噬菌体在细菌细胞间转移DNA的能力使其成为对其宿主细菌进行遗传操作的有效工具。本文介绍了一种诱导、回收和使用φBB-1噬菌体的方法，该噬菌体是 Borrelia burgdorferi，用于在莱姆病螺旋体的不同菌株之间转导异源DNA。
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本文内容
摘要
摘要
将外源DNA导入螺旋体Borrelia burgdorferi几乎完全依赖于通过电穿孔进行的转化。与其它特征更明确的革兰氏阴性细菌相比，该过程在莱姆病螺旋体中的效率显著较低。 转化成功率在很大程度上取决于能否获得来自特定背景的高质量、高浓度DNA，并且存在明显的菌株间差异。开发将外源DNA（例如穿梭载体、荧光报告基因和抗生素抗性标记）导入B. burgdorferi的替代方法，可能为莱姆病螺旋体遗传操作工具箱的重要补充。噬菌体已被广泛认可为在细菌间转移DNA的天然机制，这一过程称为转导。本研究建立了一种利用普遍存在的伯氏螺旋体噬菌体φBB-1在相同或不同遗传背景的B. burgdorferi细胞之间进行DNA转导的方法。所转导的DNA包括伯氏螺旋体自身的DNA以及以小型穿梭载体形式存在的异源DNA。该结果表明，噬菌体介导的转导有望作为电穿孔之外的补充手段，用于莱姆病螺旋体的遗传操作。本文报道了从B. burgdorferi中诱导和纯化噬菌体φBB-1的方法、该噬菌体在转导实验中的应用，以及潜在转导子的筛选与鉴定方法。
引言
螺旋体细菌遗传操作工具的开发 Borrelia burgdorferi 极大地增进了对莱姆病本质的理解1,2,3,4. B. burgdorferi 具有一个异常复杂的基因组，由一条小型线性染色体以及线性和环状质粒组成5,6自发性质粒丢失、基因内重排（同一生物体内基因从一个质粒转移到另一个质粒）以及水平基因转移（HGT，DNA在两个生物体之间的转移）导致了不同生物之间极为复杂的遗传异质性 B. burgdorferi （例如，参见 Schutzer 等人）7）。所得基因型（或 "菌株"属于同一物种，但其遗传差异影响了它们向不同哺乳动物宿主传播和感染的能力8,9,10,11在本报告中，术语 &#....
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方案
所有涉及重组DNA和生物安全等级2级生物体的实验均经过昆尼皮亚克大学机构生物安全委员会审查并批准。
1. 准备伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）培养物以产生φBB-1
- 制备添加了6.6%热灭活正常兔血清的Barbour-Stoenner-Kelly培养基（BSK）15。配制1 L的1x BSK时，将表1中所列组分加入900 mL水中，用1 N氢氧化钠调节pH至7.6，并在4 °C下缓慢搅拌混合2–4小时。混合完成后，必要时再次检查并调整pH至7.6，然后加水定容至1 L。使用0.22 µM滤器（见材料表）过滤除菌，新鲜使用或于4 °C保存不超过2个月。
- 在开始转导实验前3至5天，将适量的B. burgdorferi克隆（150 µL）接种至15 mL 1x BSK培养基中，使用带紧密盖子的无菌锥形离心管（见材料表）。根据B. burgdorferi克隆的需求，在培养基中添加适当浓度的抗生素或抗生素组合，用于外源DNA的筛选与维持（表2）。
注意：B. burgdorferi属于生物安全二级病原体。操作时应采取所有适当的防护措....
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结果
利用噬菌体在更易转化的 B. burgdorferi 菌株或难以进行电转化的克隆之间转移 DNA，是持续研究莱姆病决定因子的另一种工具。本文所述的转导实验可根据需要进行调整，以使用一种或两种抗生素筛选潜在转导子，从而促进任意目标克隆之间的 DNA 转移。此前已有研究证明，可在高传代菌株 CA-11.2A 克隆与高传代菌株 B31 克隆以及毒力较强的低传代菌株 297 克隆之间，转导前噬菌体 DNA 和异源的 E. coli/B. burgdorferi 穿梭载体28。下文结果展示了在两个高传代、无毒力的克隆之间前噬菌体 DNA 的转移。供体克隆 c1673 是 B. burgdorferi 菌株 CA-11.2A 的一个克隆，其前噬菌体 DNA 上携带卡那霉素抗性基因27,28；受体为 B. burgdorferi 菌株 B31 的克隆 c1706，其染色体上带有庆大霉素抗性标记
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讨论
转导的使用可能代表了一种克服与电转化相关的部分生物学和技术障碍的方法 B. burgdorferi1,4,13,37在许多系统中，噬菌体可通过普遍性转导或特异性转导将宿主（非原噬菌体）DNA在细菌细胞间转移。22,23,24,49,50在特异性转导中，少数宿主基因会与前噬菌体DNA一起被包装进噬菌体衣壳内49,50例如，φBB-.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Shawna Reed、D. Scott Samuels和Patrick Secor提供的有益讨论，以及Vareeon (Pam) Chonweerawong提供的技术支持。本工作由昆尼皮亚克大学健康科学学院生物医学科学系以及Christian H. Eggers获得的教员研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 L 滤器单元（PES，0.22 µm 孔径） | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm × 75 mm 管（双位置盖，聚丙烯） | USA Scientific | 1450-0810 | 可容纳 4 mL，死体积低（用于诱导） |
| 15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯） | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-甲基-3-亚硝基-硝基胍（MNNG） | Millipore Sigma | 注意：潜在致癌物；目前不易获得，未测试替代品 | |
| 5.75" 帕斯特移液管（棉塞、硼硅酸盐玻璃、非无菌） | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | 使用前需高压灭菌 |
| 50 mL 圆锥形离心管（聚丙烯） | USA Scientific | 1500-1211 | |
| 无水乙醇 | |||
| 低电渗琼脂糖（Agarose LE） | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| 胰蛋白胨（Bacto Neopeptone） | Gibco | DF0119-17-9 | |
| 酵母提取物（Bacto TC Yeastolate） | Gibco | 255772 | |
| 牛血清白蛋白（血清替代级） | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| 氯仿（分子生物学用） | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | 注意：挥发性有机物；仅可在化学通风橱中使用 |
| CMRL-1066 培养基（不含 L-谷氨酰胺，粉末） | US Biological | C5900-01 | 细胞培养级 |
| 红霉素 | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| 庆大霉素试剂溶液 | Gibco | 15750-060 | |
| 葡萄糖（无水右旋糖） | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| 硫酸卡那霉素 | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS 滤器（0.22 µm 孔径） | Millipore Sigma | SLGSM33SS | 用于抗生素及其他小体积溶液的过滤除菌 |
| 丝裂霉素 C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | 注意：潜在致癌物；仅可在化学通风橱中使用 |
| N-乙酰-D-葡萄糖胺 | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| 寡核苷酸（PCR 引物） | IDT DNA | ||
| OmniPrep 基因组总提取试剂盒 | G Biosciences | 786-136 | |
| 培养皿（100 mm × 15 mm） | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser 计数室 | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser 计数室盖玻片 | Hausser scientific | HS-5051 | |
| 聚乙二醇 8000（PEG） | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| 非无菌微量溶血兔血清（NRS） | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | 按制造商说明进行热灭活 |
| 半微量紫外透明比色皿 | USA Scientific | 9750-9150 | |
| 碳酸氢钠 | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| 氯化钠 | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| 丙酮酸钠 | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 硫酸链霉素溶液 | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| 二水合柠檬酸三钠 | Millipore Sigma | S1804-500G | 用于 BSK 培养基的柠檬酸钠 |
参考文献
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
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