量化肽类物质对真菌的抗真菌活性 白色念珠菌

摘要

本方案描述了一种获取肽类及其他化合物（如小分子抗真菌剂）对白色念珠菌（Candida albicans）抗真菌活性定量数据的方法。该方法采用光密度测定而非菌落形成单位计数来量化生长抑制，节省了时间和资源。

摘要

传统的白色念珠菌（Candida albicans）抗真菌药物敏感性检测方法耗时较长，且缺乏定量结果。例如，一种常用方法是将经不同浓度抗真菌分子处理的细胞接种于琼脂平板上，随后通过计数菌落来确定分子浓度与生长抑制之间的关系。该方法需要使用大量平板，并耗费大量时间进行菌落计数。另一种常用方法则省去平板培养和菌落计数步骤，通过肉眼观察经抗真菌试剂处理的培养物，以确定抑制生长所需的最低浓度；然而，这种方法仅能提供定性结果，且会丢失亚抑制浓度下的生长信息。本实验方案描述了一种用于测定白色念珠菌（C. albicans）对抗真菌肽敏感性的方法。该方法基于培养物的光密度测定，可减少获得不同肽浓度下定量生长数据所需的时间和材料。真菌与肽的孵育在96孔板中进行，使用适当的缓冲液，并设置无生长抑制和完全生长抑制的对照组。肽处理孵育后，将所得的细胞悬液稀释以降低肽的活性，随后过夜培养。过夜培养后，测定每孔的光密度，并与阳性和阴性对照比较，以计算各肽浓度下的生长抑制率。本检测方法所得结果与传统的琼脂平板培养法结果相当，但本方案减少了塑料废弃物的产生以及菌落计数所耗费的时间。尽管本方案的应用目前主要集中于抗真菌肽，但该方法同样适用于测试其他已知或疑似具有抗真菌活性的分子。

引言

Candida albicans 是人类微生物群的一员，可定植于多个部位，包括口腔、皮肤、胃肠道和阴道¹。对于因人类免疫缺陷病毒（HIV）等疾病或免疫抑制治疗而导致免疫功能受损的患者，C. albicans 的定植可能引发局部或全身性念珠菌病^2,3。目前可用的小分子抗真菌药物（如两性霉素B、唑类或棘白菌素类）在使用中可能因溶解度、毒性问题以及病原体对药物产生耐药性而受到限制^4,5。由于现有抗真菌药物存在局限性，研究人员正不断寻找能够有效对抗 C. albicans 的新型抗真菌分子。

抗菌肽（AMPs）是现有小分子抗真菌药物的一种潜在替代方案^6,7,8 并且据推测，与小分子药物相比，其产生耐药性的可能性较低⁹AMPs 是一类多样化的多肽，通常带有正电荷，具有广谱的活性^10,11,12具有抗活性的AMPs C. albicans 包括组蛋白家族和天蚕素家族中的知名肽类^13,14,15，以及最近报道的肽类，如 ToAP2、NDBP-5.7 和组蛋白 5 变体 K11R-K17R^16,17. 由于其在治疗方面的潜力 假丝酵母 感染，识别并设计靶向的新型抗菌肽（AMPs） 白色念珠菌 是许多研究团队的重要目标。

作为开发靶向 C. albicans 的有效抗菌肽（AMPs）及其他抗真菌剂过程的一部分，通常采用体外（in vitro）测试来鉴定具有潜力的肽类。测试抗 C. albicans 活性的方法通常包括在96孔板中将细胞与AMPs（溶于缓冲液或培养基中）的系列稀释液共同孵育。孵育后有多种方法可用于评估抗真菌活性。美国临床实验室标准协会（Clinical Laboratory Standards Institute）描述的一种技术通过肉眼观察孔内浊度，确定完全抑制生长所需的最低浓度（MIC）（对于某些特定抗真菌药物如唑类和棘白菌素类，则以至少50%抑制率为标准），但该方法无法对低于MIC浓度下的生长情况进行定量¹⁸。另一种常用方法是在与AMPs孵育后，将各孔内容物接种至琼脂平板，经孵育后计数平板上的菌落形成单位（CFUs）以量化细胞活性。该方法已被用于评估多种肽的活性，包括组蛋白5（histatin 5）衍生肽、LL-37和人乳铁蛋白^19,20,21。然而，该技术需要大量琼脂和较多平板，且需耗时耗力地人工计数CFUs。为了在减少塑料废弃物并避免CFU计数的同时获得更定量的结果，可将各孔内容物接种至另一块96孔板中的新鲜培养基中。在对新接种的孔板进行孵育后，可通过吸光度酶标仪测定600 nm处的光密度（OD₆₀₀）来定量生长情况。该方法已被用于测定组蛋白5及其降解片段、穿膜肽等的抗真菌活性^{17,22,23,24,25}。

本方案描述了如何检测肽类的抗真菌活性，并采用OD₆₀₀法对肽作用后白色念珠菌（C. albicans）活力的降低程度进行定量分析。

方案

已获得马里兰大学帕克分校机构生物安全委员会（IBC）对开展以下工作的批准 C. albicans 在此方案（PN 274）中。 C. albicans 菌株 SC5314（参见 材料表在本研究中使用了）；然而，也可使用其他任何菌株。

1. 缓冲液、无菌水和培养基的制备

1. 制备无菌的 0.1 M 磷酸钠缓冲液（NaPB）²⁶，pH 7.4，然后用无菌水稀释至 2 mM 和 1 mM。为本方案的大多数应用，各制备 100 mL 的 2 mM NaPB 和 1 mM NaPB 已完全足够。
2. 制备无菌液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD，参见材料表）培养基（10 g/L 酵母提取物，20 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨）。为本方案的大多数应用，制备 100 mL YPD 培养基已完全足够。
3. 制备无菌超纯水。为本方案的大多数应用，制备 100 mL 水已完全足够。
   ​注意：缓冲液、培养基和水通过高压灭菌器在 121 °C 液体循环条件下，根据容器中液体体积进行适当时间的灭菌²⁷。例如，对于含有 500 mL 液体的瓶子，灭菌时间应为 40 分钟。

2. 接种、培养与传代培养 C. albicans

警告：操作白色念珠菌（C. albicans）时，须遵守所有机构和政府的相关规定。学术研究机构通常将白色念珠菌归类为生物安全等级（BSL）2级微生物，无论其耐药性如何；而美国典型培养物保藏中心（ATCC）则根据菌株的耐药性将其归类为BSL1或BSL2级微生物²⁸。

注意：接种和培养步骤（步骤 2.1–2.2）应在开始抗真菌活性检测的前一天进行。如有可能，所有涉及细胞的实验步骤（以及将与细胞共同孵育的溶液）均应在生物安全柜中操作。

1. 将所需的 C. albicans 菌株接种至装有 10 mL YPD 培养基的培养管中。
   注意：培养物可来自冻存菌种或琼脂平板，但所有需相互比较的数据必须使用一致的接种来源。
2. 在 30 °C、230 rpm 条件下，于旋转摇床中培养过夜（约 12–16 小时）。
3. 将过夜培养的 C. albicans 进行转接培养，并生长至 OD₆₀₀ 约为 1.0–1.2。
   1. 使用紫外分光光度计（参见材料表）测定过夜培养物的 OD₆₀₀。
   2. 根据过夜培养物的 OD₆₀₀ 值，将其接种至 10 mL YPD 培养基中，使转接培养物的初始 OD₆₀₀ 为 0.1。
   3. 在 30 °C、230 rpm 条件下，于旋转摇床中继续培养转接培养物，直至 OD₆₀₀ 达到约 1.0–1.2，此过程通常需要 4–6 小时。在转接培养物生长期间，同步完成步骤 3（肽溶液的制备）；在步骤 4 中，该转接培养物将被稀释后用于检测。

3. 在96孔板中制备肽溶液

注意：如果肽段储备液在储存期间稳定，此步骤可预先进行。通常将肽段溶液保存在 −20 °C 直至使用。进行下一步操作前，可在室温水浴中解冻。

1. 确定每种待测肽在实验中的最高浓度。该浓度取决于所选肽的种类。在代表性结果部分展示的数据中，测试了组蛋白5及其工程化类似物²²，所用最高浓度为50 µM。
   注意：待测最高浓度应根据文献报道的数据或通过在较宽肽浓度范围内进行预实验来确定。在可能的情况下，应选择足够高的浓度，以确保在最高浓度下观察到活力完全抑制的平台期，同时在最低浓度下观察到无活力抑制的平台期，从而能够量化肽活性的完整范围。
2. 将每种肽溶于无菌水中，配制成目标最高浓度的两倍浓度溶液。在代表性结果部分展示的数据中，组蛋白5及其工程化类似物以100 µM的浓度配制，每种取150 µL溶于无菌水中。
   注意：如果肽在水中不溶解，则可能需要在本步骤前使用其他溶剂进行溶解。二甲基亚砜（DMSO）常用于高浓度溶解肽，之后再稀释至工作浓度。需确保DMSO的终浓度不超过1%（v/v）²⁹，并确认所用替代溶剂不会影响细胞生长。此外，在步骤3.4–3.5中，所有孔中的溶剂浓度应保持一致。
3. 将所需肽储备液各40 µL加入96孔圆底培养板的每行第一孔（第1列）中（参见材料表）。此板为第1板（图1）。
   注意：每块板包含八行，用于肽的测试。这些行可用于不同肽的测试，也可用于同一种肽的重复实验。每行仅加入一种肽。
4. 向含有肽的各行列2至列12中各加入20 µL无菌超纯水（图1）。
   注意：如果在步骤3.2中肽储备液使用了非纯水的溶剂，则本步骤中的无菌水应替换为与肽储备液中相同的溶剂。例如，若肽使用DMSO溶解，且肽储备液为含1%（v/v）DMSO的水溶液，则应在第2至第12列中加入含1% DMSO的水溶液。
5. 在板上对肽储备液进行连续倍比稀释至第10列（图1）。
   注意：除按以下方式在板内直接进行连续稀释外，也可先在微量离心管中完成稀释，再转移至96孔板。
   1. 从第1列中移取20 µL至第2列，通过反复吹吸混匀。此时第2列含有40 µL肽溶液，其浓度为第1列浓度的1:2稀释。
   2. 从第2列中移取20 µL至第3列，通过反复吹吸混匀，使第3列含有40 µL肽溶液，其浓度为第1列浓度的1:4稀释。
   3. 重复此过程，直至第10列含有40 µL肽溶液，其浓度为第1列浓度的1:512稀释。
   4. 从第10列中移除20 µL肽溶液并弃去。此时每列均含有20 µL肽溶液（第1–10列）或水（第11和第12列）。
      ​注意：第11列的孔作为无菌对照，第12列的孔作为不含肽的对照。

4. 稀释 C. albicans 传代培养

注意：在亚培养物的 OD₆₀₀ 达到约 1.0–1.2 后（步骤 2.3.3），开始此步骤。

1. 将亚培养物转移至15 mL离心管中，在室温下以3,900 × g 离心3分钟，使细胞沉淀。通过移液或倾倒去除上清液。
2. 用1 mL 2 mM NaPB（步骤1.1）重悬沉淀，并将悬浮液转移至1.7 mL离心管中。
3. 再次离心收集细胞（同步骤4.1），弃去上清液，然后用1 mL 2 mM NaPB重新悬浮沉淀。
4. 重复步骤4.3共额外两次，最终使洗涤后的细胞悬浮于1 mL 2 mM NaPB中。
5. 测定洗涤后悬浮液的细胞密度，并计算将细胞密度调整至5 × 10⁵ 个细胞/mL所需的稀释倍数。该浓度最终可确保向96孔板的每孔中加入1 × 10⁴ 个细胞。
   注意：可通过多种方法测定悬浮液的细胞密度，包括血细胞计数板或自动细胞计数仪。本研究采用目标菌株在相关培养条件下生长时的细胞密度与OD₆₀₀的标准曲线。该标准曲线通过血细胞计数板（见材料表）测定不同OD₆₀₀值悬浮液的细胞密度而建立。
6. 用2 mM NaPB将细胞悬浮液稀释至5 × 10⁵ 个细胞/mL。制备10 mL该稀释后的悬浮液足以完成本实验。

5. 孵育 C. albicans 用多肽溶液处理细胞并制备细胞用于活力定量分析

1. 将稀释后的 C. albicans 悬液（步骤 4.6）20 µL 加入每行的第 1–10 列和第 12 列（图 1）。
   注意：此时第一列中的多肽终浓度为多肽储备液浓度的一半。在本研究中，此处的多肽终浓度为 50 µM。每个孔中的细胞悬液终浓度为 2.5 × 10⁵ 个细胞/mL。第 1–10 列作为实验孔，用于评估不同多肽浓度下的抗真菌活性，第 12 列作为无多肽的生长对照孔。
2. 向第 11 列加入 20 µL 的 2 mM NaPB。此时所有孔中的 NaPB 终浓度均为 1 mM。第 11 列作为无菌对照孔。
3. 盖好 1 号板（含细胞和多肽），在 30 °C 下孵育 30 分钟。
   注意：对于许多多肽而言，30 分钟的孵育时间已足够^17,21,22,30，但若需考虑某些多肽可能需要更长时间才能发挥抗真菌活性，可将孵育时间延长至 60 分钟^25,31,32。
4. 准备一个新的 96 孔培养板（2 号板），用于检测细胞活力（图 2）。
   注意：应在 1 号板孵育期间准备该培养板。
   1. 向该板的所有孔中加入 100 µL YPD（步骤 1.2）。
   2. 向该板的所有孔中加入 100 µL 2 mM NaPB（步骤 1.1）。
5. 稀释 1 号板（含细胞和多肽）中的样品，并转移至 2 号板（含培养基和缓冲液）。
   1. 在 30 分钟孵育结束后，从孵育箱中取出 1 号板。
   2. 通过向 1 号板的每个孔中加入 280 µL 1 mM NaPB（步骤 1.1），使每孔总体积达到 320 µL（图 2）。
   3. 使用移液器反复吹打所有含细胞和多肽的孔，充分混匀，确保所有细胞重新悬浮，且孔底无可见沉淀细胞。
   4. 从 1 号板的每个孔中转移 8 µL 至 2 号板的对应孔中。此体积可将每个 1 号板孔中的约 250 个细胞转移至 2 号板（图 2）。
6. 盖好 2 号板，置于微孔板摇床（见材料表）上，在 30 °C、350 rpm 条件下孵育 17 小时。

图1：制备多肽系列稀释液与细胞共孵育的1号板。 将多肽用水进行系列稀释，并将 C. albicans 细胞加入1号板中。蓝色表示孔中含有多肽，灰色表示孔中只有水而无多肽。含有细胞的孔以黑色圆点图案标示。完成上述步骤后，将该板进行孵育，以使多肽发挥其抗真菌活性。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：制备平板 2 以定量分析肽对细胞活力的抑制作用。 向平板 2 中加入 YPD 培养基和 NaPB 缓冲液。将平板 1 中各孔内容物进行稀释后，取等分试样从平板 1 转移至平板 2。随后孵育平板 2，使其中存活的细胞生长，以便通过测定 OD₆₀₀ 来进行定量分析。在平板 2 中，仅含有 YPD 和 NaPB 的孔以橙色表示；含有来自平板 1 的等分试样并与 YPD 和 NaPB 混合的孔以绿色表示。有关平板 1 上颜色的说明，请参见 图 1 图注。 请点击此处查看该图的放大版本。

6. 抗真菌活性的测定

1. 获取2号板中每个孔的OD₆₀₀读数。
   1. 在培养17小时后，从培养箱中取出2号板。
   2. 通过上下吹打混匀2号板中所有孔，确保所有细胞重新悬浮，且孔底部无可见沉淀细胞。
      注意：此步骤中应避免产生气泡，因为气泡可能干扰OD₆₀₀读数。若产生气泡，通常可用干燥的移液器吸头戳破，或使用两个移液器吸头将气泡从孔中挑出。
   3. 使用吸光度酶标仪（见材料表），在600 nm波长下测定每个孔的OD₆₀₀值。
2. 计算生长抑制率（以百分比表示），并作图以确定多肽对白色念珠菌（C. albicans）生长的影响。
   1. 针对每个孔，使用以下公式计算相对于对照组的活力降低百分比^17,22,23：
      
      其中OD_{with peptide}表示含有特定浓度多肽的孔的OD₆₀₀值，OD_background表示同一行第11列的OD₆₀₀值（不含细胞的对照），以及
      OD_{no peptide}表示同一行第12列的OD₆₀₀值（含细胞但不含多肽的对照）。
   2. 例如，使用以下表达式根据B行的OD₆₀₀值计算B5孔的活力降低率：
      
3. 绘制活力降低率随多肽浓度变化的曲线图。

结果

使用OD₆₀₀测量值来量化抗真菌肽对真菌生长抑制的程度，相比接种样品并计数菌落形成单位（CFU），可显著节省时间。本方案所述方法需在三个不同的日期完成相应步骤。第一天约需1小时准备缓冲液和培养基（不包括灭菌时间），并接种白色念珠菌（C. albicans）起始培养物，进行过夜培养。第二天需5至6小时（包括传代培养时间），用于制备96孔板，并进行17小时的培养。第三天的步骤可在1小时以内完成。其中涉及收集细胞活力定量数据的部分仅需约30分钟操作时间（另加17小时培养时间）。相比之下，将每个96孔板的内容物在琼脂平板上接种并计数单个重复的CFU，需耗时超过3小时（另加24小时培养时间），因此本方案在完成活力定量方面可节省超过2.5小时。若实验中需要使用多个96孔板，所节省的时间将成倍增加。

本实验方案用于检测组蛋白5及其若干赖氨酸残基修饰变体的抗真菌活性。在第5步将多肽与C. albicans细胞孵育后，采用菌落形成单位（CFU）计数法和本方案所述结合OD₆₀₀测定的方法对抗真菌活性进行定量（

讨论

本方案描述了一种高效获取抗菌肽（AMPs）对真菌病原体C. albicans抗真菌活性定量数据的方法。测试肽类及其他抗真菌试剂的一种常见替代方法是采用美国临床实验室标准协会（CLSI）标准M27¹⁸中所述的肉汤微量稀释法，但该标准侧重于获得定性的视觉结果，而非定量结果。另一种替代方法是使用与本方案类似的方法制备肽类，将其与细胞共孵育，然后将孔内内容物涂布于琼脂平板上，通过计数菌落形成单位（CFU）来量化肽类的作用效果。如代表性结果部分所述，本方案中采用OD₆₀₀测定细胞生长，相比涂布平板并计数CFU的方法显著减少了实验耗时。此外，无需将孔内液体涂布于琼脂平板，也减少了肽类活性检测过程中产生的塑料废弃物量。

该方案的成功依赖于多个关键因素。由于许多阳离子抗菌肽在生理盐浓度条件下进行测定时活性较差， 体外^8,32,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板（圆底）	VWR	10062-902
吸光度微孔板读数仪	N/A	N/A	任何可用的微孔板读板仪均可满足要求
C. albicans 菌株 SC5314	ATCC	MYA-2876	其他 C. albicans 也可用于
血细胞计数板	N/A	N/A	可用于制作细胞数量与OD之间的标准曲线600
微孔板振荡器	VWR	2620-926
肽（多肽）	N/A	N/A	多肽可由任何可靠的供应商进行商业合成；纯度应达到 ≥建议进行95%的三氟乙酸盐去除并转化为盐酸盐
多通道移液器用试剂储液槽	VWR	18900-320	使用多通道移液器简化向多孔板中的移液操作
磷酸氢二钠	Fisher Scientific	BP332-500	用于制备 NaPB
磷酸二氢钠	Fisher Scientific	BP329-500	用于配制 NaPB
紫外分光光度计	N/A	N/A	任何可用的紫外分光光度计均可满足要求
YPD 培养基粉末	BD生命科学	242820	也可由酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖制成