机械通气仔猪肾小球滤过率的经皮测量

摘要

肾小球滤过率（GFR）是评估肾功能的理想指标。然而，采用菊粉注射并结合连续血液和尿液分析的标准测量方法在实际应用中并不实用。本文阐述了一种在仔猪中经皮测量GFR的实用方法。

摘要

肾小球滤过率（GFR）的经皮测量已被用于评估清醒动物的肾功能。该技术在啮齿类动物中已较为成熟，常用于急性肾损伤和慢性肾病的研究。然而，经皮GFR测量系统在肾脏系统与人类相似的猪中尚未得到验证。因此，我们研究了脓毒症对麻醉并接受机械通气的新生猪经皮GFR的影响。通过盲肠结扎穿刺法（CLP）诱导多微生物性脓毒症。将包含微型荧光传感器的经皮GFR测量系统贴附于猪只剃毛后的皮肤，以检测静脉注射的GFR示踪剂——异硫氰酸荧光素（FITC）标记的菊粉（sinistrin）的清除率。结果显示，在CLP术后12小时，血清肌酐升高，同时GFR下降。本研究首次证明了经皮GFR检测方法在机械通气新生猪中评估肾功能的可行性。

引言

评估肾功能的一种实用且定量的方法是测量肾小球滤过率（GFR），该指标基于清除率原理，反映肾脏过滤血液的能力¹。早期测量GFR的方法包括静脉注射外源性物质（如菊粉或右旋糖酐），并通过连续测定血浆和尿液中的浓度变化来评估其清除情况^2,3。该方法操作繁琐，需要连续采集血浆和尿液样本⁴。另一种替代方法是检测内源性代谢终产物，例如肌酐。然而，这种方法耗时较长，且有时准确性较差，因为肌酐不仅经肾小球滤过，还由肾小管分泌^5,6。此外，肌酐水平受性别、年龄、饮食和肌肉量的影响^7,8,9。

一种更精确、微创且广泛应用的肾小球滤过率（GFR）测量方法是使用经皮GFR监测仪，可在动物体内实时测量GFR^4,10。辛丝林（sinistrin）是一种高度可溶且可自由通过肾小球滤过的外源性肾功能标志物，可与异硫氰酸荧光素（FITC）标记。该偶联化合物通过静脉注射后，无需采集血液和尿液样本即可实时评估肾功能¹¹。经皮GFR测量技术已在啮齿类动物¹²、犬¹³和猫¹⁴中得到验证，但在猪中尚未应用。

猪在解剖学和生理学上与人类具有多项相似特征，因此是研究多种人类疾病的理想动物模型¹⁵。由于猪的生理和病理生理过程更接近人类，其在转化生物医学研究中的应用日益广泛，并逐渐优于啮齿类动物模型¹⁶。新生猪对于研究儿科患者特有疾病的发病机制具有重要意义¹⁷。此外，近年来猪到人类的器官移植技术取得进展，迫切需要拓展用于临床前和临床试验的诊断工具^18,19,20,21。本文首次提供了在新生猪中使用经皮装置测量肾小球滤过率（GFR）的操作指南。

方案

实验操作遵循实验室动物护理和使用的国家标准，并已获得田纳西大学健康科学中心（UTHSC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意：实验组仔猪接受盲肠结扎穿孔处理，而假手术组仅进行开腹操作，不进行盲肠结扎或穿孔。两组仔猪在术后均维持麻醉状态12小时，以确保实验组有足够时间发展为脓毒症和急性肾损伤（AKI）。经皮肾小球滤过率（GFR）测量将在术后8小时开始，持续共12小时。

1. 仔猪供应与饲养

1. 确定一家可提供3至5日龄新生仔猪的本地养猪场。安排在周 early 交付，以确保在仔猪不超过7日龄前完成实验。
   注意：本实验中供应商每周一提供三至五头仔猪；到周五时，所有仔猪已完成实验。使用相同性别且年龄相近的仔猪至关重要，以避免混杂因素的影响。
2. 仔猪到达后，确保每头仔猪具有独立标识（例如耳标，并记录其体重和年龄）。
3. 将仔猪饲养在实验动物护理单元（LACU）中，并由持证兽医负责照护。动物以群体方式饲养于宽敞的围栏内，地面为易于用水清洗的实心混凝土，以保持良好卫生条件。
4. 添加如重球等设施，以提供环境丰富化和刺激。
5. 确保LACU提供最佳环境条件，包括以下关键要素：卫生、营养、温度控制、通风，以及通过光照控制昼夜循环。
6. 由兽医每日检查仔猪状况，包括测量体重，若发现任何仔猪出现疾病迹象，应及时通知研究人员，必要时将其排除出实验。
7. 让仔猪至少适应环境1天，以帮助最小化应激反应。

2. 术前准备

1. 在开始实验前准备手术工作站。包括加热垫、导管、呼吸机、气管插管、肝素化生理盐水以及一袋乳酸林格液。
   注意：仔猪体温调节能力较差，易发生低体温，从而改变血流动力学^22,23因此，确保加热垫有足够的预热时间至关重要。
2. 将α-氯醛糖与生理盐水在60 °C下混合，配制成10 mg/mL的溶液，持续搅拌至澄清。避免过度加热，以防冷却时药物结晶。给仔猪给药前，使用注射器滤器（孔径0.22 µm）过滤溶液。
3. 根据动物体重抽取麻醉药物——氯胺酮：20 mg/kg，赛拉嗪：2.2 mg/kg。使用α-氯醛糖（5 mL/kg）维持麻醉。
   注意：由于与吸入给药相比，α-氯醛糖更易于静脉注射给药，因此选用该药物 
   麻醉剂，因为后者需要通过麻醉机和适当的废气清除系统经气管插管给药。

3. 麻醉

1. 在幼猪熟悉的猪舍环境中进行麻醉诱导，以避免造成不必要的应激。
2. 轻轻抓住幼猪后肢，使用23 G ¾号针头，向半膜肌/半腱肌部位注射氯胺酮（20 mg/kg）和赛拉嗪（2.2 mg/kg）。
3. 等待数分钟使药物起效。通过评估动物是否充分放松、保持不动，以及眼睑反射和下颌张力消失，以判断麻醉深度是否足够，确保能够安全、顺利地转运至手术台。通过触碰眼内角来评估眼睑反射；若无眨眼反应，则表明麻醉程度适当。

4. 气管切开术

注意：本实验为非存活实验，因此需进行气管切开术以建立机械通气的气道。与经气管插管相比，气管造口术是一种快速且简便的操作；由于仔猪的头部和上呼吸道解剖结构特点，经气管插管较为困难^24,25。此外，插管过程中常有喉痉挛的报道，可能导致长时间的低氧血症和高碳酸血症，从而影响实验结果²⁶。

1. 将仔猪置于仰卧位。通过触诊甲状腺软骨的突起部分（触感较硬）来确定环甲膜的位置。使用聚维酮碘和70%乙醇对局部区域进行消毒，然后铺上无菌巾。
2. 使用手术刀，在甲状腺软骨尾端下方做一条2–3 cm的腹侧正中切口。
3. 使用弯头蚊式止血钳钝性分离其上方的皮下组织和肌肉（胸骨舌骨肌和颈皮肌），直至暴露出环甲膜及前几节气管软骨环。分离过程中需小心，避免损伤任何血管。
4. 清晰暴露环甲膜和气管软骨环²⁴，然后使用一对长弯角Mixter止血钳将这些结构提起。
   1. 用小剪刀在环甲膜或第一气管环处做一小切口，再横向延长切口至约0.5 cm，以便插入3.0 mm的气管插管。
   2. 将导管插入至5 cm刻度处。在固定导管前，确认双侧胸廓扩张良好且听诊可闻及双侧呼吸音。
5. 用脐带线绕气管一周，以固定导管位置。另用胶带将导管固定于下颌骨基部。
6. 打开呼吸机，连接气管插管，并调节相应旋钮（例如SIMV旋钮、PEEP旋钮等），设定以下基础参数：压力控制模式：同步间歇指令通气（SIMV）；吸气峰压（PIP）—15；呼气末正压（PEEP）—5；呼吸频率—20；吸气时间（I-time）—0.6。在完成首次血气分析后，根据血气结果调整呼吸机参数，以维持充分的氧合与通气。

5. 股血管插管

1. 在转向股血管进行静脉通路建立和有创血压监测之前，首先建立气道并进行通气。股动脉可通过触诊缝匠肌与股薄肌之间沟内的搏动来定位，股静脉则位于动脉内侧稍偏的位置。
2. 将幼猪置于仰卧位，使用聚维酮碘和乙醇对腹股沟区域进行消毒，并覆盖适当尺寸的手术巾。
3. 使用手术刀在腹股沟韧带起始处做一长度为3-4 cm的纵向切口，沿股管方向向远端延伸。
4. 分别使用蚊式弯钳和剪刀进行钝性与锐性分离，逐层解剖至股神经血管束水平。该血管束位于股薄肌肌体内较深位置²⁷。围绕股动脉和股静脉进行长约2-3 cm的环周分离，以便插管；必要时结扎细小的分支血管。
5. 在动脉和静脉的近端与远端分别用3.0丝线结扎，以提供牵拉作用。将静脉和动脉的远端丝线打结，实现血管的结扎。
6. 首先处理股静脉，在保持远端和近端牵拉张力的同时，使用显微剪刀做静脉切开（venotomy）。
7. 随后使用静脉导引套管（vein pick catheter introducer）扩张血管腔，同时插入内径×外径为0.86 mm × 1.32 mm的预裁剪聚氨酯导管。导管插入后，结扎近端3.0丝线以固定导管。用3 mL肝素化生理盐水（1 U/mL）冲洗导管。该溶液可通过将0.5 mL肝素加入50 mL生理盐水中配制而成。
8. 采用上述相同方法进行动脉切开（arteriotomy），插入有创血压监测导管。
   注意：在进入动脉时，维持远端和近端的牵拉张力对于减少失血至关重要。
9. 导管固定后，用生理盐水浸湿的纱布覆盖手术部位；必要时可使用3.0丝线缝合皮肤，以预防感染。

6. 麻醉维持、液体管理与血气分析

1. 在整个实验过程中，通过观察下颌张力和眼睑反射来监测麻醉深度，并根据需要静脉注射 α-氯醛糖，以维持动物处于深度麻醉状态。初始负荷剂量为 50 mg/kg，后续追加剂量为 20 mg/kg。
2. 在整个实验过程中，以 4 mL/kg/h 的速率输注乳酸林格液作为维持液体。例如，若仔猪体重为 3 kg，则液体输注速率为 12 mL/h。
3. 进行床旁血气分析时，使用肝素化血气针抽取动脉血样本，并将样本送入分析仪。在仪器上选择 动脉血气 选项，等待约 2-3 秒，直至分析仪伸出采血针。
   1. 小心将针头插入含有血液样本的注射器末端。等待分析仪吸取所需样本后，移开注射器。让仪器完成血气分析并显示结果。
   2. 根据分析结果调整呼吸机参数，以维持 pH 在 7.35–7.45 之间，二氧化碳分压（PCO2）在 35–45 mmHg 之间，氧分压（PaO2）在 80–150 mmHg 之间。具体设置因呼吸机型号而异，但主要通过调节相应旋钮增加或减少呼吸频率，以纠正低氧血症和/或高碳酸血症。
4. 采集 3 mL 血液至浅绿色试管（含锂肝素）。在 4 ˚C 条件下，以 2000 ×g 离心 15 分钟，分离血浆。离心完成后，可立即使用床旁生化分析仪检测血清肌酐水平，或在 -80 ˚C 保存以备后续分析。
5. 使用直肠探头温度计持续监测体温，并调节加热垫温度，使仔猪体温维持在 101 至 103 ˚F 之间。

7. 实验组；盲肠结扎穿刺（CLP） ^25,28,29

注意：对于实验组的仔猪，进行盲肠结扎穿刺术（CLP）以诱导多微生物性脓毒症²⁸，并在术后监测动物12小时，以确保有足够时间发展为重度脓毒症。经皮肾小球滤过率（GFR）记录从盲肠结扎后8小时开始，以保证4小时的记录时长。

1. 使用手术刀在左侧做一条5-6 cm的旁正中纵向切口，因为猪的盲肠位于左侧腰窝区域³⁰。逐层分离腹壁组织，注意避免损伤浅表腹壁血管。
2. 切开腹膜层后，使用牵开器以改善对腹腔内结构的暴露和操作视野。
3. 在腹腔左上象限识别螺旋结肠。沿螺旋结肠向尾侧和背侧追踪，以定位盲肠。可见回肠在盲肠基底部与螺旋结肠相连。
4. 在回盲交界处远端稍远处结扎盲肠（图1）。
5. 使用18 G针头在盲肠壁上刺出七个穿孔，并将粪便挤入腹膜腔内。
6. 使用3.0丝线逐层缝合腹腔，可采用单纯间断或连续缝合方式。如有条件，皮肤层也可使用皮肤缝合器闭合。

8. 假手术组

1. 按照上述步骤 7.2-7.4 进行操作。确定盲肠后，将其原样放回，以相同方式关闭腹壁。
2. 对假手术组的仔猪监测 12 小时，以消除因长时间暴露于麻醉而可能产生的混杂偏倚。

9. 经皮GFR检测装置的设置

1. 结扎盲肠 8 小时后，准备开始经皮测量肾小球滤过率（GFR）。
2. 使用 MB 服务软件 3.0 版本调整 GFR 设备的采样速率。简要步骤如下：通过 USB 连接线将经皮 GFR 设备连接至计算机软件，打开软件，点击 连接，并将时间设置为 4000 毫秒。点击 写入 以保存设置。
   注意：此设置可提供最长 6 小时的总采样时间。在猪模型中，经皮 GFR 测量在 4 小时内完成。对于需要长达 12 小时采样的实验，应选择 8000 毫秒选项。
3. 将带有透明窗口的双面粘性贴片安装到设备上。将设备固定在一侧，确保发光二极管位于透明窗口上方，以便检测示踪剂。
4. 剃除胸侧壁对应区域的毛发。将电池连接至设备，并立即将带设备的粘性贴片贴附到位，确保牢固固定（图 2）。由于仔猪处于深度麻醉状态，通常无需使用胶带固定设备。
   注意：仅靠粘性贴片已足够固定。然而，在动物可能被操作、活动或麻醉状态可能受影响的实验过程中，使用胶带固定可能至关重要。包扎敷料也可作为替代方案³¹。
5. 在给予 FITC-锡司他林（FITC-sinistrin）前，需进行 3–5 分钟的基线记录。

10. FITC-辛丝汀的制备与注射

1. 将FITC-辛丝特林与生理盐水溶液配制成终浓度为50 mg/mL的混合液。给予仔猪的剂量为20 mg/kg。FITC-辛丝特林以粉末形式提供。
   注意：FITC-辛丝特林也可通过耳静脉插入的外周静脉导管给药。为达到较高的峰值浓度，必须通过股静脉导管以快速推注的方式给予FITC-辛丝特林。
2. 将装有药物的注射器连接至三通阀的一侧，另一侧连接生理盐水冲洗液。推注FITC-辛丝特林后，立即给予5 mL生理盐水快速推注，然后关闭通向仔猪静脉的三通阀。

11. 经皮GFR记录

1. 将设备连接在仔猪身上持续 4 小时。在此期间，使用浓度为 20 mg/kg 的 α-氯醛糖间歇给药，保持仔猪处于麻醉状态，以避免产生任何运动伪影。
2. 4 小时结束后，取下设备并立即断开电池连接。

12. 肾小球滤过率（GFR）测量

1. 使用供应商提供的 USB 连接线将经皮肾小球滤过率（GFR）设备连接到计算机。
2. 打开读取软件以从设备中获取数据。依次点击连接、读取、重命名和保存，以保存原始数据。根据说明书中的指示，在分析软件中处理并评估已保存的数据。
3. 简要步骤如下：打开软件版本 3.0 并导入数据。使用自动标记调整偏移量、起始和结束位置。如有必要，去除伪影，然后点击拟合。该操作将输出显示荧光素异硫氰酸酯-西尼司丁（FITC-sinistrin）清除时间（t1/2，单位为分钟）的结果。随后根据以下公式计算经皮肾小球滤过率（tGFR）^32,32：
   
   注意：根据与制造商的协商，猪所使用的换算系数为 20（表示细胞外液空间占体重的 20%），而大鼠为 21.33（tGFR 单位为 mL/min），小鼠为 14,616.8（tGFR 单位为 µL/min）。这是因为肾小球滤过率是基于细胞外液量进行准确测量的^34,35，而细胞外液量又与体重相关³⁶。

13. 猪仔安乐死

1. 在CLP术后12小时采集3 mL血液，用于进一步的生化分析。
2. 通过静脉注射每公斤体重0.2 mL的预混20%戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液，处死仔猪。
3. 在将仔猪送至太平间之前，取右侧肾脏用于组织病理学研究。

结果

在本节中，我们首次展示了在新生仔猪中使用经皮肾小球滤过率（GFR）检测所获得的代表性数据。我们采用了盲肠结扎穿刺模型，该模型此前已被证明可导致肾功能下降²⁸。因此，我们假设在CLP仔猪中会出现与急性肾损伤（AKI）相对应的GFR急性下降，并且经皮GFR检测设备应能通过延长的清除时间（t_1/2）检测到这一变化，从而验证该设备在猪模型中的适用性。实验共纳入7只雄性仔猪，其中假手术组3只，脓毒症组4只。两组动物体重相近（图3A）。如预期所示²⁸，脓毒症12小时后，血清C反应蛋白（CRP）水平升高，CRP是菌血症和脓毒症的标志物（图3B）。图中展示了假手术组与脓毒症组仔猪典型的FITC-司尼司丁清除曲线（图4 A,B），通过将假手术组与脓毒症组曲线叠加，可直观显示AKI情况（图...

讨论

本文介绍了在使用机械通气的麻醉新生猪模型中，利用微型经皮肾小球滤过率（GFR）监测仪和荧光素标记的西尼司丁（FITC-sinistrin）测定猪肾脏功能的实用步骤。先前的研究已在啮齿类动物中建立了实验性经皮GFR检测方案^11,12,14，但目前尚无适用于猪的相应方案。

近年来，人们致力于探索替代性动物模型，以攻克难治性疾病并减轻人类肾脏疾病的负担。然而，由于体型、解剖结构和生理学上的差异，许多此类方法在转化应用中存在局限性。啮齿类动物的肾脏解剖结构和病理生理学特征与人类存在显著差异³⁷。由于猪与人类在解剖和功能特征上具有相似性，猪模型可能更适合作为人类疾病的病理生理学模型^38,39。目前，猪已广泛用于阐明疾病机制及药物研发。随着猪基因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-氯醛糖	Sigma-Aldrich	C0128-25G	用于维持麻醉
黑色编织丝线  3-0	Surgical Specialties	SP117	用于血管牵引和结扎的丝线
离心机 AccuSpin 8C	Fischer Scientific	75-008-821	用于从全血样本中提取血浆
3.0 型无套囊气管插管	Progressive Medical International	1109021995	经气管造口插入
FITC-肾素 1.0 g	MediBeacon Inc.	FTCF S001	室温保存并避光
GEM Premier 3000 血气分析仪	Instrumentation Laboratory	5700	用于床旁血气分析
中号加热垫 20 英寸 × 29 英寸	Adroit Medical Systems	V029	连接至热疗泵
HTP-热疗泵	Adroit Medical Systems	HTP	可根据需要设定温度
IDEXX Catalyst One	IDEXX Laboratories	89-92525-00	用于血浆肌酐分析
侵入性血压导管 3.5Fr	Millar	SPR-524	插入股动脉
带流量调节器的静脉输液器	True Care	TCRTCBINF033G	用于连接静脉输液袋与静脉导管
氯胺酮	Covetrus	68317	用于麻醉诱导
MediBeacon 分析软件 3.0 版	MediBeacon Inc.	N/A	用于分析数据以获得肾素清除率半衰期和曲线
Millex-GV 注射器滤器 0.22 µm	Millipore Sigma	SLGVR33RS	用于氯醛糖注射的注射器滤器
新生儿/婴儿呼吸机	Sechrist Millennium	20409	连接气源，通过气管插管提供通气
苯巴比妥钠 + 苯妥英钠（Euthasol）	Covetrus	72934	用于安乐死
乳酸林格液 500 mL 袋装	Baxter	2B2323Q	用于维持性液体输注
无菌手套	Henry Schein	104-5920	手术操作者使用
无菌手术衣	Halyard Health	95021	手术操作者使用
无菌巾	Medline	42131704	用作手术铺巾以维持无菌区域
3-0 丝线反向切割针缝合线	Ethicon	NC1842168	用于缝合腹壁各层
经皮微型肾小球滤过率监测仪	MediBeacon Inc.	TDM004	包装内含电池和 USB 连接器
经皮监测仪粘性贴片	MediBeacon Inc.	PTC-SM001	肾小球滤过率探头用双面粘性贴片
脐带绳 1/8 英寸 × 20 码	Fisher Scientific	NC9303017	用于固定气管插管
静脉导管 PE/5 规格	Micro medical tubing	BB31695	用于股静脉插管
赛拉嗪	Covetrus	61035	用于麻醉诱导