式自动细胞计数仪的芯片插入细胞稀释液中进行细胞计数。最后，将密度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的种子细胞放入具有完整培养基的 10 mm 培养皿中。
8. 在37°C下用5%CO₂ 的细胞培养箱中培养细胞。 每2天更换一次培养基。在第7天，将细胞转移到50 mL管中，并以450 x g 离心5分钟以收集细胞。

4. 仿生细胞外囊泡（bEVs）的制备

1. 按照制造商的说明按顺序组装小型挤出机。使用前请确保注射器外壳没有破裂。在每次实验之前，确保所有O形圈都处于良好状态，并及时更换磨损或损坏的O形圈。操作挤出机时，磨损或损坏的O形圈会导致压力突然释放。
2. 反复吸出BMDC并将其转移到离心管中。通过在4°C下以450× g 离心5分钟来收获细胞。 使用微型挤出机²⁹通过10μm，5μm和1μm聚碳酸酯膜对细胞悬浮液加压30次。
   注意:为了实现 bEV 尺寸均匀性，将 BMDC 悬浮液推入 10 μm、5 μm 和 1 μm 聚碳酸酯膜 30 次。此外，在操作过程中，请确保均匀施加力并保持沿注射器轴线的力方向。
3. 将混合的上清液在1000× g 和4°C下离心5分钟以除去细胞。收集上清液并在4°C下以3000× g 离心5分钟以除去剩余的细胞和细胞碎片。
4. 收集上清液并在4°C下以100，000× g 离心90分钟。 弃去上清液并将 bEV 重新悬浮在 2 mL HEPES 缓冲盐水 （HBS） 中。通过0.45μm膜过滤 纯 化bEV，并将纯化的bEV储存在-80°C。

5. 电动车遵守PNPE标准

注意: SiO₂ 传感器是通过旋涂法 修改 的。

1. 用聚-L-赖氨酸 （PLL） 修饰的 SiO₂ 传感器。
   1. 使用UV-臭氧处理清洁SiO 2石英传感器芯片10分钟，用乙醇冲洗两次，然后用N₂干燥。
   2. 按 电源 按钮打开旋涂机，按 控制 按钮，设置涂布时间和速度。初始转速为 400 rpm，稳步增加到 5000 rpm。
   3. 将N₂ 管连接到旋涂机，并将气瓶的分馏调整为0.4 kPa。将干净的切屑放在旋涂机的吸盘上。将 100 μL PLL 滴加到 SiO₂ 传感器的中心，并关闭旋涂机的顶盖。
   4. 按"开始"按钮开始涂覆样品，完成后停止机器。关闭真空泵，关闭电源和控制按钮，然后卸下经过 PLL 修改的 SiO₂ 传感器。
      注意:在按下 开始之前，请确保已设置涂层时间和速度。此外，请确保 SiO₂ 传感器放置在吸盘的中心。在运行过程之前，请确保盖子已关闭，以防止发生事故。
2. bEV对PNPE的附着力的测定
   1. 打开电脑、电子单元、蠕动泵，激活软件右下角的温度控制，确保设定温度比室温低约1°C。
   2. 根据操作说明将 PLL 改性的 SiO₂ 传感器放入流通池中，并连接流通池和流量泵之间的测量管路。在开始实验之前，将流通池放入流动模块系统内并用超纯水冲洗。
   3. 单击" 采集 "工具栏并选择 "设置测量 "，在所用通道中搜索芯片的 1、3、5、7、9 和 11 倍频程。要更正基线，请单击 "开始测量 "以允许空气进入流量模块，直到空气基线平滑为止。随后，流动去离子水10-15分钟，使溶液基线再次平衡。
   4. 将制备好的PNPE溶液以50μL/min的流速泵入流量模块，以在SiO₂ 传感器上实现平衡吸附。
      注意:当PNPE再次泵入流量模块时，ΔF不再变化，表明SiO₂ 传感器的表面已被PNPE完全覆盖。
   5. 将制备好的bEVs溶液以50μL/min的流速泵入流动模块，以跟踪bEV粘附到PNPE表面的过程。

6. 抗原摄取的CLSM分析

1. 与BMDC共培养PNPE-OVA
   1. 将 BMDC 与 1640 完全培养基（1% 青霉素-链霉素、10% 胎牛血清、20 ng/mL IL-4 和 10 ng/mL GM-CSF）孵育 7 天，然后将它们接种到小共聚焦激光培养皿中，每孔 1 x 10⁶ 在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中过夜。
   2. 将 0.5 mL Cy5 标记的 OVA （400 μg/mL） 与 0.5 mL PNPE 混合 1 小时，并通过以 5000 x g 离心 20 分钟去除流体抗原以开发疫苗制剂。用 200 μL 去离子水重悬后，将 10 μL 制剂 （10 μg/mL OVA） 加入超洁净工作台下的小型共聚焦激光培养皿中，并与 BMDC 共培养 6 小时。
2. 肌动蛋白细胞骨架染色
   1. 从细胞中取出培养液，并用预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS;pH 7.4）洗涤两次。
   2. 在室温下用PBS中的4%甲醛溶液固定细胞10分钟。在固定过程中，避免使用含有甲醇的固定剂，因为甲醇可能会破坏肌动蛋白。
   3. 用PBS在室温下洗涤细胞两次或三次，每次10分钟。在室温下用100μL的0.5%Triton X-100溶液透化细胞5分钟。用PBS在室温下洗涤细胞两次或三次，每次10分钟。
   4. 用200μL异硫氰酸荧光素（FITC）缀合的鬼笔环肽工作溶液覆盖小型共聚焦激光培养皿的玻璃底培养皿上的细胞，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。为了减少背景信号，将 1% 牛血清白蛋白添加到 FITC 偶联鬼笔环肽工作溶液中。此外，在孵育过程中盖上小型共聚焦激光培养皿的盖子，以防止溶液蒸发。
   5. 用PBS洗涤细胞，每次5分钟。用 200 μL DAPI 溶液（浓度:100 nM）重新染色细胞核约 30 秒。
3. 图像分析
   1. 按顺序打开共聚焦显微镜硬件，包括激光、共聚焦、显微镜和计算机。单击 NIS-Elements AR 5.20.00 软件并选择 尼康共聚焦 进入测试系统。
   2. 在共聚焦显微镜系统中，按记下的顺序打开各个单元。首先，设置 FITC、DAPI 和 Cy5 通道，并调整相应的高压和偏移。然后，选择100倍油镜头，并在顶部滴一滴雪松油。将含有染色BMDC的小共聚焦激光培养皿放在显微镜载物台上。
   3. 单击 扫描 按钮。在荧光显微镜下，通过移动 X 轴、Y 轴和 Z 轴来定位感兴趣的细胞。调整激光强度、图像大小和其他参数，以便扫描高质量的共聚焦图像。最后，点击 捕获 按钮并保存图像。

结果

使用简单的一步超声检测来获得PNPE。首先，我们制备了均匀的PNP作为固体稳定剂（图1A）。通过SEM观察PNP的形态，表明它们大多是均匀和球形的（图1B）。通过DLS 检测 配方的流体动力学尺寸和zeta电位。PNP的直径为187.7 ± 3.5 nm，zeta电位为-16.4 ± 0.4 mV（图1C 和 补充表1）。为了制备PNPE，将PNP溶液（0.4%，w / v）和角鲨烯的混合物简单地在100w下超声处理5分钟（图1D）。优化连续相后，得到的PNPE内部由角鲨烯组成，外部吸附PNP（补充图1）。采用光学显微镜观察乳液液滴，并使用Mastersger粒度分析仪确定乳液液滴的粒度分布。PNPE表现出不减少的颗粒以防止乳液的聚结，并且在导致较大聚集体的连续相中没有更多的颗粒过量（

讨论

我们开发了PLGA纳米颗粒稳定的油/水乳液作为增强抗原内化的递送系统。制备的PNPE具有密集的表面以支持着陆点，并具有独特的柔软性和流动性，可与免疫细胞膜进行有效的细胞接触。此外，油/水界面提供了高含量的抗原负载，两亲性PLGA赋予PNPE高稳定性，用于将抗原转运到免疫细胞。PNPE可以快速粘附在细胞表面，表明PLGA纳米颗粒稳定的乳液对细胞膜具有很强的亲和力，用于细胞摄取。此外，PNPE具有很高的安全性，因为角鲨烯和PLGA都是美国食品和药物管理局（FDA）批准的成分³⁰，预计将利用安全转移到临床。

PLGA的分子量以及连续相和分散相的类型会影响PNPE的性质，包括稳定性和疏水性。本研究选择分子量为17 kDa的PLGA纳米颗粒作为稳定剂，角鲨烯作为分散相，提高了稳定性。此外，去离子水作为连续相简化了制剂的组成。在这种情况下，PNPE允许抗原的有效组装并促进抗原向免疫细胞的递送。此外，采用一步超声法制备PNPE，消除了繁琐的过程，避免了污染的可能性。需要注意的是，由PNP和角鲨烯组成的输送系统需要均匀的力，否则不会形成乳液或制备的P...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AddVax	InvivoGen	Vac-adx-10
细胞过滤器	Biosharp	BS-70-CS	70 μm
共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM）	尼康		A1
Cy3 NHS 酯	YEASEN	40777ES03
DAPI 染色液	Beyotime	C1005
胎牛血清 （FBS）	Gibco	16000-044
FITC 鬼笔环肽	Solarbio	CA1620
Mastersizer 2000 粒度分析仪	马尔文
微支链氨基酸蛋白检测试剂盒	Thermo Science	23235
膜乳化设备	中科森汇微球科技		FM0201/500M
小型挤出机	Avanti Polar Lipids， Inc
纳米 ZS	马尔文		JSM-6700F
聚碳酸酯膜	Avanti 极性脂质，
聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）	Sigma-Aldrich	26780-50-7	MW 7,000-17,000
聚-L-赖氨酸溶液	Solarbio	P2100
聚（乙烯醇）（PVA）	Sigma-Aldrich	9002-89-5
QSense 二氧化硅传感器	Biolin Scientific	QSX 303	表面粗糙度 < 1 nm RMS
石英晶体微天平	Biosharp		Q-SENSE E4
RPMI 培养基 1640 碱性	Gibco	C22400500BT	L-谷氨酰胺，25 mM HEPES
扫描电子显微镜 （SEM）	JEOL		JSM-6700F
角鲨烯	Sigma-Aldrich	111-02-4