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小鼠模型在转变过程中的应用 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程

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DOI：

10.3791/64419

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2022年9月28日

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1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University School of Medicine, 3Graduate Program in Immunology, Tufts Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Translational Medicine, Lund University, 5Stuart B. Levy Center for the Integrated Management of Antimicrobial Resistance, Tufts University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种新型小鼠模型，用于研究肺炎链球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病性病原体的过程。该模型可轻松适用于研究疾病进展不同阶段以及多种宿主中多微生物与宿主-病原体之间的相互作用。

摘要

Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）在大多数个体中是鼻咽部的无症状定植菌，但在甲型流感病毒（IAV）感染后可发展为肺部及全身性致病菌。高龄会增加宿主对继发性肺炎链球菌肺炎的易感性，并与更严重的疾病结局相关。驱动这些过程的宿主因素尚不明确，部分原因在于缺乏能够模拟从无症状定植向严重临床疾病转变的动物模型。

本文描述了一种新型小鼠模型，可重现肺炎链球菌在病毒感染后从无症状定植向疾病状态转变的过程。在该模型中，首先通过鼻内接种在小鼠体内建立由生物膜状态生长的肺炎链球菌的无症状定植，随后对鼻咽部和肺部进行流感病毒（IAV）感染。这会导致细菌向肺部播散、引发肺部炎症，并出现明显的疾病症状，且病情可进展至死亡。疾病的严重程度取决于细菌菌株和宿主因素。

重要的是，该模型能够重现衰老相关的易感性，因为与年轻小鼠相比，老年小鼠表现出更严重的临床疾病，并更频繁地死于该病。通过将定植与发病过程分为不同的阶段，并提供分析病原体和宿主双方遗传变异的机会，这种肺炎链球菌（S. pneumoniae）与流感病毒（IAV）共感染模型可实现对重要致病共生菌在疾病进展不同阶段与宿主相互作用的详细研究。该模型还可作为识别易感宿主中继发性肺炎链球菌性肺炎潜在治疗靶点的重要工具。

引言

Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）是一种革兰氏阳性细菌，通常无症状地定植于大多数健康个体的鼻咽部1,2。在尚未完全明确的因素促进下，肺炎链球菌可从鼻咽部的良性定植者转变为病原体，并扩散至其他器官，引发包括中耳炎、肺炎和菌血症在内的严重感染3。肺炎链球菌疾病的临床表现部分取决于菌株特异性差异，例如基于荚膜多糖组成的血清型。迄今为止已鉴定出100多种血清型，其中某些血清型与更具侵袭性的感染相关4,5。此外，还有多种其他因素会增加患肺炎链球菌疾病的风险。其中一个因素是病毒感染，例如甲型流感病毒（IAV）可使肺炎链球菌性肺炎的风险增加100倍6,7。历史上，S. pneumoniae 是流感后继发性细菌性肺炎最常见的病原体之一，且与更差的临床预后相关8。另一个主要危险因素是高龄。事实上，S. pneumoniae 是65岁以上老年人社区获得性细菌性肺炎的首要病因9,10。老年人占肺炎和流感所致死亡病例的大多数（>75%），表明衰老与IAV感染这两种危险因素协同作用，显著增加疾病易感性11,12,13,14。然而，病毒感染如何促使肺炎链球菌从无症状定植者转变为侵袭性病原体，以及宿主因素如何影响这一过程，目前仍不甚清楚。这主要是由于缺乏一种能够模拟从无症状肺炎链球菌定植进展为严重临床疾病的啮齿类动物模型。

共感染研究传统上采用在流感感染7天后直接将肺炎链球菌接种至小鼠肺部的模型15,16。该模型可重现继发性细菌性肺炎的易感状态，非常适合研究抗病毒免疫反应如何损害抗菌防御机制17。然而，人类的纵向研究表明，鼻咽部的肺炎链球菌定植（细菌可在该部位形成无症状的生物膜18）普遍与侵袭性疾病相关19,20。来自中耳、肺部和血液感染的细菌分离株在基因上与鼻咽部发现的菌株完全相同20。因此，为了研究流感病毒感染后从无症状定植向侵袭性疾病转变的过程，已建立一种小鼠模型：先经鼻腔给予生物膜生长的肺炎链球菌，随后进行鼻咽部流感病毒感染21,22。上呼吸道病毒感染导致宿主环境发生改变，促使肺炎链球菌从生物膜中播散并扩散至下呼吸道21。这些播散的细菌上调了对感染至关重要的毒力因子表达，从而由定植菌转变为致病菌21。这些观察结果突显了病毒、宿主与细菌之间复杂的相互作用，并表明病毒感染引发的宿主变化直接影响肺炎链球菌的行为，进而改变细菌感染的进程。然而，该模型未能重现人类中观察到的严重疾病症状，可能是因为病毒局限于鼻腔，无法模拟病毒感染对宿主免疫系统和肺组织损伤的全身性影响。

我们近期建立了一个模型，该模型不仅包含了宿主与病原体之间复杂的相互作用，而且更接近于人类中观察到的疾病严重程度23。在此模型中，首先通过鼻内接种以生物膜形式培养的肺炎链球菌使小鼠建立无症状定植，随后对鼻咽部和肺部进行流感病毒（IAV）感染。该过程导致细菌扩散至肺部，引发肺部炎症，并在部分年轻小鼠中进展为致死性疾病23。此前的研究表明，病毒和细菌感染均会改变宿主防御功能：病毒感染促进细菌扩散，而先前的细菌定植则削弱了宿主控制肺部IAV水平的能力23。对免疫应答的分析显示，IAV感染降低了中性粒细胞的抗菌活性，而细菌定植则抑制了对抗病毒防御至关重要的I型干扰素反应23。重要的是，该模型再现了衰老个体易感性的特征。与年轻小鼠相比，老年小鼠出现疾病征象更早，临床病症更为严重，且感染后死亡频率更高23。本论文所展示的工作表明，疾病的严重程度还取决于细菌菌株类型，因为侵袭性肺炎链球菌菌株在IAV感染后表现出更高效的扩散能力，肺部炎症表现更为明显，并且相较于非侵袭性菌株，疾病进展速度更快。因此，这一 S. pneumoniae/IAV 共感染模型可用于详细研究病原体和宿主因素，非常适合在疾病进展的不同阶段分析多微生物感染的免疫应答。

方案

所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。所有实验程序均获得纽约州立大学布法罗分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 准备化学成分明确的培养基（CDM）

  1. 按以下步骤制备储备液：
    1. 将 表 1 中列出的混合物 I 化合物溶于 100 mL 超纯水中，边搅拌边溶解。分装为 200 µL 每份，于 −20 °C 保存。
    2. 将 表 1 中列出的混合物 II 化合物溶于 20 mL 0.1 M NaOH 溶液中，边搅拌边溶解。分装为 100 µL 每份，于 −20 °C 保存。
    3. 将 表 1 中列出的混合物 III 化合物溶于 1 mL 超纯水中，边搅拌边溶解。分装为 10 µL 每份，于 4 °C 保存。
    4. 将 表 1 中列出的混合物 IV 化合物溶于 1 mL 超纯水中，边搅拌边溶解。分装为 10 µL 每份，于 −20 °C 保存。
    5. 将 表 2 中列出的化合物先溶于 15 mL 超纯水中，边搅拌边溶解。用几滴 0.1 M NaOH 将 pH 调至 7.0，并用超纯水定容至 20 mL。分装为 1 mL 每份，于 −20 °C 保存。
    6. 将 表 3 中列出的化合物加入 90 mL 超纯水中，在 50 °C 的加热板上边搅拌边溶解。用 0.1 M NaOH 将 pH 调至 7.0，然后用超纯水定容至 100 mL。分装为 5 mL 每份，于 −20 °C 保存。
  2. 每次新鲜配制起始储备液：将 表 4 中列出的化合物溶于 70 mL 超纯水中，边搅拌边溶解。
  3. 向新鲜的起始储备液中依次加入以下混合储备液：200 µL 混合物 I 储备液（表 1）、80 µL 混合物 II 储备液（表 1）、10 µL 混合物 III 储备液（表 1）、10 µL 混合物 IV 储备液（表 2）、1 mL 维生素储备液（表 3）以及 5 mL 氨基酸储备液（表 4）。
  4. 加入所有储备液后，向烧杯中加入 30 mL 超纯水，将最终体积调至 100 mL。
  5. 使用 表 4 中列出的化合物对化学成分明确培养基（CDM）进行补充。充分混匀后，过滤除菌，并于 4 °C 保存，最多保存 2 周。

2. 培养S. pneumoniae 生物膜

  1. 将445 mL RPMI 1640培养基与50 mL热灭活的胎牛血清（FBS）以及5 mL青霉素/链霉素溶液（浓度分别为10,000 U/mL和10,000 µg/mL）混合，配制RP-10培养基。
  2. 培养 NCI-H292（H292）黏液表皮样癌细胞系。将一支购得的冻存细胞悬液加入含5 mL RP-10培养基的T-25组织培养处理过的培养瓶中。于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 培养3-5天至100%汇合。
  3. 在光学显微镜下使用10倍物镜观察细胞，评估汇合度。
    注意：当所有细胞均与其他细胞接触且细胞之间无间隙时，即达到所需的100%汇合度。
  4. 用5 mL室温的PBS洗涤细胞2次。确保缓冲液不含钙离子，以避免在后续步骤中螯合EDTA。
  5. 向培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 孵育5-10分钟，直至细胞脱落。加入4 mL RP-10培养基中和。用移液器轻轻吹打混匀，转移至50 mL锥形管中。
  6. 每孔加入 500 µL 细胞悬液至经组织培养处理的 24 孔板中。从一个融合的 T-25 培养瓶中，预计可获得 2 × 106-4 × 106 细胞/毫升
  7. 次日，在光学显微镜下观察细胞，确保其汇合度达到步骤2.3中的状态。若未达到，则继续孵育更长时间。
  8. 当H292细胞在24孔板中达到100%汇合时，用1 mL室温PBS轻柔洗涤细胞3次，以确保去除残留的含抗生素培养基或碎片。
  9. 洗涤细胞后，每孔加入 250 µL 的 4% 多聚甲醛以固定细胞。冰上孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。
  10. 细胞固定前一晚，划线接种 S. pneumoniae 在血琼脂平板上划线接种目标菌株，并于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜2.
    注意：此处展示的数据基于以下条件 S. pneumoniae 获得的菌株 通过 协作交流：血清型19F中耳炎分离株EF303024，经典血清型2艾弗里菌株D3925，以及血清型4的菌血症分离株TIGR426. 这些菌株也可从文中引用的公共保藏中心获得 材料表.
  11. 在20 mL CDM中加入100 µL Oxyrase（30 U/mL），配制含Oxyrase（0.15 U/mL）的CDM。
    注意：Oxyrase 用于去除氧气，以促进高效生长 S. pneumoniae 在液体培养基中培养27.
  12. 从平板中接种细菌至新鲜的CDM + oxyrase培养基中：加入1 mL CDM + oxyrase溶液，用1 mL移液器枪头侧面轻轻刮取平板上的细菌菌落，注意避免刮到琼脂。或者，使用接种环挑取细菌，并接种至含有1 mL CDM + oxyrase的离心管中。
  13. 将细菌在含Oxyrase的CDM中稀释至起始OD600 0.05。
  14. 在37 °C、5% CO₂条件下，将细菌培养于松盖的50 mL锥形管中2 直到 OD600 当OD值达到0.2时（此过程需要2-5小时）。检查OD600 每小时检测一次，以确保OD值不超过0.2。
  15. 当OD达到0.2时，涡旋混匀细菌培养管。取0.5 mL菌液接种至固定的H292细胞中，并向每孔加入另外0.5 mL CDM + oxyrase培养基。在未接种细菌的对照孔中加入1 mL CDM + oxyrase培养基。将培养板于34 °C、5% CO₂条件下孵育48 h。2.
    注意：在 34 °C 下培养可更接近模拟鼻咽部的较低温度21.
  16. 每12小时，在初次接种后轻轻移除0.5 mL培养基，并补充0.5 mL新鲜CDM + Oxyrase。操作时注意不要破坏正在形成的生物膜。观察培养板底部是否有生物膜形成，并随着培养时间的延长注意观察因生物膜生长导致的浑浊度逐渐增加。为防止污染，需同时检测不含细菌的孔，确保对照孔保持澄清。
  17. 接种后48小时，移除上清液，用1 mL PBS 轻柔洗涤两次。加入1 mL新鲜CDM重悬菌体，剧烈吹打混匀以剥离生物膜。针对每种细菌菌株，将所有孔中的菌液汇集至一个50 mL锥形管中，通过轻轻反复倒置紧盖的锥形管数次，充分混匀。
  18. 向50 mL离心管中加入等体积的CDM配制的40%甘油，使菌液终浓度为20%甘油。将1 mL分装至微量离心管中，干冰上速冻后于−80 °C保存。
  19. 使用前，将一份样品在冰上解冻，于1,700 × g离心试管，对细菌进行计数。 g 5分钟，弃上清，将沉淀重悬于1 mL PBS中，并在血琼脂平板上接种系列稀释液28.
  20. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下将琼脂平板培养过夜2 在相应稀释度下计数菌落，以获得以菌落形成单位（CFU）/mL表示的细菌浓度。
    ​注意：建议在细菌冻存至少一天或更长时间后进行计数，因为在冻存后的最初24小时内细菌活力会有所下降。冻存的分装样品可用于后续小鼠感染实验，但最长不超过2个月。

3. 采用生物膜培养的细菌经鼻腔接种小鼠 S. pneumoniae

  1. 购买小鼠并在所需年龄时使用。
    注意：为模拟年轻宿主，建议使用3-4月龄的小鼠；为模拟老年人群，可使用21-24月龄的小鼠，以代表年龄>65岁者29。本文所展示的数据均使用C57BL/6雄性小鼠。
  2. 将生物膜培养的细菌分装样品置于冰上解冻，于1,700 × g 离心5分钟。小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀物；用1 mL PBS重悬沉淀以洗涤细菌，再次于1,700 × g 离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于所需体积的缓冲液中，以达到目标浓度（鼻内接种建议浓度为5 × 106 CFU/10 µL）。通过将制备好的接种物接种至血琼脂平板（如步骤2.19所述），确认实际给予的细菌数量。
  3. 通过移液将稀释后的接种物各5 µL滴入小鼠双侧鼻孔，进行鼻内接种，总剂量为5 × 106 CFU。操作时应牢固固定小鼠并稳定其头部，直至液体完全吸入（通常在滴加后数秒内完成）。此步骤应在无麻醉状态下进行，以防止接种物发生肺部吸入。

4. 使用甲型流感病毒（IAV）进行病毒感染

  1. 鼻腔接种后48小时 S. pneumoniae将感兴趣的流感病毒（IAV）毒株置于冰上解冻。
    注意：此处展示的数据使用获得的小鼠适应性甲型流感病毒 A/PR/8/34 H1N1 毒株 通过 协作交流30.
  2. 病毒解冻后，用 PBS 将病毒稀释至所需浓度；气管感染建议使用 20 PFU/50 µL，鼻腔感染建议使用 200 PFU/10 µL。对于假感染组和仅细菌感染组，使用 PBS 接种小鼠。
  3. 在小鼠麻醉前，于其眼部涂抹眼用润滑剂。使用 5% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过牢固的足趾夹捏确认麻醉效果。
  4. 动物麻醉后，立即将其从异氟烷麻醉舱中取出，并使用钝头镊子将舌头拉出口腔，通过气管内滴注50 µL（20 PFU）的IAV，对麻醉小鼠进行感染。
  5. 将小鼠放入单独的笼子中，并持续观察直至完全恢复（能够维持胸卧位，即能够胸部朝下直立躺卧）。
  6. 恢复后，立即采用3.3步骤中的接种方法，通过鼻内接种方式给予小鼠10 µL（200 PFU）的IAV。
  7. 将接受过单一或双重细菌和病毒感染且感染类型相同的家鼠按感染组别分开，并与其他组别分离。

5. 监测小鼠的疾病症状

  1. 至少连续10天每天观察小鼠，并根据以下标准盲法评估其发病症状：
    1. 根据体重减轻程度评分：0 = 5%或以下；1 = 5%-10%；2 = 10%-15%；3 = 20%或以上。当体重减轻评分为3时，采用CO2吸入法对小鼠实施安乐死。
    2. 根据活动能力评分：0 = 正常/活跃；1 = 可移动但略有减弱；2 = 减弱；3 = 明显减弱/嗜睡（仅在触碰时移动）；4 = 昏迷/不动。当活动能力评分为3时，对小鼠实施安乐死。
    3. 根据姿势评分：0 = 无弓背（正常）；1 = 轻度弓背；2 = 严重弓背。当姿势评分为2时，对小鼠实施安乐死。
    4. 根据眼部情况评分：0 = 正常；1 = 突出；1 = 凹陷；1 = 闭合；1 = 分泌物。可多项合并。将各项得分相加得到最终眼部评分。
    5. 根据呼吸情况评分：0 = 呼吸正常；1 = 呼吸不规则或改变（频率升高或降低）；2 = 呼吸困难（呼吸费力或喘息）。当呼吸评分为2时，对小鼠实施安乐死。
  2. 根据上述标准，将各项评分相加，得到总临床评分，范围为健康（0）至极重度疾病（15）。总评分超过2的小鼠视为患病。对总评分超过9或达到任一单项指标安乐死标准的小鼠实施人道安乐死，并在生存曲线中标记。

6. 感染组织的处理与细菌计数

  1. 流感病毒感染后 48 小时，对小鼠实施安乐死。
  2. 将小鼠置于仰卧位。用 70% 乙醇喷洒小鼠胸部和腹部以清洁毛发。用镊子夹住小鼠腹部中线处的毛发和皮肤，用 4.5 英寸解剖剪剪开毛发，暴露从肝脏至胸部的区域。
  3. 血液采集
    1. 用解剖剪轻轻切开腹腔，暴露肝脏。用镊子暴露位于肝脏顶部靠近膈肌处的门静脉。用解剖剪剪断门静脉。当血液开始在腹腔内积聚时，使用微量移液器采集 10 µL 血液，加入含有 90 µL 抗凝剂溶液（PBS 中含 50 mM EDTA）的微量离心管中，用于后续细菌载量测定。
    2. 使用 P-1000 微量移液器收集其余血液，置于血液采集管中，在 7,600 × g 条件下离心 2 分钟以收集血清。将血清分装至微量离心管中，于 −80 °C 保存，用于后续任何所需细胞因子或代谢物的分析。
  4. 肺组织采集
    1. 用解剖剪沿暴露的肋骨两侧剪开，并轻轻将肋骨向上提起以暴露心脏。将连接有 10 mL 注射器（预先装满 PBS）的 25 G 针头插入右心室，开始缓慢灌注。观察肺组织是否变白，以判断灌注是否成功。灌注过程应缓慢进行，避免破坏肺组织。
    2. 用镊子提起心脏，剪断以分离肺和心脏。分离后，用镊子夹取全部肺叶，在盛有无菌 PBS 的培养皿中冲洗以去除残留血液。在培养皿中将肺组织剪碎成小块并充分混匀。取一半肺组织匀浆用于测定细菌 CFU 或病毒 PFU，并将其转移至预先加入 0.5 mL PBS 的圆底 15 mL 管中，用于后续匀浆处理。
      注意：不应从同一肺的不同肺叶分别取样进行不同检测。所有肺叶应剪碎后充分混合，再均等分装用于各项检测。
    3. 取另一半肺组织用于流式细胞术分析（见下文第 7 节），将其放入未经组织培养处理的 24 孔板中，每孔预先加入 0.5 mL RP-10 培养基。置于室温下待后续处理。
  5. 鼻咽部组织采集
    1. 在颈部使用解剖剪去除毛发，再剪除肌肉组织，暴露气管。
      注意：气管是位于肌肉下方的管状结构。
    2. 用小镊子在距小鼠下颌 1 cm 处置于气管下方以固定气管。用解剖剪在气管前壁轻轻剪开一个 0.1 cm 的切口，注意避免完全切断气管。
    3. 准备一支 1 mL 注射器，内含 0.5 mL PBS，并连接一段 0.58 mm 的导管和 25 G 针头。将导管经气管向上插入鼻咽部进行鼻腔灌洗。当导管进入鼻腔遇到阻力时，在小鼠鼻孔处放置一个微量离心管，缓慢将 PBS 经气管灌入，以收集鼻腔灌洗液。
    4. 将小鼠置于俯卧位。用乙醇喷洒小鼠头部。使用解剖剪剪除头部毛发和触须垫，暴露颅骨。
    5. 用解剖剪在下颌两侧及两眼之间剪开约 1 cm 的切口。用镊子缓慢将面部骨骼从身体上剥离，以暴露鼻腔。
    6. 用镊子轻轻取出鼻腔组织，放入预先加入 0.5 mL PBS 的圆底管中，用于后续匀浆处理。
  6. 为匀浆所采集的组织，首先用 70% 乙醇清洗匀浆探头，并以 60% 功率开启匀浆仪 30 秒。随后在无菌水中重复清洗 10 秒。每份组织匀浆 1 分钟。每次处理不同样本之间，用无菌水清洗匀浆探头；每处理不同器官或样本组之间，需在新鲜的 70% 乙醇管中清洗探头。
  7. 细菌数量计数
    1. 所有器官采集并匀浆后，将系列稀释液接种于血琼脂平板上。为计算总 CFU，使用 10 µL 样本进行涂布，并记录每份样本的最终体积（mL）。将鼻咽部样本接种于添加 3 µg/mL 庆大霉素的血琼脂平板上，以选择性促进S. pneumoniae生长，同时抑制其他定植微生物的生长。于 37 °C、5% CO2条件下过夜培养。
    2. 为计数肺和鼻咽部的细菌 CFU，首先统计血琼脂平板上的菌落数。然后使用公式（1）和公式（2）计算每毫升含量及总数。
      每毫升含量 = 菌落数 × 稀释倍数 × 100   （1）
      总数 = 每毫升含量 × 每份样本总体积   （2）
      注意：在公式（1）中，乘以 100 是因为涂布量为 10 µL，相当于 1 mL 的 100 倍稀释。公式（2）中的每份样本总体积来自步骤 6.7.1，由此得出检测下限为每器官 100。
    3. 为计数菌血症中的细菌 CFU，首先统计血琼脂平板上的菌落数。然后使用公式（3）计算每毫升血液中的细菌数量。
      每毫升血液中的数量 = 菌落数 × 稀释倍数 × 100 × 10   （3）
      注意：在公式（3）中，乘以 100 是因为涂布量为 10 µL，相当于 1 mL 的 100 倍稀释；乘以 10 是因为血液在抗凝剂中进行了 1:10 稀释。由此得出检测下限为 1,000/mL。

7. 肺组织样本的流式细胞术处理

  1. 按如下步骤准备所需培养基：
    1. 按照步骤 2.1 中所述方法制备 RP-10。
    2. 通过将 RP-10 与 2 mg/mL 胶原酶和 30 µL/mL DNase I 混合，制备消化缓冲液。
    3. 将 8.29 g NH4Cl、1 g NaHCO3 和 0.038 g EDTA 溶解于 1 L H2O 中，制备裂解缓冲液。
    4. 将 450 mL HBSS 与 50 mL 热灭活 FBS 和 5 g 叠氮化钠混合，制备 10x FACS 缓冲液。
    5. 将 50 mL 10x FACS 缓冲液用 450 mL HBSS 稀释，制备 1x FACS 缓冲液。
  2. 取步骤 6.4.3 中的肺组织样本，置于 24 孔板中。每孔加入 500 µL 消化缓冲液。在 37 °C/5% CO2 条件下孵育 45 分钟至 1 小时。
  3. 为每个样本预先在 50 mL 锥形管中加入 5 mL RP-10。孵育结束后，在 50 mL 锥形管顶部放置一个 100 µm 滤器，并用 1 mL RP-10 润湿滤器。
  4. 使用 P-1000 移液器将消化后的肺组织转移至滤器上。用 3 mL 注射器的活塞碾压组织。每次用 1 mL RP-10 冲洗 2 次。
  5. 在 4 °C、327 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 裂解缓冲液中。静置 3 分钟以裂解红细胞。加入 5 mL RP-10 中和反应。
  6. 在 4 °C、327 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL RP-10 中，取 10 µL 进行细胞计数。
  7. 在 4 °C、327 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 RP-10 中，调整细胞浓度至 2 × 106–4 × 106 个细胞/mL。将每个样本 60 µL 加入 96 孔板中，用于对步骤 7.9、表 5 和 表 6 中列出的目标细胞类型进行染色23。
  8. 在 4 °C、327 × g 条件下离心 5 分钟。
  9. 同时，使用目标抗体制备抗体主混合液、荧光减一对照（FMOs）和单染对照。为染色嗜中性粒细胞（PMNs）、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和 T 细胞，请使用 表 5 和 表 6 中列出的抗体及其最终稀释比例。每孔抗体混合液体积为 100 µL。根据表格中列出的稀释比例，确定所需主混合液及各单个抗体的体积。
  10. 离心结束后（步骤 7.8），弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL 抗体混合液、FMOs 或单染对照中，冰上避光孵育 30 分钟。
  11. 向孔中加入 150 µL FACS 缓冲液，洗涤细胞 2 次，每次在 4 °C、327 × g 条件下离心 5 分钟。
  12. 离心结束后，弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL 固定缓冲液中，冰上孵育 20 分钟。
  13. 向孔中加入 150 µL FACS 缓冲液，洗涤细胞 2 次，每次在 4 °C、327 × g 条件下离心 5 分钟。
  14. 在标记好的 FACS 管中加入 200 µL FACS 缓冲液。将沉淀重悬于 150 µL FACS 缓冲液中。使用 100 µm 滤器将每个样本分别过滤至对应的 FACS 管中。保持样本在冰上或 4 °C，并避光保存，直至进行分析。
  15. 使用流式细胞仪分析细胞。

8. 用于计数IAV的噬斑实验

  1. 按如下步骤准备所需培养基：
    1. 在37 °C下边搅拌边将2.5 g牛血清白蛋白（BSA）溶解于40 mL DMEM中，持续10–20分钟直至完全溶解，然后将该溶液过滤除菌后加入460 mL DMEM中。
    2. 将1.2 mg微晶纤维素溶解于50 mL H2O中，配制成2.4%微晶纤维素溶液。在液体程序下高压灭菌，并于室温保存。
    3. 在37 °C下边搅拌边将2.5 g BSA溶解于40 mL DMEM中，持续10–20分钟；再加入剩余的10 mL DMEM，最终体积为50 mL，配制成含5% BSA的DMEM。过滤除菌后于4 °C保存。
    4. 将1 mL 5% BSA DMEM与9 mL 2× MEM混合，配制成2× MEM/0.5% BSA。
    5. 将2.4%微晶纤维素溶液与2× MEM/0.5% BSA按1:1比例混合，并加入终浓度为1 mg/mL的TPCK（糜蛋白酶抑制剂）胰蛋白酶，配制成低黏度覆盖培养基。
    6. 将450 mL Eagle's最低必需培养基（EMEM）与50 mL热灭活胎牛血清（FBS）混合，配制成EMEM/10% FBS。
  2. 培养Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞系。将一支购买的细胞冻存管中的细胞接种至T-25组织培养处理过的培养瓶中，加入5 mL EMEM/10% FBS。在37 °C、5% CO2条件下培养3–5天，直至细胞达到100%汇合度。参照步骤2.3检查细胞汇合情况。
  3. 移除并弃去培养液，用5 mL室温PBS冲洗2次。向培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育10–15分钟，直至细胞脱落。细胞脱落后，加入4 mL EMEM/10% FBS中和，获得浓度为2 × 105 个细胞/mL的细胞悬液。
  4. 在进行空斑实验前一天，向12孔组织培养处理过的培养板中每孔加入1 mL重悬的MDCK细胞（即每孔2 × 105 个细胞）进行接种。
    注意：确保细胞在使用前达到100%汇合度；若未达到，应延长培养时间。
  5. 作为标准品，使用步骤8.1.1中列出的感染培养基对已知滴度的IAV病毒原液进行10倍系列稀释（106–101），每种稀释度配制1.2 mL，用于三复孔检测。
  6. 将组织匀浆样品置于冰上解冻。在台式离心机中以2,000 × g离心，收集澄清的上清液。
  7. 重复步骤8.5，但使用步骤8.6中样品的上清液进行操作。
  8. 吸除细胞培养液，用1 mL PBS洗涤2次，以彻底去除FBS。
  9. 从最高稀释度到最低稀释度，依次将每种标准品稀释液或样品系列稀释液300 µL轻柔地沿孔壁加入各孔中，每种条件设三复孔。
  10. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中，每10分钟轻轻摇动一次，共持续50分钟。确保培养板平放于培养箱内，不要叠放。
  11. 50分钟后，用1 mL PBS洗涤细胞2次。
  12. 除最低稀释度孔和无病毒对照孔外，向其余各孔加入2 mL低黏度覆盖培养基；向最低稀释度孔和无病毒对照孔中加入感染培养基和胰蛋白酶。
  13. 将培养板重新放回37 °C、5% CO2培养箱中孵育2–4天，直至形成肉眼可见的空斑。
  14. 从孔侧快速加入2 mL PBS进行洗涤，并轻轻振荡，使沉淀的低黏度覆盖培养基重新悬浮。
  15. 用移液器轻柔地吸除孔中全部液体。
  16. 每孔再用2 mL PBS重复洗涤一次，然后用移液器轻柔地吸除全部液体。
  17. 为固定空斑，向每孔加入500 µL 4%多聚甲醛，轻轻振荡后静置30分钟。
  18. 沿孔壁缓慢加入1 mL PBS进行洗涤，然后轻柔地吸除液体。
  19. 向每孔加入500 µL 1%结晶紫溶液（用水稀释），覆盖细胞单层，孵育5分钟。
  20. 用1 mL自来水洗涤，确保通过轻柔移液彻底去除孔中所有液体。将培养板倒置放在吸水垫上，过夜干燥。
  21. 肉眼计数空斑数量，并使用任意可用的成像设备保存图像。

结果

生物膜培养的 S. 肺炎链球菌 (图1A) 用于感染小鼠（图1B）使用一个小的 10 µL 通过鼻腔接种未麻醉小鼠。这种小体积接种物可实现稳定的肺炎链球菌定植，且局限于鼻咽部。图2A，+sp 组）的同时避免系统性扩散（图 2B，C，+sp组）。鼻腔接种后两天，小鼠感染小鼠适应性甲型H1N1流感病毒A/PR/8/34（IAV）22,30 通过鼻内和气管内途径给药，以实现向鼻咽部和肺部稳定递送特定剂量23.

在此，利用该模型比较了经鼻腔接种不同毒株后小鼠病毒感染所致疾病进程的差异 S. pneumoniae， 包括TIGR4和D39，这两种为侵袭性菌株，可导致肺炎并发展为菌血症，以及EF3030，这是一种中耳炎菌株21,24,25,26,31疾病的临床表现 S. pneumoniae/IAV 共感染小鼠的病情严重程度取决于细菌菌株（图2）。尽管鼻咽部细菌数量无显著差异（图 2A在任何菌株之间均未发现显著差异， S. pneumoniae TIGR4 和 D39 在流感病毒感染后 48 小时扩散至肺部，而 EF3030 则未见扩散图2B）。40% 的小鼠通过鼻内感染 S. pneumoniae TIGR4 表现出向肺部的细菌播散，其中一半出现菌血症（图2C)，与先前的研究结果一致23.

经鼻内感染 S. pneumoniae D39 的小鼠表现出更有效的播散，因为共感染小鼠中有 100% 出现细菌向肺部扩散（图 2B）。与 S. pneumoniae TIGR4 相似，其中一半小鼠出现菌血症（图 2C）。在总体生存率监测中，无论细菌菌株如何，所有测试菌株的共感染小鼠生存率均显著低于仅感染 S. pneumoniae 的单感染小鼠（图 2D）。与仅感染 IAV 的对照组小鼠相比，经鼻内感染 S. pneumoniae TIGR4 和 D39 的小鼠（但 EF3030 除外）疾病进展速度加快。在 IAV 感染后第 2 天，30%（D39）和 20%（TIGR4）的小鼠已死亡，而仅感染 IAV 的对照组小鼠直到感染后第 5 天才开始出现死亡（图 2D）。共感染 S. pneumoniae EF3030 与 IAV 的小鼠症状出现较晚，更接近仅感染 IAV 的对照组（图 2D）。这些结果表明，该共感染模型可在年轻健康小鼠中引发依赖于细菌菌株的疾病，因此非常适合用于探究疾病进展各阶段所需的细菌因子。

该模型用于评估流感病毒（IAV）感染后小鼠肺部中多种免疫细胞的存在情况（细胞类型及设门策略见图3），这些小鼠经鼻接种了不同菌株的S. pneumoniae。在IAV感染后，D39和TIGR4菌株扩散至肺部，引起循环来源的炎性免疫细胞（如中性粒细胞（PMNs）和单核细胞）浸润显著高于基线水平（未感染状态），而EF3030菌株则无此效应（图4A-C）。单独IAV感染可显著增加参与抗病毒宿主防御的免疫细胞（如NK细胞和γδ T细胞）的浸润（图4A-C）。然而，在病毒攻击前经鼻感染S. pneumoniae的小鼠中，这些抗病毒反应显著减弱（图4A-C）。这一结果与先前关于细胞因子反应的研究一致，后者发现S. pneumoniae定植会抑制I型干扰素的产生，并损害宿主控制肺部IAV载量的能力23。这些发现表明，该共感染模型可用于研究单一致病微生物感染与多微生物感染中免疫反应的变化。

该模型还被用于评估衰老对小鼠鼻内感染 S. pneumoniae TIGR4 后流感病毒感染病程的影响。在单次感染的小鼠中，年轻组与老龄组之间的病毒滴度无显著差异（图 5A）23。与既往研究结果一致23，老年小鼠表现出比年轻小鼠更早且显著更严重的疾病症状，临床评分更高（图 5B）。与疾病症状相符，接种 S. pneumoniae 的老年小鼠在流感病毒感染后 24 小时内开始更快死亡，且全部死于该疾病；而年轻对照组的存活率显著更高（33%）（图 5C）。这些结果表明，共感染模型可用于检测易感宿主中更严重的疾病表现，因此非常适合用于探索决定宿主对共感染具有抗性或易感性的宿主因素。

动物感染方案：肺炎链球菌定植、IAV感染、流式细胞术示意图。
图1：共感染时间线及器官处理流程，用于评估免疫细胞浸润和病原体负荷。（A）Streptococcus pneumoniae 在生物膜中培养。（B）小鼠通过鼻内接种 5 × 106 CFU 的指定生物膜培养的 S. pneumoniae 菌株，以建立鼻咽部定植，或不予处理作为对照。48 小时后，小鼠或经 PBS 假处理，或通过鼻内给予 200 PFU 甲型流感病毒 PR8 株，并经气管内给予 20 PFU。随后定期监测小鼠的临床疾病评分和存活情况。（C）在 IAV 感染后 48 小时，检测不同器官中的细菌 CFU 或病毒 PFU，或肺部免疫细胞浸润情况。缩写：CFU = 菌落形成单位；PFU = 斑块形成单位；IAV = 甲型流感病毒 PR8 株；IT = 气管内；NP = 鼻咽部。请点击此处查看该图的放大版本。

鼻咽、肺、菌血症CFU柱状图；细菌感染分析的生存曲线。
图2：流感病毒双途径鼻内/气管内感染 S. pneumoniae-接种小鼠后会导致细菌扩散和疾病，其严重程度取决于细菌菌株。 10至12周龄雄性C57BL/6（B6）小鼠按如下方法感染 图1. （细菌数量在A鼻咽部，(B）肺，以及（C在流感病毒感染后48小时测定所有血液指标。B,C) 百分比表示出现扩散现象的小鼠所占的比例。 (D感染IAV后监测10天的存活情况。合并数据来自（A,B) n = 5，(C) n = 11，以及(D每组 n = 6 只小鼠。每个圆圈代表一只小鼠，虚线表示检测限。A-C）*，表示存在显著差异（p < 由Kruskal-Wallis检验确定，各指定组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。(D）*，表示存在显著差异（p < 0.05），通过log-rank（Mantel-Cox）检验确定。缩写：+sp = 仅通过指定菌株经鼻内感染细菌的小鼠；Co-inf = 经流感病毒（IAV）感染的细菌感染小鼠；IAV = 接受甲型流感病毒的小鼠；CFU = 菌落形成单位。 请点击此处以查看此图的放大版本。

免疫细胞分析的流式细胞术图解；散点图显示CD标志物和细胞类型。
图3免疫细胞设门策略 肺组织被取出后，通过流式细胞术测定免疫细胞浸润情况。图中展示了不同细胞类型的代表性设门策略。ACD45+，活的单个细胞被设门并分析其百分比（B) 中性粒细胞（Ly6G+，CD11b+），巨噬细胞（Ly6G-，Ly6C-，F480+）和单核细胞（Ly6G-，Ly6C+), (C) 树突状细胞（Ly6G-，CD11c+）以及NK细胞（NK1.1+，CD3-), (DTCR- γδ 与 CD8（CD8+TCRβ+）和 CD4（CD4+TCRβ+) T细胞被确定。缩写：SSC-A = 侧向散射-峰面积；FSC-A = 前向散射-峰面积；FSC-H = 前向散射-峰高度；SSC-W = 侧向散射-峰宽度；L/D = 活/死；FMO = 荧光减一；NK = 自然杀伤细胞；PMN = 多形核白细胞；DC = 树突状细胞；TCR = T细胞受体。 请点击此处以查看此图的放大版本。

使用流式细胞术进行细胞分析；包括免疫细胞亚群的热图、点图和柱状图。
图 4：肺部免疫反应依赖于细菌菌株。 年轻（10–12 周龄）雄性 C57BL/6 小鼠分别设置为未感染组、单独接种指定 Streptococcus pneumoniae 菌株组（+sp）、单独感染 IAV 组（IAV）或 S. pneumoniae 与 IAV 共感染组（Co-inf）。在 IAV 感染后 48 小时（参见图 1中的实验设计），采集肺组织，并依据图 3中的设门策略通过流式细胞术测定免疫细胞浸润情况。（A）热图显示了各处理组中 CD45 设门内每种指定细胞类型的平均百分比。（B）各小鼠组中不同处理间存在显著差异的细胞类型代表性点图。（C）所示为指定免疫细胞类型的百分比，每个圆圈代表一只小鼠。（A、C）显示的数据为每组 n = 5 只小鼠的合并结果。* 表示共感染组与未感染组之间差异显著（p < 0.05）；$ 表示 IAV 组与未感染组之间差异显著；# 表示共感染组与单独 IAV 感染组之间差异显著。各细胞类型在不同处理组间的显著差异通过单因素方差分析（ANOVA）后接 Tukey 检验确定。缩写：NK = 自然杀伤细胞；PMN = 多形核白细胞；DC = 树突状细胞；TCR = T 细胞受体；IAV = 甲型流感病毒。请点击此处查看该图的高清版本。

肺部感染图表；病毒载量、症状评分、年轻与老年受试者的生存率
图5衰老与宿主对IAV易感性的增加Streptococcus pneumoniae 共感染 年轻的（10–12 周）和老龄的（21–22 个月）C57BL/6 雄性小鼠被共同感染 S. pneumoniae TIGR4 经鼻接种和流感病毒经鼻及经气管接种（如文中所述） 图1）或单独用IAV攻击。A48 小时后测定病毒滴度。星号表示统计学显著性（p < 0.05），由Student's t检验确定 t-检验。数据来自每组 n = 4 只小鼠的合并结果。（B临床评分和（C) 存活情况随时间进行监测。B) 数据为每组 n = 6 只小鼠的均值 ± 标准误（SEM）。星号表示统计学显著性（p < 0.05），由Mann-Whitney检验确定在指定时间点年轻小鼠与年老小鼠之间的差异。 (C数据来自每组 n = 6 只小鼠的合并结果。星号表示统计学显著性（p < 年轻小鼠与老年小鼠之间的差异无统计学意义（P > 0.05），经log-rank（Mantel-Cox）检验确定。缩写：IAV = 流感A病毒；i.n. = 经鼻腔；i.t. = 经气管；SEM = 均值标准误。 图 5A 经Joma等人许可转载23. 请点击此处查看此图的放大版本。

CDM 的 I 型混合储备液
腺嘌呤0.1 g
D-丙氨酸0.25 g
CaCl2 无水的0.025 g
硫酸锰0.03 g
氰钴胺100 µL 10 mg/mL 储存液
对氨基苯甲酸400 µL 5 mg/mL 储备液
Pyridoxamine 2HCl100 µL 10 mg/mL 储存液
CDM 培养基的 Mix II 储存液
鸟嘌呤0.05 g
尿嘧啶0.05 g
CDM 培养基 III 号储备液的配制
九水合硝酸铁2O50 mg/mL
七水合硫酸铁2O10 mg/mL
混合CDM的IV号储备液
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸25 mg/mL

表1：CDM中混合物I、II、III和IV的储备液。 缩写：CDM = 化学成分明确的培养基。

化学成分明确培养基用维生素混合储备液
盐酸吡哆醛0.8 g
硫胺素 Cl20.4 g
核黄素0.4 g
泛酸钙0.4 g
生物素0.04 g
叶酸0.4 g
烟酰胺0.4 g

表2：CDM的维生素混合储备液。 缩写：CDM = 化学成分明确的培养基。

化学成分明确培养基用氨基酸母液
L-丙氨酸0.480 g
L-精氨酸0.250 g
L-天冬酰胺0.700 g
L-天冬氨酸0.600 g
L-半胱氨酸1.000 g
L-胱氨酸0.100 g
L-谷氨酸0.200 g
L-谷氨酰胺0.780 g
L-甘氨酸0.350 g
L-组氨酸0.300 g
L-异亮氨酸0.430 g
L-亮氨酸0.950 g
L-赖氨酸0.880 g
L-甲硫氨酸0.250 g
L-苯丙氨酸0.550 g
L-脯氨酸1.350 g
L-丝氨酸0.680 g
L-苏氨酸0.450 g
L-色氨酸0.100 g
L-缬氨酸0.650 g

表3：化学成分明确培养基（CDM）的氨基酸储备液。 缩写：CDM = 化学成分明确培养基。

CDM起始储备液
葡萄糖1.0 g
七水合硫酸镁0.070 g
磷酸氢二钾0.02 g
磷酸二氢钾0.1 g
无水乙酸钠0.45 g
碳酸氢钠0.25 g
磷酸氢二钠0.735 g
磷酸二氢钠0.32 g
CDM终末添加物
氯化胆碱0.1 g
L-半胱氨酸盐酸盐0.075 g
碳酸氢钠0.25 g

表4：化学成分明确培养基（CDM）的起始储备液和终末添加成分。 缩写：CDM = 化学成分明确培养基。

抗体/荧光染料克隆号稀释倍数
UV 激发用活死染料不适用0.38888889
Ly6G AF 4881A80.25
CD11b APCM1/700.25
CD11c PEN4180.18055556
小鼠 Fc 封闭抗体2.4G20.11111111
F4/80 PE Cy7BM80.18055556
Ly6C BV605AL-210.25
CD103 BV 421M2900.18055556
CD45 APC-eF-78030-F110.18055556

表5：抗体组合1。

抗体/荧光染料克隆号稀释倍数
用于紫外激发的活力染料N/A0.388888889
TCR-β APC Cy7H57-5970.180555556
CD4 V450（太平洋蓝）RM4-50.25
CD8 BV65053-6.70.180555556
小鼠 Fc 封闭抗体2.4G20.111111111
CD45 PE30-F110.180555556
CD3 AF488145-2C110.180555556
TCR-γΔ APCGL-30.180555556
NK1.1 AF700PK1360.180555556

表6：抗体组合2。

讨论

目前大多数关于 S. pneumoniae/IAV 共感染的实验研究依赖于将细菌接种至已预先感染 IAV 的小鼠肺部。这些模型有助于识别肺部微环境及全身免疫反应的变化，从而揭示宿主对继发性细菌感染易感的原因15,16,17,32,33,34,35,36,37。然而，这些模型未能模拟 S. pneumoniae 从无症状定植者转变为可引起严重肺部及全身感染的致病菌的过程。此外，这些模型不适用于研究上呼吸道中影响感染易感性的宿主因素及宿主-病原体相互作用。先前一种关于流感病毒感染后肺炎链球菌从鼻咽部迁移至肺部的模型，依赖于先进行细菌鼻咽部感染，再进行病毒感染。但该模型未能重现人类患者中观察到的严重疾病症状21。本文所述的改良小鼠感染模型成功再现了 S. pneumoniae 从无症状携带状态转变为引发严重临床疾病的致病菌的全过程。

该模型的关键步骤是在鼻咽部建立S. pneumoniae感染。Streptococcus pneumoniae可形成生物膜，并以不同的效率定植于鼻咽部21,38。为了建立稳定的感染，目前测试的生物膜培养细菌菌株至少需要5 × 106 CFU 23。建议在进行病毒感染前，先测试任何新的细菌菌株是否能在鼻咽部稳定感染。对于病毒共感染，先前的研究发现，流感病毒A（IAV）的鼻内感染是细菌从鼻咽部扩散所必需的21,22,23。在这些前期研究中，鼻内递送使用了500 PFU的IAV，而在本研究中，200 PFU已足以增加鼻咽部的细菌数量。IAV感染不仅局限于上呼吸道，还可扩散至肺部39,40，这对于使肺部环境更有利于细菌感染至关重要15,16,41。将IAV递送至肺部可通过鼻内给药或气管内注射麻醉小鼠实现。以往在BALB/cByJ小鼠中的研究发现，鼻内给药可导致病毒性肺炎21；然而，在C57BL/6小鼠中，鼻内接种后接种物进入肺部的通路更为受限。在C57BL/6小鼠中，需通过气管内注射才能实现病毒的稳定递送23。在该模型中，先前的细菌定植会加速病毒感染后疾病症状的出现23。由于病毒感染本身即可引起疾病症状，并可能存在动力学上的差异，因此建议首先测试任何新病毒株的不同剂量范围，并选择一个能够在共感染宿主中显示出加速病程的剂量。

肺脏为此模型中疾病评估的另一项关键指标。可用于评估病原体载量和免疫细胞浸润情况的同一只小鼠的肺组织。然而，由于同一肺叶内不同叶段的感染和炎症严重程度可能存在差异，因此不建议将同侧肺的不同叶段用于不同的检测项目。建议将所有肺叶剪碎成小片段，充分混匀后均分用于各项检测。同样，鼻咽部也可用于细菌CFU或病毒PFU计数以及免疫反应的分析。但单个样本经灌洗和组织处理后获得的细胞数量较少，若不将同组小鼠的样本合并，则难以进行流式细胞术分析。此外，鼻咽部的炎症情况也可通过组织学方法进行评估23。

该模型的一个关键特征是能够重现患者中观察到的临床疾病。在人类中，流感病毒（IAV）感染后继发的肺炎链球菌性肺炎常导致明显的疾病症状，包括咳嗽、呼吸困难、发热和肌肉酸痛，这些症状可能导致住院、呼吸衰竭甚至死亡8,15,42,43。该模型在小鼠中重现了人类临床疾病的严重表现，包括呼吸困难（通过呼吸评分反映）以及整体不适状态（通过姿势和活动评分反映），部分健康的年轻对照组小鼠甚至出现死亡。共感染小鼠中加重的疾病症状可能是由于细菌向肺部播散以及携带肺炎链球菌的小鼠体内病毒清除能力受损所致23。该模型的一个局限性在于，临床疾病的发生率以及细菌从鼻咽部播散的程度在不同小鼠之间存在差异，并受到细菌菌株、宿主年龄和基因型的影响21,22,23。正因如此，对于侵袭性强的菌株，疾病可从局部感染（无可检测的菌血症）迅速进展至死亡，时间短至24小时内。因此，为了准确评估全身性播散，应以更短的时间间隔（每6–12小时）监测菌血症。同样，疾病评分可能迅速变化，尤其是在共感染后的前72小时内。因此，为密切追踪疾病症状，建议在IAV感染后的第1至第3天每天监测小鼠三次。

总之，该模型重现了S. pneumoniae从鼻咽部无症状定植者转变为在甲型流感病毒（IAV）感染后可引起肺部及全身性疾病的病原体的过程。在此模型中，IAV通过改变S. pneumoniae在鼻咽部的细菌行为、促进细菌向肺部扩散以及改变抗菌免疫反应，从而触发其致病性转变23。类似地，细菌定植会削弱抗病毒免疫应答，并损害肺部IAV的清除能力23。这使得该模型非常适合解析单一致病菌感染与多微生物感染中免疫应答的变化。此外，共感染后的疾病进程在一定程度上取决于鼻咽部存在的肺炎链球菌菌株。因此，该模型适用于剖析S. pneumoniae实现无症状定植与致病性转变所需的细菌因子。最后，该模型再现了老龄个体对共感染的易感性；尽管本研究未对此进行测试，但该模型可轻松用于评估宿主遗传背景对疾病进程的影响。总之，将定植与发病划分为独立的阶段，为分析病原体和宿主的遗传变异提供了机会，从而能够详细研究这一重要致病共生菌在疾病进展不同阶段与宿主之间的相互作用。未来，该模型可用于为易感宿主定制治疗方案。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Nick Lenhard 对本文稿的审阅与编辑。我们还感谢 Andrew Camilli 和 Anthony Campagnari 提供细菌菌株，以及 Bruce Davidson 提供病毒菌株。本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金（R21AG071268-01）对 J.L. 的资助，以及美国国立卫生研究院基金（R21AI145370-01A1）、（R01AG068568-01A1）、（R21AG071268-01）对 E.N.B.G. 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-氨基苯甲酸 FisherAAA1267318Mix I 储液
96孔圆底板Greiner Bio-One650101
100 µm 滤器Fisher07-201-432
腺嘌呤FisherAC147440250Mix I 储液
微晶纤维素Fisher501785325微晶纤维素 
BD Cytofix 固定缓冲液 FisherBDB554655固定缓冲液
BD Fortessa流式细胞仪 
BD Intramedic 聚乙烯导管 Fisher427410鼻腔灌洗用导管
BD 带鲁尔锁扣的一次性注射器（1 mL）Fisher14-823-30
BD 毛细血管采血管与BD Microgard封闭装置Fisher02-675-185血液收集管
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸FisherAAJ6233703Mix IV 储液
生物素FisherAC230090010维生素储液
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室#000644本研究使用的小鼠
无水氯化钙Fisher ChemicalC77-500Mix I 储液
CD103 BV 421BD BioscienceBDB562771克隆：M290 DF 1:200
CD11b APCInvitrogen50-112-9622克隆：M1/70，DF 1:300
CD11c PEBD BioscienceBDB565592克隆：N418 DF 1:200
CD3 AF 488BD BioscienceOB153030克隆：145-2C11 DF 1:200
CD4 V450BD HorizonBDB560470克隆：RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780BD Bioscience50-112-9642克隆：30-F11 DF 1:200
CD45 PEInvitrogen50-103-70克隆：30-F11 DF 1:200
CD8α BV 650BD HorizonBDB563234克隆：53-6.7 DF 1:200
氯化胆碱FisherAC110290500CDM 的最终补充物
Corning 一次性真空过滤/储存系统Fisher09-761-107过滤灭菌装置 
Corning 组织培养处理T-25培养瓶Fisher10-126-9
Corning Costar 透明多孔板Fisher07-201-590
Corning 含L-谷氨酰胺和4.5 g/L葡萄糖的DMEM；不含丙酮酸钠FisherMT10017CM
氰钴胺FisherAC405925000Mix I 储液
D39国家典型培养物保藏中心（NCTC）NCTC 7466肺炎链球菌菌株
D-丙氨酸FisherAAA1023114Mix I 储液
D-泛酸钙FisherAC243301000维生素储液
葡萄糖Fisher ChemicalD16-500起始储液
脱氧核糖核酸酶 Worthington Biochemical LS002147
伊格尔最低必需培养基ATCC30-2003
EDTAVWRBDH4616-500G
EF3030美国疾病控制与预防中心 可通过菌株保藏库申请获取肺炎链球菌菌株，通过菌株名称申请
F480 PE Cy7BD Bioscience50-112-9713克隆：BMB DF 1:200
Falcon 50 mL 圆底离心管Fisher14-432-2250 mL 圆底管
Falcon 带盖圆底聚丙烯试管Fisher14-959-11B15 mL 圆底管
Falcon 圆底聚苯乙烯试管（5 mL）Fisher14-959-5FACS 管 
FBSThermofisher10437-028
硝酸铁九水合物FisherI110-100Mix III 储液
Fisherbrand 精细解剖剪刀Fisher08-951-5收获用器械
Fisherbrand 一次性接种环 Fisher22-363-602接种环 
Fisherbrand 解剖组织镊Fisher13-812-38收获用镊子
Fisherbrand Premium 微量离心管：1.5 mLFisher05-408-137微量离心管
Fisherbrand 一次性无菌注射器（10 mL）Fisher14-955-459
叶酸FisherAC216630500维生素储液
Gibco RPMI 1640（ATCC）FisherA1049101
Gibco 无钙无镁DPBSFisher14190250
Gibco 含钙含镁无酚红HBSSFisher14025134
Gibco MEM（Temin改良型）（2倍浓度），无酚红Fisher11-935-046
Gibco 青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Fisher15-140-122
Gibco 台盼蓝溶液，0.4%Fisher15-250-061
Gibco 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Fisher25-200-056
甘油（分析纯ACS认证）FisherG33-4
甘氨酸FisherAA3643530氨基酸储液
鸟嘌呤FisherAAA1202414Mix II 储液
Invitrogen UltraComp eBeads 补偿微球Fisher50-112-9040
七水合硫酸亚铁FisherAAA1517836Mix III 储液
L-丙氨酸FisherAAJ6027918氨基酸储液
L-精氨酸FisherAAA1573814氨基酸储液
L-天冬酰胺FisherAAB2147322氨基酸储液
L-天冬氨酸 FisherAAA1352022氨基酸储液
L-半胱氨酸FisherAAA1043518氨基酸储液
盐酸半胱氨酸一水合物FisherAAA1038914CDM 的最终补充物
L-胱氨酸FisherAAA1376218氨基酸储液
L-谷氨酸 FisherAC156211000氨基酸储液
L-谷氨酰胺FisherO2956-100氨基酸储液
L-组氨酸FisherAC166150250氨基酸储液
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒，适用于紫外激发Invitrogen50-112-1524克隆：N/A DF 1:500
L-异亮氨酸FisherAC166170250氨基酸储液
L-亮氨酸FisherBP385-100氨基酸储液
L-赖氨酸FisherAAJ6222514氨基酸储液
L-蛋氨酸FisherAAA1031822氨基酸储液
低内毒素BSA Sigma AldrichA1470-10G
L-苯丙氨酸FisherAAA1323814氨基酸储液
L-脯氨酸FisherAAA1019922氨基酸储液
L-丝氨酸FisherAC132660250氨基酸储液
L-苏氨酸FisherAC138930250氨基酸储液
L-色氨酸FisherAAA1023014氨基酸储液
L-缬氨酸FisherAAA1272014氨基酸储液
Ly6C BV 605BD BioscienceBDB563011克隆：AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488 BiolegendNC1102120克隆：IA8，DF 1:300
Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞 美国典型培养物保藏中心（ATCC）CCL-34用于PFU分析的MDCK细胞系 
七水合硫酸镁Fisher60-019-68CDM 起始储液
硫酸锰FisherM113-500Mix I 储液
MilQ 水超纯水
小鼠Fc阻断剂BD BioscienceBDB553142克隆：2.4G2 DF 1:100
MWI VETERINARY PURALUBE VET 软膏FisherNC1886507感染期间的眼部润滑剂
NCI-H292 黏液表皮样癌细胞系 ATCCCRL-1848用于生物膜生长的H292肺上皮细胞系
烟酰胺Fisher18-604-792维生素储液
NK 1.1 AF 700BD Bioscience50-112-4692克隆：PK136 DF 1:200
Oxyrase 液体培养除氧试剂，50 mL/瓶，1瓶/包Fisher50-200-5299用于去除液体培养物中的氧气
4% 甲醛磷酸缓冲液ThermoscientificJ19932-K2
Pivetal 异氟烷 Patterson Veterinary07-893-8440感染期间麻醉用异氟烷 
磷酸氢二钾Fisher ChemicalP288-500起始储液
磷酸二氢钾Fisher ChemicalP285-500起始储液
盐酸吡哆醛 FisherAC352710250维生素储液
盐酸吡哆胺二盐酸盐FisherAAJ6267906Mix I 储液
核黄素FisherAC132350250维生素储液
醋酸钠VWR0530-500G起始储液
叠氮化钠 Fisher BioreagentsBP922I-500用于FACS缓冲液
碳酸氢钠Fisher ChemicalS233-500起始储液及CDM的最终补充物
磷酸氢二钠Fisher ChemicalS374-500起始储液
磷酸二氢钠Fisher ChemicalS369-500起始储液
TCR APC BD Bioscience50-112-8889克隆：GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7BD PharmigenBDB560656克隆：H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific 含庆大霉素的血琼脂FisherR01227含庆大霉素抗生素的血琼脂平板 
Thermo Scientific 经TPCK处理的胰蛋白酶FisherPI20233
盐酸硫胺素FisherAC148991000维生素储液
TIGR4ATCCBAA-334肺炎链球菌菌株
尿嘧啶FisherAC157300250Mix II 储液
Worthington Biochemical Corporation 胶原酶，2型，1 gFisherNC9693955

参考文献

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